[논문]택사(澤瀉)가 유리지방산으로 유발된 HepG2 cell의 lipoapoptosis에 미치는 영향

김은영; 이장훈

[국내논문] 택사(澤瀉)가 유리지방산으로 유발된 HepG2 cell의 lipoapoptosis에 미치는 영향
The Effect of Alisma orientale Extract on Free Fatty Acid-induced Lipoapoptosis in HepG2 Cells 원문보기

대한한방내과학회지 = The journal of internal Korean medicine, v.35 no.2, 2014년, pp.184 - 194

김은영 (경희대학교 한의과대학 간계내과학교실) , 이장훈 (경희대학교 한의과대학 간계내과학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : This study was designed to investigate the effect on lipoapoptosis of Alisma orientale extract against free fatty acid-induced cellular injury. Methods : HepG2 cells were used in an vitro model. HepG2 cells were treated with free fatty acids to generate a cellular model of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). Using this cellular model, the anti-apoptotic effect and reducing steatosis of Alisma orientale extract against free fatty acid-induced cellular injury was evaluated by measuring steatosis and apoptosis. Results : Alisma orientale extract significantly attenuated free fatty acid-induced intracellular steatosis. Alisma orientale extract inhibited free fatty acid-mediated activation of pJNK, PUMA, BAX, caspase-3, and -9, and apoptotic kinases that are correlated with NAFLD. Alisma orientale extract also promoted Bcl-2, a anti-apoptotic protein. Conclusions : From the above, the Alisma orientale extract decreased the hepatocyte steatosis and showed the hepatocelluar protective effect by the regulation of apoptosis-related protein. It proposes the possibility of Alisma orientale extract to the treatment of nonalcoholic fatty liver disease in clinics.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

이에 저자는 먼저 oleic acid 및 palmitic acid를 혼합한 유리지방산과 에탄올 80%로 추출된 택사를 각각 처리한 HepG2 cell의 MTT assay를 통해 세포 활성도 변화를 관찰하고, 이후 HepG2 cell에 유리지방산을 처리하여 lipoapoptosis 세포 모델을 설정하고 택사 에탄올 추출물을 투여하여 Oil-Red-O staining, real-time PCR, western blot 등의 방법으로 세포내의 지방 축적 변화와 세포사멸과 관련되는 JNK, pJNK, PUMA, Bax, Bcl-2 및 caspase의 활성 변화를 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
본 연구는 택사가 유리지방산으로 유발된 HepG2 cell의 lipoapoptosis에 미치는 영향을 알아보기 위해 시행되었다. 이를 위해 우선 택사가 HepG2 cell의 활성도에 미치는 영향을 알아보았으며, 세포내의 지방 축적 및 세포사멸 관련 단백질들의 활성 정도를 관찰하였다.

제안 방법

유리지방산 1 mM(0.66 mM oleic acid+0.33 mM palmitic acid)의 세포독성을 확인하기 위하여, 시료들을 1시간, 24시간으로 나누어 처리한 후, MTT assay를 시행하였다. 정상 대조군과 비교 관찰한 결과 1시간 후에는 cell viability가 100%에서 95%로 큰 변화가 없었으나 24시간 경과 후에는 43%로 감소되는 것이 관찰되었다(Fig.
비알코올지방간염 환자들에게서 많이 검출되는 세포사멸 관련 인자인 PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis)의¹² 활성 변화를 real-time PCR을 통해 살펴보았다. PUMA의 mRNA 변화량은 정상 대조군에 비해 유리지방산 1 mM을 투여한 경우에서 약 1.
택사가 비알코올 지방간질환에 미치는 영향을 살펴보기 위해, 먼저 유리지방산 및 택사 추출물 각각의 MTT assay를 통해 세포활성도를 측정하였고, 이후 HepG2 cell에 유리지방산을 처리하여 lipoapoptosis 를 유도한 뒤 택사 추출물을 투여하여 Oil-Red-O staining, real-time PCR, western blot 등의 방법으로 세포내의 지방 축적 변화와 세포사멸과 관련되는 JNK, pJNK, PUMA, Bax, Bcl-2 및 caspase의 활성 변화를 측정한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.

대상 데이터

본 실험에 사용한 택사(Alisma orientale, AO)는 경희의료원 한방병원 약제과(경희한약, 전남 순천, Korea)에서 엄선한 것을 구입하였으며, 용량은 100g을 사용하였다. 택사의 추출은 에탄올을 이용하였다.
HepG2 cell은 Korean Cell Line Bank(KCLB, Korea)에서 구입하였다. HepG2 cell을 배양액을 이용하여 5%로 이산화탄소가 공급되는 배양기에서 37 ℃로 배양하였다.

데이터처리

실험 결과는 각 실험에 대한 평균값±S.E.M.로 표기 하였고, 각 그룹간의 차이를 결정하기 위한 통계 분석은 ONE-WAY ANOVA Test를 이용하였다. 모든 통계분석은 GRAPH Prism 5를 이용해서 수행되었다.

