[논문]방풍(防風)의 난알부민 유도 알레르기 비염 마우스에서의 항알레르기 효능 연구

정진기; 박용기

doi:10.6116/kjh.2012.27.5.85

방풍(防風)의 난알부민 유도 알레르기 비염 마우스에서의 항알레르기 효능 연구
Effects of Saposhnikoviae Radix on allergic responses in OVA-induced Allergic rhinitis mice 원문보기

大韓本草學會誌 = The Korea journal of herbology, v.27 no.5, 2012년, pp.85 - 91

정진기 (동국대학교 한의과대학 본초학교실) , 박용기 (동국대학교 한의과대학 본초학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : In this study, we investigated the effect of Saposhnikoviae Radix on allergic responses in ovalbumin(OVA)-induced Allergic rhinitis(AR) mice. Methods : BALB/c mice were orally administrated with Saposhnikoviae Radix water extract (SRW, 50 mg/kg) or anti-histamine drug, Ketotifen (10 mg/kg) as a reference drug, followed by sensitization and challenge of OVA. Mice were measured clinical symptoms and the serum levels of histamine, IgE, IL-4, and IFN-${\gamma}$, and observed histopathological changes of nasal mucosa H&E staining. Results : SRW significantly decreased rubs and the serum levels of histamine, IgE, and IL-4, and then increased the serum levels of IFN-${\gamma}$ in OVA-induced AR mice, and inhibited histopathological changes of nasal mucosa with inflammation and the eosinophils infilteration. Conclusions : These data suggest that SRW has anti-allergic effect through the inhibitory property of Saposhnikoviae Radix against allergic responses in allergic rhinitis.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

본 연구에서는 방풍의 알레르기 반응에 대한 조절효과를 난알부민 유도 알레르기 비염 마우스에서 확인하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
본 연구에서는 방풍의 알레르기 반응에 대한 조절효과를 확인하고자 난알부민 유도 알레르기 비염 동물을 이용하여 항알레르기 효과를 조사하였다.
등 의 항알레르기 효과에 대한연구가 보고되었다. 본 연구에서는 현재 복합처방의 구성의 하나로 항염증 및 항알레르기 효과가 보고된 방풍의 알레르기 비염에 대한 개선 효과를 확인하기 위하여 지연형 알레르기 비염 동물모델인 난알부민 감작 알레르기 비염 마우스에서 항알레르기 효능을 평가하였다.

