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문제 정의
- 친수성 표면을 만드는 여러 방법 중에 알칼리처리된 티타늄에 대해 세포 반응을 알아본 연구는 많지 않다. 따라서 본 연구에서는 기존의 SLA 표면을 높은 친수성을 가지는 표면으로 개질하고자 NaOH에 침적하는 방법이 SLA 표면 형상 및 특성에 어떤 영향을 미치는지 알아보고, 골모유사세포의 증식, 부착 및 분화에 어떤 영향을 미치는지 알아보고자 계획되었다.
- 본 연구를 통하여 기존에 상용화되고 있는 SLA 표면에 NaOH를 처리함으로써 높은 친수성 표면을 만들고 이러한 방법으로 만들어진 친수성 표면이 골모유사세포의 증식, 부착 및 분화에 어떤 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. Machined surface (control group), SLA surface (SLA group), SLA에NaOH 처리한 표면(SLA/NaOH group)의 각 시편을 제조하여 친수성을 극대화한 SLA/NaOH 군의 표면 특성을 평가하기 위해 표면성분 (XPS), 표면거칠기, 표면접촉각 등을 평가하였다.
- 본 연구에서는 Machined surface (대조군), SLA surface (SLA 군), SLA에 NaOH 처리한 표면(SLA/NaOH 군)의 각 시편을 디스크 형태로 제작하여 골모유사세포의 반응을 알아보았다. 쥐 유래MG-63 세포는 골모세포의 특성을 가지고 있다.
제안 방법
- 24-transwell culture plate에 machined surface (control group), SLA surface (SLA group), SLA에 NaOH 처리한 표면(SLA/NaOH group)의 각 시편을 넣고, MG-63 세포를 5×104개의 세포수가 되도록 분주하였다.
- 37℃에서 24시간 동안 각 티타늄 시편은 mounting solution (ProLong® gold antifade reagent with DAPI, Invitrogen)과 함께 microscope slide에 마운팅하였고, confocal laser scanning microscope (LSM700, Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.
- 3일 그리고 7일에 각 군에서 MG-63 세포의 증식을 평가하였다(Fig. 8). 배양7일까지 모든군에서 MG-63 세포의 증식이 점차 증가하였다.
- 41 본 연구에서는 표면에 따른 세포반응을 평가하고자 하였고 골형성기능연구는 아니었으므로 MG-63 세포를 채택하였다.
- 본 연구를 통하여 기존에 상용화되고 있는 SLA 표면에 NaOH를 처리함으로써 높은 친수성 표면을 만들고 이러한 방법으로 만들어진 친수성 표면이 골모유사세포의 증식, 부착 및 분화에 어떤 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. Machined surface (control group), SLA surface (SLA group), SLA에NaOH 처리한 표면(SLA/NaOH group)의 각 시편을 제조하여 친수성을 극대화한 SLA/NaOH 군의 표면 특성을 평가하기 위해 표면성분 (XPS), 표면거칠기, 표면접촉각 등을 평가하였다.
- 시약을 주의하여 96-well plate에 옮기고 microplate reader를 사용하여 흡광도 450 nm에서 값을 측정하였다. 각 그룹에서 3번배양 및 독성 평가를 시행하였다.
- 각 시편 위에서 성장한 골모유사세포의 세포형태를 F-actin 염색으로 평가하였다. 세포를 1×104 세포수가 되도록 분주하여 24시간 동안 배양 후, 각 시편은 PBS (pH 7.
- 각 시편의 거칠기 분석을 위하여 비접촉식 3차원 측정기 (Non-Contact 3D Video Measuring Machine, Video Check IP600, Werth Messtechnik GmbH, Giessen, Hesse, German)를 이용하였고, 표면거칠기(Ra, arithmetic average of the deviation of peaks and valleys on the profile from the mean line)를 측정하였다. 각 그룹의 거칠기는 machined 군에서 0.
- 각 시편의 거칠기 분석을 위하여 비접촉식 3차원 측정기(Non-Contact 3D Video Measuring Machine, Video Check IP600, Werth Messtechnik GmbH, Giessen, Hesse, German)를 이용하였다. 측정조건은scan range 20 ㎛, probe의 주파수는0.
- 각 시편의 표면형상은 주사전자현미경(Hitachi S-4700 SEM, Hitachi, Tokyo, Japan)을 이용하였고 2000배의 확대비율로 각 시편을 관찰하였다.
- 골모유사세포의 초기 분화를 평가하기 위해, 7일과 14일에 ALP 활성도를 평가하였다. Fig.
