Poly-pharmacy has been on the rise because of aging of population and chronic disease. Most of drug metabolism happens in the liver by CYP isozymes and the metabolism by CYP450 enzymes. The Cytochrome P450 (CYP) is a superfamily of enzymes that catalyzes the oxidations of many endogenous and exogeno...
Poly-pharmacy has been on the rise because of aging of population and chronic disease. Most of drug metabolism happens in the liver by CYP isozymes and the metabolism by CYP450 enzymes. The Cytochrome P450 (CYP) is a superfamily of enzymes that catalyzes the oxidations of many endogenous and exogenous compounds. Primary human Hepatocytes (HH) are considered as the gold standard model for In vitro drug interaction studies. However, there are several limitations (cost, limited life span) for using HH cells. HepaRG cells are being used as a possible alternative. HepaRG cells were cultured in William E medium containing the positive control inducers (1A2: 10, 25, 50 ${\mu}M$ omeprazole, 2C9 and 2C19: 10 ${\mu}M$ rifampin, 3A4: 10, 25, 50 ${\mu}M$ rifampin) at $37^{\circ}C$, 5 % $CO_2$ in a humidified atmosphere. This study was to evaluate the induction of CYP isozymes (1A2, 2C9, 2C19 and 3A4) using LC-MS/MS. We evaluated the potential induction ability of Bosentan, as a drug of pulmonary artery hypertension, in HepaRG cells. For reference, dose of the Bosentan is determined to the basis of the $C_{max}$ (835 mg/ml) value. The enzyme activity demonstrated that CYP2C9 and 3A4 were induced up to 20 times by Bosentan. Like as In vivo, the enzyme activity of CYP2C9 and CYP3A4 is significantly induced in a dose-dependent by Bosentan.
Poly-pharmacy has been on the rise because of aging of population and chronic disease. Most of drug metabolism happens in the liver by CYP isozymes and the metabolism by CYP450 enzymes. The Cytochrome P450 (CYP) is a superfamily of enzymes that catalyzes the oxidations of many endogenous and exogenous compounds. Primary human Hepatocytes (HH) are considered as the gold standard model for In vitro drug interaction studies. However, there are several limitations (cost, limited life span) for using HH cells. HepaRG cells are being used as a possible alternative. HepaRG cells were cultured in William E medium containing the positive control inducers (1A2: 10, 25, 50 ${\mu}M$ omeprazole, 2C9 and 2C19: 10 ${\mu}M$ rifampin, 3A4: 10, 25, 50 ${\mu}M$ rifampin) at $37^{\circ}C$, 5 % $CO_2$ in a humidified atmosphere. This study was to evaluate the induction of CYP isozymes (1A2, 2C9, 2C19 and 3A4) using LC-MS/MS. We evaluated the potential induction ability of Bosentan, as a drug of pulmonary artery hypertension, in HepaRG cells. For reference, dose of the Bosentan is determined to the basis of the $C_{max}$ (835 mg/ml) value. The enzyme activity demonstrated that CYP2C9 and 3A4 were induced up to 20 times by Bosentan. Like as In vivo, the enzyme activity of CYP2C9 and CYP3A4 is significantly induced in a dose-dependent by Bosentan.
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문제 정의
HepaRG 세포는 사람일차간세포와 비교하였을 때, 간 기능과 간 특이적 유전자의 발현 수준이 비슷하게 유지되고 있는 것으로 보고되고 있다.11-16) 따라서 사람일차간세포와 유사하면서 가격이 저렴하고, 세포의 생명주기가 긴 HepaRG 세포를 이용하여 대사효소 활성 시험법을 확립하고, In vitro에서 약물상호작용 평가로 신약개발의 기간 단축 및 조기 약물상호작용 평가로 인하여 국내 의약산업 발전에 기여하고자 한다.