제안 방법

1. 과민반응에 대한 효과

과민반응에 대한 방풍(SRW)의 효과를 확인하기 위해 ovalbumin으로 비강 내 감작된 마우스에서 마지막 비강 내 감작 직후 15분간 가려움, 재채기 등의 임상적 증상(Clinical symptoms)을 측정하였다.
마지막 복강 주사 7일 후 마우스를 50×15×50 ㎝ 크기의 아크릴 상자 안에 넣고 2 ㎎/㎖ OVA용액을 에어졸을 이용하여 격일로 1일 3회씩 3일 분사함으로써 비강 내 감작을 통한 알레르기 비염을 유도하였다. 그리고 마지막 비강 내 감작 직후 15분 동안 비강 과민반응을 이중맹검으로 측정하였다.
난알부민 유도 알레르기 비염 동물에서 방풍 물추출물 (SRW)의 알레르기 비염에 따른 비강 조직 손상에 대한 억제 효과를 확인하기 위해 비강조직을 H&E 염색하였다.
난알부민의 비강 내 감작 후 모든 동물의 심장으로부터 혈액을 수집하였으며, 수집된 혈액은 6,000 rpm에서 5분간 2회 원심 분리하여 혈청을 분리하여 혈액학적 검사에 사용하였다. 또한 비점막 조직(nasal mucosa)의 조직학적 변화를 관찰하기 위해 동물의 머리를 분리하여 비강을 둘러싸고 있는 골을 포함한 조직을 채취하였다.
또한 비점막 조직(nasal mucosa)의 조직학적 변화를 관찰하기 위해 동물의 머리를 분리하여 비강을 둘러싸고 있는 골을 포함한 조직을 채취하였다. 동물군은 각 군 당 6마리를사용하였으며, 생리식염수를 투여한 정상군(Normal), 난알부민(OVA) 감작에 의한 알레르기 비염이 유발된 대조군(OVA -Control), SRW을 50 ㎎/㎏ 투여한 실험군(OVA+SRW 50) 및 대조약물로 H₁ 항히스타민제인 Ketotifen 10 ㎎/㎏를 투여한 양성대조군(OVA+Ketotifen 10)으로 나누었다. 모든 약물은 아크릴 상자 안 비강 내 감작을 하는 7일 동안 매일 1회 일정 시간에 일정 투여량(0.
한편, Ketotifen 투여군(OVA+Ketotifen 10)의 경우 후각신경구의 발달이 감소되었으나 후각 상피세포층은 SRW 투여군에 비해 잘 보존되지 못하였다. 또한 각 투여군의 비후된 비강 점막의 두께를 측정하여 나타내었다.
난알부민의 비강 내 감작 후 모든 동물의 심장으로부터 혈액을 수집하였으며, 수집된 혈액은 6,000 rpm에서 5분간 2회 원심 분리하여 혈청을 분리하여 혈액학적 검사에 사용하였다. 또한 비점막 조직(nasal mucosa)의 조직학적 변화를 관찰하기 위해 동물의 머리를 분리하여 비강을 둘러싸고 있는 골을 포함한 조직을 채취하였다. 동물군은 각 군 당 6마리를사용하였으며, 생리식염수를 투여한 정상군(Normal), 난알부민(OVA) 감작에 의한 알레르기 비염이 유발된 대조군(OVA -Control), SRW을 50 ㎎/㎏ 투여한 실험군(OVA+SRW 50) 및 대조약물로 H₁ 항히스타민제인 Ketotifen 10 ㎎/㎏를 투여한 양성대조군(OVA+Ketotifen 10)으로 나누었다.
마지막 복강 주사 7일 후 마우스를 50×15×50 ㎝ 크기의 아크릴 상자 안에 넣고 2 ㎎/㎖ OVA용액을 에어졸을 이용하여 격일로 1일 3회씩 3일 분사함으로써 비강 내 감작을 통한 알레르기 비염을 유도하였다.
동물군은 각 군 당 6마리를사용하였으며, 생리식염수를 투여한 정상군(Normal), 난알부민(OVA) 감작에 의한 알레르기 비염이 유발된 대조군(OVA -Control), SRW을 50 ㎎/㎏ 투여한 실험군(OVA+SRW 50) 및 대조약물로 H₁ 항히스타민제인 Ketotifen 10 ㎎/㎏를 투여한 양성대조군(OVA+Ketotifen 10)으로 나누었다. 모든 약물은 아크릴 상자 안 비강 내 감작을 하는 7일 동안 매일 1회 일정 시간에 일정 투여량(0.3 ㎖)을 경구투여하였다.
방풍 200 g에 1 L와 함께 3시간 동안 2회 추출하여 와트만여과지(Wathman No. 1)로 여과한 후 감압 농축하였다. 이를 동결건조하여 방풍의 물추출물을 제조하였으며, 이 때 수득율은 8.
실험동물로부터 수집한 혈액에서 분리한 혈청 내 IFN-γ농도는 IFN-γ enzyme immunoassay kit(R&D systems) 를 사용하여 제조회사에서 제공한 방법에 의해 측정하였다.
알레르기 비염 동물모델(allergic rhinitis mouse model) 을 제작하기 위해 난알부민(ovalbumin, chicken egg albumin; OVA) 1 ㎎을 PBS와 수산화알루미늄 겔(Al(OH)3 gel)을 1:1로 혼합한 용액 1 ㎖을 난알부민 용액을 투여시작 1일, 8일, 15일에 마우스의 복강 내 주사함으로써 알레르기 면역반응을 유도하였다. 마지막 복강 주사 7일 후 마우스를 50×15×50 ㎝ 크기의 아크릴 상자 안에 넣고 2 ㎎/㎖ OVA용액을 에어졸을 이용하여 격일로 1일 3회씩 3일 분사함으로써 비강 내 감작을 통한 알레르기 비염을 유도하였다.
채취한 비강조직 중 경구개의 절치유두 부위 4% formaldehyde 용액으로 24시간 고정한 다음 비중격 부위 (nasal septum)를 노출시켜 10% ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 용액으로 7일간 탈회하였다. 이를 다시 파라핀으로 포매하여 블록을 만든 후 microtome을 이용하여 비강 내의 전정부위를 중심으로 5 ㎛ 두께의 절편을 제작하였다. 조직절편의 구조적 변화를 관찰하기 위하여 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색시약으로 염색한 후 염색된 조직절편을 광학현미경 하에서 상피세포층(epidermal sheet) 손상정도, 점막하 조직의 부종과 부종으로 인한 비후정도 등의 관찰을 통해 구조적 변화를 확인하였다.
조직절편의 구조적 변화를 관찰하기 위하여 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색시약으로 염색한 후 염색된 조직절편을 광학현미경 하에서 상피세포층(epidermal sheet) 손상정도, 점막하 조직의 부종과 부종으로 인한 비후정도 등의 관찰을 통해 구조적 변화를 확인하였다.
채취한 비강조직 중 경구개의 절치유두 부위 4% formaldehyde 용액으로 24시간 고정한 다음 비중격 부위 (nasal septum)를 노출시켜 10% ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 용액으로 7일간 탈회하였다. 이를 다시 파라핀으로 포매하여 블록을 만든 후 microtome을 이용하여 비강 내의 전정부위를 중심으로 5 ㎛ 두께의 절편을 제작하였다.
혈청 내 존재하는 IFN-γ의 농도는 표준 용액의 정량곡선을 기준으로 계산하였다.
반응액에 정지액(stop solution)을 각각 100 ㎕씩 넣어 효소반응을 정지시킨 후 microplate reader의 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 혈청 내 존재하는 IL-4의 농도는 표준 용액의 정량곡선을 기준으로 계산하였다.
반응액에 정지액(stop solution)을 각각 50 ㎕씩 넣어 효소반응을 정지시킨 후 microplate reader의 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 혈청 내 존재하는 IgE의 농도는 표준용액의 정량곡선을 기준으로 계산하였다.
반응 종료 시킨 후 microplate reader의 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 혈청 내 존재하는 히스타민의 농도는 표준용액의 정량곡선을 기준으로 계산하였다.