- 임플란트 표면에 직접 측정팁을 접촉시켜 표면 거칠기를 측정하는 mechanical contact profilometer를 사용 시 임플란트 표면이 손상될 뿐 아니라, 좁고 깊은 틈에는 측정팁의 적용이 제한되므로 정확한 거칠기 값을 측정할 수 없다. 따라서 본 실험에서는 실험 시편을 제작한 후 표면 거칠기를 측정하기 위해 비접촉식 3차원 측정기(NonContact 3D Video Measuring Machine, Video Check IP600, Werth Messtechnik GmbH, Giessen, Hesse, Germany)를 이용하였다. 또한 주사전자현미경사진을 비교하여 표면 처리에 따른 표면구조의 현미경적 변화를 관찰하였다.
- 따라서 본 실험에서는 실험 시편을 제작한 후 표면 거칠기를 측정하기 위해 비접촉식 3차원 측정기(NonContact 3D Video Measuring Machine, Video Check IP600, Werth Messtechnik GmbH, Giessen, Hesse, Germany)를 이용하였다. 또한 주사전자현미경사진을 비교하여 표면 처리에 따른 표면구조의 현미경적 변화를 관찰하였다. SLA 군에서2.
- 모든 시편에 부착된MG-63 세포의 세포형태 및 세포골격을 confocal laser scanning microscope로 관찰하였다(Fig. 6). 이 이미지 들은 SLA 군과 SLA/NaOH 군에서의 MG-63 세포가 machined 군에서 보다 더 많이 부착되어있고 넓게 퍼져있다는 것을 보여준다.
- 두 번째 실험군은 SLA surface와 동일처치 후 5% NaOH로 1시간 처치한 후 세척하였다. 모든 시편의 제작 및 표면처리는 (주)네오바이오텍에서 시행하였고, SLA 표면제작을 위한 일부과정은 공개를 원치 않았다.
- 배양 7일과 14일에 세포를 PBS (pH 7.2)로 세척하고, lysis buffer[10 mM Tris/HCl, (pH 7.2), 1% Triton X-100, 150 nM NaCl, 5 mM Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 2 mM Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 2 μg/mL aprotinin and 2 μg/mL leupeptin]를 첨가하였다.
- 표면처치 후 티타늄시편의 표면구성성분은 X-ray photoelectron spectroscopy (K-Alpha spectrometer, Thermo Electron, Austin, Texas, USA)를 이용하여 분석하였다. 본 연구에서는 칼슘(Ca), 인(P), 탄소(C), 산소(O), 질소(N) 그리고 티타늄(Ti)을 포함한 여섯가지 원소를 측정하여 각 시편의 표면성분변화를 비교평가하였다.
- 세군의 시편에서 XPS분석을 통해 칼슘(Ca), 인(P), 탄소(C), 산소(O), 질소(N) 그리고 티타늄(Ti)의 성분비를 측정하였다. 각 군의 성분비는Table 1과 같다.
- 세포를 각 시편의 표면에 5×103개의 세포수가 되도록 분주하고, 골모유사세포의 초기분화를 평가하기 위해ALP 활성도를 배양 7일과 14일에 측정하였다.
- 5 Hz 이하로 설정하였다. 시편의 표면을 9 등분(상좌, 상중, 상우, 중좌, 중중, 중우, 하좌, 하중, 하우)한 다음 각면에 대하여 표면거칠기(Ra)를 측정하였고 그 평균을 구하였다. 각 군당 9개씩의 시편을 평가하였다.
- 지름 10 mm, 두께 3 mm인 Grade IV 치과용 티타늄(FORT WAYNE METALS, Fort Wayne, Indiana, USA) 디스크를 제작하여 모든 분석과 세포 실험을 진행하였다. 실험군은 모두 3군으로 나누어 실시하였다. 제 1군은 대조군으로 표면처리를 하지 않은 machined surface이다.
- 이번 연구에서는NaOH 처치 후 열처리를 시행하지 않았으며 NaOH 처치시간도 1시간으로 24시간을 처치한 이전 연구보다 짧았다. 이번 연구에서는 NaOH 처치를 통해 표면형상개질을 하고자 한 것이 아니라 단순히 친수성표면만 만들고자 하였기에 그 처리시간을 최소화하였다.
- 절삭유 제거를 위해 에칠알콜을 사용하여 10분간 초음파 세척을 3회 실시한 후 70℃에서 건조하였다. 첫 번째 실험군은 SLA surface로 HA powder를 2 atom의 압력으로 10초 동안 150 mm 거리에서 분사하였다. 그 이후 H2SO4 : HCl : H2O를 3.
- 친수성 평가는 각 시편의 접촉각을 Phoenix 300(SEO, Suwon, Gyeonggi-do, Korea)을 이용하여 측정하였고, 시편당3 μL의 멸균 생리식염수(JW Pharmaceutical, Seoul, Korea)를 시험 용액으로 하였다.