따라서 본 연구에서는 시험관계 약물대사 연구에서 많이 사용되는 사람일차간세포와 거의 동등한 수준의 활성을 나타내는 분화된 Human Hepatocellular carcinoma cell line인 HepaRG 세포주를 이용하여 CYP1A2와 CYP3A4 뿐 아니라 CYP2C9와 CYP2C19를 추가로 확인하였다. 또한, Bosentan에 의한 약물대사효소의 유도능을 확립하고자 하였다.
제안 방법
따라서, 본 연구에서도 시험약물의 최고혈중농도(Cmax)를 문헌조사를 통해 835 ng/ml임을 확인하고, 최고혈중농도의 1/10, 1, 10배를 시험약물 처리농도로 설정하였다.19) 선행연구를 통해 설정한 시험방법을 바탕으로 HepaRG 세포를 이용하여 진행하였다. Cell을 seeding하여 안정화된 HepaRG 세포에 시험약물을 83.
19) 선행연구를 통해 설정한 시험방법을 바탕으로 HepaRG 세포를 이용하여 진행하였다. Cell을 seeding하여 안정화된 HepaRG 세포에 시험약물을 83.5 ng/ml 835 ng/ml 8,350 ng/ml 농도로 48시간 처리하였으며, 24시간마다 약물 포함 배지를 교환하였다.
HepaRG 세포에 1A2 표준 유도약물인 omeprazole과 2C9, 2C19, 3A4 표준 유도약물인 rifampin을 권장농도로 48시간 처리하여 각 CYP450 효소군에 해당하는 대사체를 분석하였다.4)
HepaRG 세포에 표준 유도약물인 omeprazole과 rifampin을 48시간 처리하고, LC-MS/MS를 이용하여 선정한 4종(CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4)의 효소군에서 대사체의 유도능을 분석하였다. 그 결과, CYP1A2 효소군은 표준유도약물을 처리하였을 때, 9배 이상의 유도능을 나타내었다.
LCMS/MS를 이용해 효소활성 측정을 위하여, CYP3A4의 기질인 testosterone 처리 후 얻은 대사체인 6-β-hydroxytestosterone은 305.04 m/z에서 transition되는 287.07 m/z로, 다른 CYP3A4의 기질인 midazolam을 처리 후 얻은 대사체인 1'-hydroxymidazolam은 342.24 m/z에서 transition되는 203.15 m/z로, CYP2C9의 기질인 tolbutamide의 처리 후 대사체인 4-hydroxytolbutamide는 287.05 m/z에서 transition되는 170.93 m/z로, CYP2C19의 기질인 S-mephenytoin의 대사체인 4'-hydroxymephenytoin은 235.03 m/z에서 transition되는 150.00 m/z로, CYP1A2의 기질인 phenacetin의 대사체인 4-acetamidophenol은 151.94 m/z에서 transition되는 109.94 m/z로 조건을 잡아, Xevo® TQ MS의 operating software인 MassLynx® manual tuning을 이용하여 MRM(multiple reaction monitoring)모드를 사용하였고(Table II), 자동 tuning 옵션인 Intellistart®를 이용하여 설정한 조건이 분석조건인 것을 확인한 후 분석을 진행하였다(Fig. 1).17,18)
대사체 분석은 LC-MS/MS(Agilent 1260 Infinity LC system coupled triple quad 6460, Santa clara, USA)과 Accuity® BEH C18 column(2.1×100 mm, 1.7 μm, Agilent, Santa clara, USA)를 사용하였고, Quantitative analysis softeware(version B.06.00, Agilent, USA)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
따라서 본 연구에서는 시험관계 약물대사 연구에서 많이 사용되는 사람일차간세포와 거의 동등한 수준의 활성을 나타내는 분화된 Human Hepatocellular carcinoma cell line인 HepaRG 세포주를 이용하여 CYP1A2와 CYP3A4 뿐 아니라 CYP2C9와 CYP2C19를 추가로 확인하였다. 또한, Bosentan에 의한 약물대사효소의 유도능을 확립하고자 하였다.