대상 데이터

34 % 였다. 방풍물추출물(SRW)은 냉장 보관하면서 실험직전 생리식염수에 완전히 용해한 후 실험약물로 사용 하였다.
본 실험에 사용된 방풍(Saposhnikovia divaricata Schischkin, Saposhnikoviae Radix; SR: 중국)은 방풍의 뿌리와 뿌리줄기를 (주)광명당제약(울산, 한국)으로부터 구입하여 동국대학교 한의과대학 본초학교실에서 정선한 후 사용하였다.
실험동물은 6주령 BALB/c계 수컷 생쥐(mouse, 20±2 g)를 (주)샘타코(경기도, 한국)로부터 구입하였으며, 고형사료와 물을 제한 없이 공급하면서 일정한 온도(25±2 ℃)와 습도(50±10%) 및 12시간 낮과 밤의 주기를 유지하여 사육하였다.
실험에 사용되어진 기기는 rotary evaporator(Eyela, Tokyo, Japan), freeze-dryer(Daeil BioTech, Gyeonggido, South Korea), microplate reader(Asys, Eugendorf, Austria), microscope(LEICA, Wetzlar, Germany) 등이다.
실험에 사용되어진 시약으로 ovalbumin (OVA), AL(OH)3 gel, Ketotifen은 모두 Sigma-Aldrich사(St Louice, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 기타 histamine enzyme immunoassay kit(Cayman Chemical, MG, USA), IgE ELISA kit(BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, USA), IFN-γ, IL-4(R&D systems Inc., MN, USA), H&E stain kit(Seoulin Biosciences Co., Seoul, South Korea) 등을 사용하였다.
1)로 여과한 후 감압 농축하였다. 이를 동결건조하여 방풍의 물추출물을 제조하였으며, 이 때 수득율은 8.34 % 였다. 방풍물추출물(SRW)은 냉장 보관하면서 실험직전 생리식염수에 완전히 용해한 후 실험약물로 사용 하였다.

