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문제 정의
- 방풍 추출물이 피부미백 및 탄력유지에 미치는 효과를 알아보기 위하여 흑색종 세포주의 멜라닌 생성 억제와 그 기전, 그리고 엘라스타제 활성 억제에 미치는 영향을 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 이에 저자는 방풍이 祛風止痒 효능이 있어 각종 피부질환에 사용7)하고 있고, 또한 방풍통성산이 미백효과가 있다는 보고19)가 있으며, 중의학에서도 미용에 활용20)하고 있는 점에 착안하여 흑색종 세포주를 이용하여 피부미백과 탄력에 미치는 방풍의 효과를 알아보고자 세포 증식율에 미치는 효과, 멜라닌 생성 및 그에 관여하는 타이로시네이즈 활성 억제 효과 그리고 엘라스틴과 관련하여 엘라스타제의 활성 억제 효과를 관찰한 결과 유의성을 얻었기에 보고하는 바이다.
- 한편, 방풍 추출물에 의한 흑색종 세포의 세포사멸이 30%정도로 나타났지만 멜라닌 생성 저해는 10% 정도밖에 감소되지 않아 본 저자는 방풍 추출물에 의한 멜라닌 생성 저해가 타이로 시네이즈와 관련이 있는지에 대하여 알아보고자 하였다.
제안 방법
- B16F10 세포를 배양하여 24 well plate에 각 well당 1×105 cell/well의 농도로 분주한 후, 부착 및 안정화를 위해 24 시간 방치한 다음 SRE를 각 농도별 (62.5 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖, 1000 ㎍/㎖)로 처리한 후 5% CO2 incubator에서 37℃를 유지하면서 24 시간 배양하였다.
- SRE가 멜라닌 생성에 미치는 영향은 Hosei 등22)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, B16F10 세포를 배양하여 24 well plate 에 각 well당 5×104 cell/well의 농도로 분주하고, 부착 및 안정화를 위하여 24 시간을 배양하였다.
- 현탁된 세포를 vortexing한후 1000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 상층액을 활성 측정 효소액으로 이용하였다. Tyrosinase 활성 저해율을 측정하기 위하여 96 well plate에 효소액 100 ㎕를 넣고, 기질인 L-DOPA (2 ㎎/㎖) 200 ㎕를 첨가한 후, 5% CO2 incubator에서 37℃를 유지하면서 1시간 동안 반응을 진행시킨 다음 Microplate Reader(Bio-rad, USA)를 이용하여 475 ㎚에서 측정하였다. Tyrosinase의 활성 저해율은 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 계산하였다24).
- Tyrosinase 활성 저해율을 측정하기 위하여 96 well plate에 효소액 100 ㎕를 넣고, 기질인 L-DOPA (2 ㎎/㎖) 200 ㎕를 첨가한 후, 5% CO2 incubator에서 37℃를 유지하면서 1시간 동안 반응을 진행시킨 다음 Microplate Reader(Bio-rad, USA)를 이용하여 475 ㎚에서 측정하였다. Tyrosinase의 활성 저해율은 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 계산하였다24).
- 그 후 MTT 시약을 처리한 다음 MTT 시약이 생존 세포의 효소작용에 의해 환원되도록 2∼4 시간을 배양한 다음 배양액을 제거하고 각 well에 생성된 formazan 결정을 DMSO를 넣어 녹인 후 Microplate Reader(Bio-rad, USA)를 이용하여 475 ㎚에서 측정하였다.
- 이에 저자는 악성 흑색종 세포주인 B16F10 세포를 이용하여 방풍 추출물이 세포 증식율에 미치는 효과, 멜라닌 생성 억제 효과, 멜라닌 생성에 관련된 타이로시네이즈 활성 저해 효과, 피부 탄력 및 주름살 제거에 관여하는 엘라스틴을 억제하는 엘라스타제의 활성 저해 효과 등을 관찰하였다.
- 5∼1,000 ㎍/㎖)로 희석된 SRE 추출물 300 ㎕를 넣어준 다음 1 ㎍/㎖로 희석된 porcine pancreatic elastase 제 Ⅰ형과 Ⅳ형에 각각 40 ㎕와 60 ㎕를 넣어주고, 실온에 10 분간 방치하였다. 이후 p-nitroanilide의 생성량을 Microplate Reader (Bio-rad, USA)를 이용하여 475 ㎚에서 측정 하였다. Elastase 활성 저해율은 다음 식에 따라 계산되며, IC50은 Elastase의 기질을 50% 저해하는데 요구되는 SRE의 농도 (㎍/㎖)로 표시하였다.