선정된 약물의 세포에 대한 처리농도는 FDA guidance에서 권고한 내용에 따르면, 시험약물을 3가지 농도로 처리하며 적어도 한가지 농도는 평균 혈중 약물농도보다 많은 농도를 포함하도록 명시되어있다. 따라서, 본 연구에서도 시험약물의 최고혈중농도(Cmax)를 문헌조사를 통해 835 ng/ml임을 확인하고, 최고혈중농도의 1/10, 1, 10배를 시험약물 처리농도로 설정하였다.19) 선행연구를 통해 설정한 시험방법을 바탕으로 HepaRG 세포를 이용하여 진행하였다.
이번 실험은 시험관계 약물대사연구에서 사람일차간세포와 거의 동등한 수준의 활성을 나타내는 분화된 Human Hepatocellular carcinoma cell line인 HepaRG 세포주를 이용하여 시험약물의 약물대사 관련 유전자 및 단백질의 기초발현 수준을 평가하고, LC-MS/MS를 이용한 질량분석 방법으로 약물대사효소의 활성을 측정하였다. HepaRG 세포는 사람일차간세포와 비교하였을 때, 간 기능과 간 특이적 유전자의 발현 수준이 비슷하게 유지되고 있는 것으로 보고되고 있다.
대상 데이터
Cytochrome P450의 동질효소인 CYP2C9와 CYP3A4를 유도하나, In vitro 실험에 약물상호작용이 잘 알려지지 않은 약물인 Bosentan(폐동맥성 고혈압치료제)을 시험약물로 선정하였다. 선정된 약물의 세포에 대한 처리농도는 FDA guidance에서 권고한 내용에 따르면, 시험약물을 3가지 농도로 처리하며 적어도 한가지 농도는 평균 혈중 약물농도보다 많은 농도를 포함하도록 명시되어있다.
HepaRG 세포 배양은 General purpose supplement가 포함된 William's medium E 배지를 사용하고, 약물 유도시에는 Serum Free supplement가 포함된 William's medium E 배지를 사용한다.
MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. LC-MS 분석에 필요한 용매 제조를 위한 Methanol, Acetonitrile, Formic acid는 Sigma-Aldrich(Louis. MO, USA)에서 구입하였다. 대사체 분석은 LC-MS/MS(Agilent 1260 Infinity LC system coupled triple quad 6460, Santa clara, USA)과 Accuity® BEH C18 column(2.
또한 효소활성측정에 필요한 단백질 농도 측정은 SMART BCA protein assay kit(INTRON, 한국)를 이용하였다. 검량선 작성을 위한 표준물질인 S-Mephenytoin, 1-Hydroxymidazolam은 BD(Becton, USA)에 4-Acetamidopheonol, Diphenhydramide hydrochloride, 4-Hydroxytolbutamide은 Sigma-Aldrich(Louis. MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. LC-MS 분석에 필요한 용매 제조를 위한 Methanol, Acetonitrile, Formic acid는 Sigma-Aldrich(Louis.
세포배양에 필요한 세포주(HepaRG), William's E Medium, no Phenol Red, GlutaMAXTM, HepaRGTM Serum-free Induction Medium supplement, 5X, HepaRGTM General Purpose Medium supplement, 5X, Collagen, Coated Plate 24 well은 Gibco(Grand Island, USA)에서 구입하여 사용하였다.
유도약물로 선정한 rifampin과 omeprazole은 DMSO를 이용하여 각 50 mM, 10 mM의 stock solution을 만들어 약물처리 전배지에 희석하여 사용하였다.