데이터처리

결과는 3회 반복실험에 대한 평균과 표준편차(mean±SD) 로 나타내었으며, 통계학적 유의성 검증은 GraphPad Prism 5.0 분석프로그램의 one-way ANOVA와 Tukey's test를 이용하였고, p값이 0.05 이하인 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

이론/모형

난알부민 유도 알레르기 비염 동물에서 방풍물추출물 (SRW)의 알레르기 면역반응 조절 효과를 확인하기 위해 혈청내 IFN-γ의 농도를 ELISA 방법으로 측정하였다.
난알부민 유도 알레르기 비염 동물에서 방풍물추출물 (SRW)의 알레르기 면역반응 조절 효과를 확인하기 위해 혈청내 IL-4의 농도를 ELISA 방법으로 측정하였다.
난알부민 유도 알레르기 비염 동물에서 방풍물추출물 (SRW)의 알레르기 면역반응 조절 효과를 확인하기 위해 혈청내 IgE의 농도를 ELISA 방법으로 측정하였다.
난알부민 유도 알레르기 비염 마우스에서 방기물추출물 (SRW)의 알레르기 면역반응 조절 효과를 확인하기 위해 혈청내 히스타민의 농도를 효소면역반응법으로 측정하였다.
실험동물로부터 수집한 혈액에서 분리한 혈청 내 IL-4 농도는 IL-4 enzyme immunoassay kit(R&D systems)를 사용하여 제조회사에서 제공한 방법에 의해 측정하였다.
실험동물로부터 수집한 혈액에서 분리한 혈청 내 히스타민 농도는 histamine enzyme immunoassay kit(Cayman Chemical)를 사용하여 제조회사에서 제공한 방법에 의해 측정하였다. 즉, 혈청 200 ㎕를 튜브에 넣고 50 ㎕의 유도체화 완충용액을 넣어 반응시킨 후 20 ㎕의 유도체화 시약을 넣어 혼합시킨 후 유도체화된 혈청 100 ㎕를 히스타민 항체가 붙어있는 96-well plate에 넣고 enzyme conjugate 100 ㎕를 첨가하여 4℃에서 24시간 정치하였다.
혈청 내 IgE 항체의 농도는 IgE enzyme-linked immunoassay (ELISA) kit(BD Pharmingen)를 사용하여 제조회사에서 제공한 방법에 의해 측정하였다. 즉, 96-well flat-bottom ELISA plate에 0.