- 표면처치 후 티타늄시편의 표면구성성분은 X-ray photoelectron spectroscopy (K-Alpha spectrometer, Thermo Electron, Austin, Texas, USA)를 이용하여 분석하였다. 본 연구에서는 칼슘(Ca), 인(P), 탄소(C), 산소(O), 질소(N) 그리고 티타늄(Ti)을 포함한 여섯가지 원소를 측정하여 각 시편의 표면성분변화를 비교평가하였다.
대상 데이터
- 100% 습도가 유지되는37℃, 95%의 공기와 5% CO2 조건하에서 MG-63 세포(Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)를 기본 배양하였다. 이 때 사용한 배지는 10% Fetal bovine serum (FBS, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria)과 1% penicillin-streptomycin (PAA)이 첨가된Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)이다.
- 시편의 표면을 9 등분(상좌, 상중, 상우, 중좌, 중중, 중우, 하좌, 하중, 하우)한 다음 각면에 대하여 표면거칠기(Ra)를 측정하였고 그 평균을 구하였다. 각 군당 9개씩의 시편을 평가하였다.
- 모든 in vitro 실험에서, 골모유사세포는 분화유도 배지[50 μg/mL ascorbic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 10 mM β-glycerophosphate (Sigma-Aldrich), 100 nM dexamethasone (Sigma-Aldrich), 10% FBS 그리고 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM]에서 배양하였다.
- 이 때 사용한 배지는 10% Fetal bovine serum (FBS, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria)과 1% penicillin-streptomycin (PAA)이 첨가된Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)이다.
- 지름 10 mm, 두께 3 mm인 Grade IV 치과용 티타늄(FORT WAYNE METALS, Fort Wayne, Indiana, USA) 디스크를 제작하여 모든 분석과 세포 실험을 진행하였다. 실험군은 모두 3군으로 나누어 실시하였다.
데이터처리
- 그룹간의 통계학적비교는 SPSS software (SPSS Inc., Chicago, USA)를 사용하여 one-way ANOVA 통해 이루어졌고, ANOVA 후 다중비교를 시행하였다(P<.05).
이론/모형
- ALP 활성도는p-nitrophenyl phosphate가 p-nitrophenol 변환되는 것을 측정함으로써 결정된다. ELISA analyzer (Sunrise)를 이용하여 405 nm에서 광학밀도를 측정하였다.
- 염색된 세포들은 실온에서 15분 동안 용해시켜 96-well plate로 조심스럽게 옮겼다. enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA) analyzer (Quant, Bio-Tek, Highland Park, USA)를 사용하여 590 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
- 각 시편에서의 세포의 부착을 평가하기 위해 crystal violet assay를 시행하였다. MG-63 세포를 각 시편이 들어있는 24-well plate에 4×104개의 세포수가 되도록 분주하여 3시간 동안 37℃에서 배양하였다.
성능/효과
- Crystal violet assay를 통한 세포부착평가에서도 Fig. 7과 같이 SLA/NaOH 군에서 가장 높은 부착 정도를 보였고(P<.05), Machined 군과 SLA 군에서도 표면거칠기가 높은 SLA군에서 더 높은 세포부착정도를 확인할 수 있었다(P<.05).
- 각 군의 성분비는Table 1과 같다. Machined 군과 비교하여 SLA 군은 탄소 성분이 많이 검출되었고 SLA/NaOH 군은 탄소와 칼슘의 함량이 증대되는 반면 산소와 티타늄의 비율이 감소하는 것을 알 수 있었다.
- 세포 부착 평가에서 SLA/NaOH 군에서 가장 높은 부착 정도를 보였고, 이것은 표면 에너지가 높고 친수성인 표면에서 세포부착이 더 잘 이루어짐을 의미한다. Machined 군과SLA 군에서도 표면거칠기가 높은SLA 군에서 더 높은 세포 부착정도를 확인할 수 있었다. 이것은 큰 입자(250 - 500 μm)를 분사하여 macro-roughness를 부여하고 산부식(HCl/H2SO4)에 의해 microroughness를 부여한 SLA는 중등도의 표면 거칠기(moderately rough surface, Sa 1.
- 2와 같이 실험군에서 거친 면을 확인할 수 있었다. SLA 군과 SLA/NaOH 군은 큰 차이를 보이지 않았으나 SLA/NaOH 군에서 거친면의 peak가 SLA 군보다 더 둥근 형태를 보여 NaOH에 의한 부식을 관찰할 수 있었다.
- 은 여러 다른 표면처리를 한 Ti-6Al-4V 합금, Co-Cr-Mo 합금, alumina, 합성 hydroxyapatite의 젖음성을 연구하였다. detergent-cleaning 후 두 합금의 표면에서 젖음성이 개선되는 효과를 나타냈으며, 그 후 plasma 처리를 한 것이 가장 큰 젖음성 개선 효과를 나타냈다. MacDonald 등30은 Ti-6Al-4V 합금을 열처리하거나 과산화수소 처리시 아무런 처치를 하지 않은 합금보다 친수성이 증가한다고 보고하였다.