- 5∼1,000 ㎍/㎖)로 희석된 SRE 추출물 300 ㎕를 넣어준 다음 1 ㎍/㎖로 희석된 porcine pancreatic elastase 제 Ⅰ형과 Ⅳ형에 각각 40 ㎕와 60 ㎕를 넣어주고, 실온에 10 분간 방치하였다. 이후 p-nitroanilide의 생성량을 Microplate Reader (Bio-rad, USA)를 이용하여 475 ㎚에서 측정 하였다. Elastase 활성 저해율은 다음 식에 따라 계산되며, IC50은 Elastase의 기질을 50% 저해하는데 요구되는 SRE의 농도 (㎍/㎖)로 표시하였다.
- 즉, 0.175 M sodium phosphate buffer(pH 6.8) 500㎕에 10 mM L-DOPA 200 ㎕ 및 SRE(62.5∼1,000 ㎍/㎖) 용액 100 ㎕의 혼합액에 mushroom tyrosinase(110 U/㎖) 200 ㎕을 첨가하여 5% CO2 incubator에서 37℃를 유지하면서 2 분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 475 ㎚에서 측정하였다.
- 즉, B16F10 세포를 배양하여 96 well plate에 각 well당 5×104 cell/㎖의 농도로 분주하고, 5% CO2 incubator에서 37℃를 유지하면서 24 시간 동안 pre-incubation시킨 후 SRE를 각 농도별(62.5∼1,000 ㎍/㎖)로 처리한 다음 24 시간 배양하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 활용된 방풍(Saposhnikoviae Radix)은 미나리과에 속한 다년생 초본인 방풍(Saposhnikovia divaricata Schiskin)의 뿌리 및 根莖을 건조한 것6)으로, 동신대학교 광주한방병원에서 구입한 후 본초학교실에서 검수를 받아 사용하였다.
- 악성 흑색종 세포주인 B16F10 세포의 생육 배지로는 RPMI 1640(Sigma, R4130)을 이용하였고, 배지에는 10% fetal bovine serum(Gibco LOT. NO. 1006842, FBS)와 penicillin-streptomycin(100 units/㎖, 100 ㎍/㎕)을 첨가하였으며, 실험기간 동안 세포주는 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
- 인간 유래 악성 흑색종(melanoma) 세포주인 B16F10 cell lines은 한국세포주은행(KCLB, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험 자료에 대한 통계학적 분석은 통계 패키지인 SigmaPlot 11.0 for windows program을 사용하여 실시하였으며, Student′s-t-test를 이용하여 p값이 0.05 미만 일 때 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
이론/모형
- SRE was Saposhnikoviae Radix Extracts, B16F10 cells were attached 96 well plate, and added SRE as indicated concentrations respectively. After 24 hrs incubation, production levels of melanin were measured using MTT methods. Result are presented as mean±SD.
- SRE was Saposhnikoviae Radix Extracts, B16F10 cells were added SRE as indicated concentrations respectively. After 24 hrs incubation, proliferation rates were measured using colorimetric methods. Result are presented as mean±SD.
- SRE was Saposhnikoviae Radix Extracts, B16F10 cells were incubated with SRE for 24 hrs in indicated concentrations. Inhibitory effects on elastase activities were measured using colorimetric methods. Values are represented as percentage of inhibitory rates.
- Inhibitory effects of SRE on tyrosinase activities in vitro. SRE was Saposhnikoviae Radix Extracts, Inhibitory effects on tyrosinase activities were measured using colorimetric methods. Values are represented as percentage of inhibitory rates.
- Inhibitory effects of SRE on tyrosinase activities in vitro. SRE was Saposhnikoviae Radix Extracts, Inhibitory effects on tyrosinase activities were measured using colorimetric methods. Values are represented as percentage of inhibitory rates.
- SRE가 B16F10 세포에 미치는 증식율은 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay21)를 통해 측정하였다. 즉, B16F10 세포를 배양하여 96 well plate에 각 well당 5×104 cell/㎖의 농도로 분주하고, 5% CO2 incubator에서 37℃를 유지하면서 24 시간 동안 pre-incubation시킨 후 SRE를 각 농도별(62.