General Purpose Medium supplement, 5X, Collagen, Coated Plate 24 well은 Gibco(Grand Island, USA)에서 구입하여 사용하였다. 유도약물인 Omeprazole, Rifampin은 Sigma-Aldrich(Louis. MO, USA)에서 Bosentan monohydrate은 ZACH에서 구입하여 사용하였고 기질인 Phenacetin, Tolbutamide는 Sigma-Aldrich(Louis. MO, USA)로부터 Testosterone과 Midazolam은 각각 ACROS(New Jersey, USA), BD(Becton, USA)에서 구입하였다. 또한 효소활성측정에 필요한 단백질 농도 측정은 SMART BCA protein assay kit(INTRON, 한국)를 이용하였다.
이론/모형
MO, USA)로부터 Testosterone과 Midazolam은 각각 ACROS(New Jersey, USA), BD(Becton, USA)에서 구입하였다. 또한 효소활성측정에 필요한 단백질 농도 측정은 SMART BCA protein assay kit(INTRON, 한국)를 이용하였다. 검량선 작성을 위한 표준물질인 S-Mephenytoin, 1-Hydroxymidazolam은 BD(Becton, USA)에 4-Acetamidopheonol, Diphenhydramide hydrochloride, 4-Hydroxytolbutamide은 Sigma-Aldrich(Louis.
성능/효과
CYP1A2 효소군에 대해서는 omeprazole 50 μM 처리하였을 경우 9.6배로 가장 높은 유도능이 나타났고, CYP2C9는 10 μM에서 17배 증가하는 것으로 나타났다.
HepaRG 세포를 이용하여, 폐동맥성 고혈압치료제로서, 약물상호작용이 알려지지 않은 Bosentan의 약물유도를 평가한 결과, Bosentan은 Cytochrome P450의 동질효소인 CYP2C9와 CYP3A4의 유도작용을 나타냄을 확인한 약물이다.19)
LC-MS/MS를 이용한 효소활성도를 측정한 결과, 모든 CYP450 효소군의 대사체의 검출이 가능하였으나, 기존 문헌조사를 통해 알려진 바와 같이 CYP2C9와 CYP3A4를 유의적으로 유도함을 확인하였다. CYP2C9의 경우, 약물처리농도에 상관없이 비슷한 대조군 대비 약 4배의 유도능을 나타냈으며, CYP3A4는 기질을 midazolam으로 처리하였을 때, 농도의존적으로 증가하는 양상을 띄었다.
과학기술이 발달함에 따라, 이상반응을 유발하고 각 개인 간의 약물반응의 차이가 약물대사 과정의 제I상 반응의 대부분을 차지하는 약물대사효소의 유전적 발현의 다형성에 기인함을 확인하였으며, 따라서 CYP450 효소의 유전적 다형성을 이해하는 것은 약물개발 과정에서의 약물평가에 기초가 된다고 할 수 있다.6) 또한 신약개발 과정에서 초기 약물상호작용 연구를 진행할 때에는 어떤 CYP450 효소의 약물상호작용을 주로 평가할 것인가에 관한 결정이 매우 중요하다.
관상동맥질환치료제 및 고지혈증 치료제로 사용되는 아토르바스타틴(Atorvastatin), 프라바스타틴(Pravastatin), 심바스타틴(Simvastatin) 경우 사람일차간세포에서 LC-MS/MS를 이용해 enzyme activity를 측정한 결과 아토르바스타틴과 심바스타틴은 약물대사효소인 CYP1A2(substrate : Phenacetin, metabolite : Acetaminophen 152 → 110 m/z), CYP2B6(substrate : Bupropion, metabolite : HydroxyBupropion 256 → 238 m/z), CYP2C19(substrate : S-Mephenytoin, metabolite : 4-Hydroxymephenytoin 235 → 150 m/z), CYP3A4는(substrate : Atorvastatin, metabolite : o-Hydroxyatorvastatin 575 → 440 m/z) 기질처리하여 얻은 약물대사체를 미량분석한 결과 FDA가이던스 기준인 fold induction이 2배 이상으로 결과가 측정되어 약물에 대한 대사효소의 유도능을 확인할 수 있었고, 프라바스타틴의 경우 fold induction이 2배 이하의 결과를 나타내어 약물에 대한 대사효소(CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4)의 유도능이 미미한한 것으로 평가되었다.