- 각 시편을 5개씩 측정하여 구한 접촉각의 평균(표준편차)는 machined 군이 113.44 ± 9.85 도, SLA 군이 120.66 ± 6.71 도, SLA/NaOH 군이5.59 ±1.13 도이었다.
- 4에서처럼, machined 군, SLA 군 그리고 SLA/NaOH 군에서의 세포의 생활력이 24시간동안 간접법에 의해 평가되었다. 대조군과 비교할 때 모든 군에서 세포생활력이98% 이상 유지되었다. 모든 군들은MG-63 세포에 대해 세포독성을 가지지 않았다.
- 본 실험에서 배양7일까지 모든군에서 MG-63 세포의 증식이 점차 증가하였다. 모든 군에서 3, 7일에 세포의 증식에서 유의할 만한 차이가 보였고 SLA/NaOH 군에서 가장 높은 세포증식을 보였다. 골모세포의 초기분화를 평가하기 위한 ALP 활성도 평가에서 7일에서는 세 군 사이에 차이가 없지만, 14일에는 SLA/NaOH 군이 유의성 있는 증대를 보였다(P<.
- 배양7일까지 모든군에서 MG-63 세포의 증식이 점차 증가하였다. 모든군에서 3일과 7일에 세포의 증식에서 유의할 만한 차이가 보였고 SLA/NaOH 군에서 가장 높은 세포 증식을 보였다.
- 본 실험에서 배양7일까지 모든군에서 MG-63 세포의 증식이 점차 증가하였다. 모든 군에서 3, 7일에 세포의 증식에서 유의할 만한 차이가 보였고 SLA/NaOH 군에서 가장 높은 세포증식을 보였다.
- 을 방출하고Ti-OH를 형성하면서 산소의 비율이 증가한다 하였다. 본 실험에서는 Machined 군과 비교하여SLA/NaOH 군은 산소와 티타늄의 비율이 감소하였고 탄소함량은 증가하였다. 산소와 티타늄 비율의 감소는 임플란트표면의 산화막이 감소하고 나트륨티탄산염이 형성된 결과로 생각되고 탄소의 증가는 임플란트 표면 처리과정에서 높은 압력과 상승된 온도로 인해 대기중에 존재하는 다량의 탄소가 표면에 흡착되었기 때문인 것으로 생각된다.
- 본 실험의 결과를 보면SLA 군과 SLA/NaOH 군에서Machined 군에서보다 MG-63 세포가 더 많이 부착되어있고 넓게 퍼져있다는 것을 보여준다. SLA 군과 SLA/NaOH 군에서 MG-63 세포의 형태는 다각형의 형태를 가지고 있으며, 두 군 간의 차이는 별로 없어 보인다.
- 이런 흡착량은 정적접촉각측정방법인 Sessile drop method로 측정가능하다. 본 연구의 결과에서 SLA 표면에 NaOH 처치를 통해 얻은 SLA/NaOH 군은 완전한 친수성표면이 되었음을 알 수 있었고, 접촉각을 구하긴 하였지만 그 측정이 어려울 정도로 표면 전체로 물이 퍼져 정확한 측정은 불가능하였다.
- 세포 부착 평가에서 SLA/NaOH 군에서 가장 높은 부착 정도를 보였고, 이것은 표면 에너지가 높고 친수성인 표면에서 세포부착이 더 잘 이루어짐을 의미한다. Machined 군과SLA 군에서도 표면거칠기가 높은SLA 군에서 더 높은 세포 부착정도를 확인할 수 있었다.
- Kokubo 등23의 실험결과와의 차이를 보이는 것은 표면 개질 방법의 차이로 기인된 것이라 생각된다. 이번 연구에서는NaOH 처치 후 열처리를 시행하지 않았으며 NaOH 처치시간도 1시간으로 24시간을 처치한 이전 연구보다 짧았다. 이번 연구에서는 NaOH 처치를 통해 표면형상개질을 하고자 한 것이 아니라 단순히 친수성표면만 만들고자 하였기에 그 처리시간을 최소화하였다.
후속연구
- 친수성 표면이 골유착에 긍정적이라는 연구들이 많이 있어 왔으나 기존의 SLA 표면에 NaOH 염기 처리를 통한 수화 방식에 대해 연구된 바는 거의 없었다. 본 연구를 통하여 이런 수화 방식을 통해 SLA 표면을 변형시킴으로서 세포의 부착, 증식 및 분화를 더욱 촉진시켜 임플란트의 골유착을 증진시킬 수 있는 가능성을 확인하였으며 향후 이와 같은 표면을 개발하는 기초자료로 활용할 수 있으리라 사료된다.
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