- 비세포 elastin 분해효소인 elastase 활성 저해율은 James 등25)의 방법으로 측정하였다. 즉, 0.
- 비세포 tyrosinase 활성 저해율은 Yagi 등23)의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 0.
성능/효과
- SRE 추출물을 처리하지 않았을 때의 제 Ⅰ형 elastase 저해율을 0.00±17.84%라 하였을 때, SRE 250 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 1,000 ㎍/㎖를 처리한 처리군의 저해율은 각각 34.04±14.53%, 55.32±18.87%, 71.28±8.86%로 SRE를 처리하지 않았을 때보다 유의성 있게 증가하였다.
- SRE 추출물을 처리하지 않았을 때의 제 Ⅳ형 elastase 저해 율을 0.00±6.54%라 하였을 때, SRE를 처리한 처리군의 제 Ⅳ형 elastase 저해율은 각각 농도 의존적으로 23.42±13.94%, 29.75±9.91%, 44.30±15.12%, 51.90±17.84%, 62.66±15.61%로 SRE 를 처리하지 않았을 때보다 유의성 있게 증가하였고, IC50은 437.20 ㎍/㎖로 계산되었다(Fig. 5B).
- SRE를 처리하지 않았을 때의 elastase의 활성 저해율을 0.00±1.27%라 하였을 때, SRE 250 ㎍/㎖과 1000 ㎍/㎖를 처리한 처리군의 elastase 활성 저해율은 각각 22.40±9.82%와 52.60±7.65%로 유의성 있게 증가하였고, IC50은 939.50 ㎍/㎖로 계산되었다(Fig. 6).
- SRE를 처리하지 않았을 때의 tyrosinase의 활성 저해율을 0.00±0.00%라 하였을 때, SRE 250 ㎍/㎖과 500 ㎍/㎖를 처리한 처리군의 tyrosinase 활성 저해율은 각각 21.65±5.61%와 42.53±12.27%로 유의성 있게 증가하였다.
- SRE를 처리하지 않았을 때의 멜라닌 생성량을 100.00±8.09%로 환산하였을 때, SRE를 처리한 저농도 처리군에서는 멜라닌 생성이 억제되었고, 그 중에서 SRE 125 ㎍/㎖를 처리한 처리군에서는 멜라닌 생성량이 89.73±2.03%로 SRE를 처리 하지 않았을 때보다 유의성 (p<0.05) 있게 감소하였다.
- 이는 방풍 추출물이 피부탄력에 관여하는 엘라스틴을 생성하는 것으로 판단 된다. 그리하여 B16F10 세포 내에서도 엘라스타제 생성을 저해하는지에 대하여 알아보고자 엘라스타제 저해율을 측정한 결과, 방풍 추출물 250 ㎍/㎖과 1,000 ㎍/㎖를 처리하였을 때 엘라스타제 저해율이 유의성 있게 증가하였고, IC50은 939.50 ㎍/㎖로 계산되었다(Fig. 6). 이와 같은 결과는 방풍 추출물이 elastase inhibitor로서 작용할 가능성이 있음을 확인해 주는 결과로 생각 된다.
- 방풍 추출물 (SRE)이 B16F10 세포의 증식율에 미치는 효과를 측정한 결과, 방풍 추출물 125 ㎍/㎖과 250 ㎍/㎖를 처리하였을 때의 세포 증식율이 각각 방풍 추출물을 처리하지 않았을 때보다 30% 정도 유의성 (p<0.001) 있게 감소하였고(Fig. 1), 또한 멜라닌 생성 억제에 미치는 효과를 측정한 결과 방풍 추출물 (SRE) 125 ㎍/㎖를 처리하였을 때 방풍 추출물을 처리하지 않았을 때보다 10 %이상 유의성 (p<0.05) 있게 감소하였다(Fig. 2).