HepaRG 세포에 표준 유도약물인 omeprazole과 rifampin을 48시간 처리하고, LC-MS/MS를 이용하여 선정한 4종(CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4)의 효소군에서 대사체의 유도능을 분석하였다. 그 결과, CYP1A2 효소군은 표준유도약물을 처리하였을 때, 9배 이상의 유도능을 나타내었다. 그리고 CYP2C9/192가지 CYP450 효소능에 대해서는 rifampin 10 μM을 48시간 약물을 처리하였을 때, 각 17배, 4배의 유도능을 나타내었으며, CYP3A4의 효소군에서는 약물 농도에 의존적으로 유도되는 양상을 나타내며, 모두 3배 이상의 효소능을 나타내었다.
그리고 CYP2C9/192가지 CYP450 효소능에 대해서는 rifampin 10 μM을 48시간 약물을 처리하였을 때, 각 17배, 4배의 유도능을 나타내었으며, CYP3A4의 효소군에서는 약물 농도에 의존적으로 유도되는 양상을 나타내며, 모두 3배 이상의 효소능을 나타내었다.
20,21) 본 실험에서도 기질에 따라 enzyme activity의 다른 양상을 확인하였다. 따라서 본 문헌에서는 In vitro 실험에서 Bosentan에 의해 CYP2C9와 CYP3A4가 In vivo 실험에서와 같이 효소 활성도가 증가하는 것을 확인하였다.
효소활성도를 측정한 결과, 모든 CYP450 효소군의 대사체의 검출이 가능하였다(Fig. 3). CYP2C9의 경우, 약물처리농도에 상관없이 비슷한 대조군 대비 약 4배의 유도능을 나타내었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
간에서의 약물대사 중 제I상 반응에 관여하는 효소에는 무엇이 있는가?
체내에서 약물의 대사는 일부 약물의 경우, 혈장, 폐, 장관에서 일어나기도 하지만 대부분의 약물은 간에서 주로 일어나며, 간에서의 약물대사는 크게 제I상 반응(Phase I reaction)과 제II상 반응(Phase II reaction)으로 나누어진다. 약물의 대사에 관여하는 인자 중에 CYP450 효소는 제I상 반응의 약 70~80%를 담당하여 다수의 내인성 및 외인성 약물의 대사과정에 관여하지만, 종 간, 개인 간의 약물의 흡수·대사·분포·배설 과정에 관련한 유전자의 다양성으로 인하여 약물의 동태학적 및 역학적 기전의 차이가 큰 것으로 알려져 있다.4,5)
약물상호작용은 무엇인가?
약물상호작용(Drug interaction)은 두 개 이상의 약물을 동시에 복용하면서 발생하는 결과로써, 하나의 약물에서 발생되는 약리효과가 증가하거나, 감소되는 결과를 초래하며, 안전한 약물투여를 위해서는 반드시 약물상호작용의 발생 위험도에 대해서 사전에 고려하여 약물요법을 실시해야 한다. 약물상호작용은 고령 환자 또는 여러 가지 질환을 가진 환자와 같은 경우에, 질병의 치료를 위해서 복용하는 약물의 수가 증가할수록 발생할 위험이 커진다.
현대사회에서 약물상호작용 발생 가능성이 큰 이유는?
약물상호작용은 고령 환자 또는 여러 가지 질환을 가진 환자와 같은 경우에, 질병의 치료를 위해서 복용하는 약물의 수가 증가할수록 발생할 위험이 커진다. 현대사회에는 의료기술의 발달로 인하여 각종 약물요법에 의해서 만성질환을 관리하여 생명을 연장하고 있기 때문에 한 환자가 사용하는 약물의 수가 증가하고 있어 약물상호작용 발생 가능성이 크다.1-3)
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