이론/모형

HepG2 cell의 지방축적은 Oil-Red-O staining을 이용하여 측정되었다. 세포를 10% formaldehyde로 1시간동안 고정시킨 후 60% isopropanol액으로 세척하였다.
)을 이용하여 single stranded cDNA를 제조하였다. 발현되는 DNA에 유전자를 특이적으로 증폭하는 PUMA primers를 넣어 real-time PCR 방법을 이용하여 측정하였다. Internal control로는 GAPDH를 사용하였다.

성능/효과

1A). 그리고 택사 추출물이 cell viability에 미치는 영향을 알아보기 위해 HepG2 cell에 택사를 농도별로 처리한 후 MTT assay를 시행한 결과 100 μg/ml에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았고, 500 μg/ml과 1000 μg/ml에서는 cell viability가 유의하게 감소하였다(Fig. 1B).
1. MTT assay 결과 유리지방산을 24시간 처리한 경우에 cell viability가 유의성 있게 감소하였으며, 택사 추출물 100 μg/ml을 24시간 처리한 경우에는 유의한 변화가 나타나지 않았다.
2. 택사 추출물은 Oil-Red-O staining 결과 대조군에 비해 세포내 지방 축적정도를 유의성 있게 감소시켰다.
3. 택사 추출물은 pJNK를 대조군에 비해 현저하게 감소시켰다.
4. 택사 추출물은 PUMA의 mRNA 및 protein 모두에서 그 양을 대조군에 비해 유의성 있게 감소시켰다.
5. 택사 추출물은 Bax를 대조군에 비해 현저하게 감소시켰다.
6. 택사 추출물은 Bcl-2를 대조군에 비해 현저하게 증가시켰다.
7. 택사 추출물은 caspase-3,-9의 cleaved form을 대조군에 비해 현저하게 감소시켰다.
이상의 실험결과에서 택사 에탄올 추출물이 간세포의 지방증을 감소시키며, 세포사멸에 관여하는 관련 인자를 조절하여 lipoapoptosis를 억제하는 효능이 있음을 알 수 있었다. 이는 택사의 단순 지방 증에서 간손상으로 진행하는 과정을 억제하는 효과를 시사하는 것으로, 이와 관련하여 향후 택사의 치료기전에 대한 보다 심도 있는 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.

후속연구

이를 통해 택사 추출물이 단순 지방증 단계부터 세포손상으로 인한 다음 단계로의 진행 모두 개선시키는 효과를 나타내었다. 향후 기타 간 손상에 미치는 효과에 대한 다양한 연구가 지속적으로 이루어질 필요가 있을 것으로 사료된다.
이상의 실험결과에서 택사 에탄올 추출물이 간세포의 지방증을 감소시키며, 세포사멸에 관여하는 관련 인자를 조절하여 lipoapoptosis를 억제하는 효능이 있음을 알 수 있었다. 이는 택사의 단순 지방 증에서 간손상으로 진행하는 과정을 억제하는 효과를 시사하는 것으로, 이와 관련하여 향후 택사의 치료기전에 대한 보다 심도 있는 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	국내에서 비알코올 지방간질환의 유병률은?	국내에서 비알코올 지방간질환의 유병률은 16~33%이며3 이중 10% 정도는 염증을 동반하는 지방간염이고 지방간염의 약 20~30%에서 간경변 및 간암으로 진행할 수 있다4,5. 비알코올 지방간질환은 최근 비만 및 당뇨 인구의 증가와 함께 유병률이 급격하게 증가하고 있으며 심혈관계 질환, 당뇨 등의 발생에 있어 독립적인 위험 인자로 작용할 수 있음이 밝혀져 그 중요성이 증가하고 있다6.
	낮은 Bcl-2와 높은 Bax level에서 세포의 세포사멸이 일어나는 이유는?	Bcl-2 family에 속하는 관련 단백인 Bcl-2, Bax 등의 발현은 세포가 세포사멸로 진행시 감수성을 결정한다27. Bcl-2 Family중 Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, A1은 세포사멸을 억제하고, Bcl-Xs, Bax, Bak, Bad, Bid는 세포사멸을 증진시킨다. Bcl-2와 Bax는 서로 상대적인 단백질로 대부분의 경우 heterodimer의 형태로 존재한다고 알려졌다. 따라서 낮은 Bcl-2와 높은 Bax level에서 세포의 세포사멸이 일어나며, 반면에 세포사멸이 일어나지 않는 세포에서는 높은 Bcl-2와 낮은 Bax level이 나타남을 발견하였다28.
	비알코올 지방간질환이란?	비알코올 지방간질환(Nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 알코올, 약물, 동반된 다른 간질환 등이 없으면서 간 내 지방침착의 소견을 보이는 질환으로1, 단순 지방증에서부터 지방간염, 간섬유화 및 간경변에 이르는 다양한 스펙트럼을 포함한다2.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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