- 방풍 추출물 (SRE)이 엘라스타제 활성에 미치는 저해 효과를 알아보기 위하여 비세포에서 엘라스타제 제 Ⅰ형과 제 Ⅳ형에 대한 활성 저해율을 측정한 결과 방풍 추출물 투여 농도에 의존하여 제 Ⅰ형 엘라스타제 저해율은 방풍 추출물을 처리하지 않았을 때보다 SRE 250 ㎍/㎖을 처리하였을 때 유의성 있게 증가하였고, IC50은 437.53 ㎍/㎖로 계산되었으며(Fig. 5A), 제 Ⅳ형엘라스타제 저해율 역시 투여 농도에 의존해 유의성 있게 증가 하였고, IC50은 437.20 ㎍/㎖로 계산되었다(Fig. 5B). 이는 방풍 추출물이 피부탄력에 관여하는 엘라스틴을 생성하는 것으로 판단 된다.
- 방풍 추출물을 처리하였을 때, 비세포 엘라스타제 type Ⅰ 및 Ⅳ의 활성도는 유의성 있게 저해되었고, 엘라스타제 type Ⅰ 의 IC50은 437.53 ㎍/㎖이었으며, 엘라스타제 type Ⅳ의 IC50은 437.20 ㎍/㎖이었다.
- 방풍 추출물을 처리하였을 때, 비세포와 세포 내의 타이로시네이즈 활성도는 저해되었으나 IC50은 계산되지 않았다.
- 방풍 추출물을 처리하였을 때, 악성 흑생종 세포인 B16F10세포의 증식율은 유의성 있게 억제되었다.
- 비세포에서 방풍 추출물 (SRE)에 의한 타이로시네이즈 활성에 미치는 저해율을 측정한 결과 투여 농도에 의존하여 유의성 있게 증가하였으나 IC50은 구할 수 없었고(Fig. 3), B16F10 세포 내에서의 타이로시네이즈 활성 저해율을 측정하였을 때에도 IC50을 구할 수 없었다(Fig. 4). 이와 같이 타이로시네이즈 활성 저해 율에서 IC50을 구할 수 없어 본 저자는 1,000 ㎍/㎖ 이상의 고농도를 투여하여야 할 것으로 생각되나 세포 증식율 및 멜라닌 생성 억제율에서 고농도의 유효성을 의심할 수 있어 방풍 추출물에 의한 멜라닌 생성 억제 기전은 타이로시네이즈와는 관련이 없는 것으로 생각되며, 추후에 연구를 더욱 진행해야 할 것으로 판단된다.
- 악성 흑색종 세포의 증식율을 측정한 결과, SRE를 처리하지 않은 증식율을 100.00±1.18%로 환산하였을 때, SRE를 처리한 각 농도에서 유의성 있는 증식율 억제를 보였으나 그 중에서도 125㎍/㎖과 250 ㎍/㎖를 처리한 처리군에서 각각 72.88±4.60%와 73.49±3.77%로 SRE를 처리하지 않은 처리군의 증식율보다 유의성 (p<0.001) 있게 감소하였다(Fig. 1).
- 이상과 같이 방풍 추출물이 흑색종 세포주를 이용하여 멜라닌 생성 억제와 엘라스타제 활성 억제에 미치는 효과를 관찰한결과, 방풍 추출물은 비세포 뿐 아니라 세포 내에서도 엘라스타제의 활성을 억제해 피부 탄력 유지에 활용될 수 있을 것으로 생각되고, 멜라닌 색소의 생성도 억제한 것으로 판단된다.
후속연구
- 이와 같은 결과는 노 등13)이 제시한 방풍의 부작용이나 중독증상이 있음에도 불구하고 저농도보다 고농도에서는 세포증식율이 증가하고, 이와 함께 멜라닌 생성 억제율도 증가하였다. 이는 문헌상 서로 상반되는 결과로 방풍 추출물의 색깔에 의한 것인지 아니면 실험상 B16F10 세포에 미치는 또 다른 반응인지에 대하여 앞으로 더욱 연구해야 할 것으로 보인다.
- 4). 이와 같이 타이로시네이즈 활성 저해 율에서 IC50을 구할 수 없어 본 저자는 1,000 ㎍/㎖ 이상의 고농도를 투여하여야 할 것으로 생각되나 세포 증식율 및 멜라닌 생성 억제율에서 고농도의 유효성을 의심할 수 있어 방풍 추출물에 의한 멜라닌 생성 억제 기전은 타이로시네이즈와는 관련이 없는 것으로 생각되며, 추후에 연구를 더욱 진행해야 할 것으로 판단된다.
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