성능/효과

1. 방풍 물추출물은 난알부민 감작으로 유도된 알레르기 비염 마우스에서 혈청 내 히스타민과 난알부민 특이 IgE의 분비를 감소시켰다.
2. 방풍 물추출물은 난알부민 감작으로 유도된 알레르기 비염 마우스에서 혈청 내 IL-4 농도를 감소시키고 IFN-γ 농도를 증가시켰다.
3. 방풍 물추출물은 난알부민 감작으로 유도된 알레르기 비염 마우스에서 비강 내 비강 점막 조직의 구조적 손상을 개선시켰다.
그 결과, 그림 1에서와 같이 생리식염수를 투여한 정상군 (Normal)은 비강 내 감작을 하지 않았으므로 과민반응 수가 0으로 나타났고 난알부민(OVA) 감작에 의한 알레르기 비염이 유발된 대조군(OVA-Control)은 난알부민에 의해 가려움, 재채기 등의 임상적 증상이 127.5±14.85 로 현저히 증가 하였다.
그 결과, 그림 2에서와 같이 혈청 내 히스타민의 농도는 정상군(Normal)에서는 14.06±4.86 μM, 알레르기 비염이 유발된 대조군(OVA-Control)은 298.70±38.93 μM로 비염 유발 시 증가되었으며, SRW 투여군(OVA+SRW 50)에서는 164.47±51.94 μM 로 대조군에 비해 유의적으로 감소하였다.
그 결과, 그림 3에서와 같이 혈청 내 IgE의 농도는 정상군 (Normal)에서는 7.07±1.30 ng/㎖, 대조군(OVA-Control) 은 60.87±8.89 ng/㎖로 알레르기 반응 유도 후 증가하였으며, SRW(OVA+SRW 50) 투여 후 39.09±6.13 ng/㎖로 유의적으로 감소하였다.
그 결과, 그림 4에서와 같이 혈청 내 IL-4의 농도는 정상 군(Normal)에서는 9.67±1.98 pg/㎖, 대조군 (OVA-Control)은 56.18±5.63 pg/㎖로 알레르기 반응 유도 후 증가하였으며, SRW(OVA+SRW 50) 투여 후 28.34±1.29 pg/㎖로 유의적으로 감소하였다.
그 결과, 그림 5에서와 같이 혈청 내 IFN-γ의 농도는 정상군(Normal)에서는 4.72±0.70 pg/㎖, 대조군 (OVA-Control)은 0.93±0.32 pg/㎖로 알레르기 반응 유도 후 감소하였으며, SRW(OVA+SRW 50) 투여 후 2.44±0.51 pg/㎖로 유의적으로 증가하였다.
그 결과, 그림 6에서와 같이 난알부민 감작으로 알레르기비염이 유발된 대조군의 비강 점막에서는 후각 상피세포층이 손상되고, 후각신경구가 비후되었으며, 술잔세포(goblet cell) 가 발달하는 것을 관찰하였다. 반면 SRW 투여군(OVA+SRW 50)에서는 후각 상피세포층이 대조군에 비해 잘 보존되었으며, 후각신경구나 술잔세포의 발달이 감소되는 것으로 나타났다.
따라서 방풍은 난알부민 감작으로 유도된 알레르기 비염 마우스에서 알레르기 반응을 억제시켜주고 면역반응을 증가시켜줌으로써 효과적으로 알레르기 비염을 개선시킬 수 있는 것으로 나타났으며, 이는 방풍이 알레르기 비염 치료제로 개발될 수 있음을 시사한다.
본 연구에서 방풍 물추출물은 난알부민 유도 알레르기 비염 동물의 비강조직에서 섬모세포의 손상을 줄였으며, 후각신경구의 비후를 감소시켰다. 또한, 비만세포, 호산구 등 알레르기 반응 핵심 세포들과 술잔세포를 감소시킴으로써 비염에 따른 비강조직 손상을 막고 혈관투과성 감소를 통해 후각 상피세포층을 잘 보존하는 것으로 나타났다. 이는 방풍이 항원에 의해 손상된 비강조직을 보호함으로써 알레르기 비염을 개선시킬 수 있음을 의미한다.
그 결과, 그림 6에서와 같이 난알부민 감작으로 알레르기비염이 유발된 대조군의 비강 점막에서는 후각 상피세포층이 손상되고, 후각신경구가 비후되었으며, 술잔세포(goblet cell) 가 발달하는 것을 관찰하였다. 반면 SRW 투여군(OVA+SRW 50)에서는 후각 상피세포층이 대조군에 비해 잘 보존되었으며, 후각신경구나 술잔세포의 발달이 감소되는 것으로 나타났다. 한편, Ketotifen 투여군(OVA+Ketotifen 10)의 경우 후각신경구의 발달이 감소되었으나 후각 상피세포층은 SRW 투여군에 비해 잘 보존되지 못하였다.
. 본 연구에서 방풍 물추출물은 난알부민 유도 알레르기 비염 동물의 비강조직에서 섬모세포의 손상을 줄였으며, 후각신경구의 비후를 감소시켰다. 또한, 비만세포, 호산구 등 알레르기 반응 핵심 세포들과 술잔세포를 감소시킴으로써 비염에 따른 비강조직 손상을 막고 혈관투과성 감소를 통해 후각 상피세포층을 잘 보존하는 것으로 나타났다.
본 연구에서 방풍 물추출물은 난알부민 유도 알레르기 비염 마우스에서 혈청 내 IL-4농도를 유의적으로 감소시키고, IFN-γ의 농도를 유의 적으로 증가시켰으며, 이는 Th1/Th2 면역조절 반응 통해 IgE의 항체 생산을 감소시키고 비만세포의 성장을 억제시켜알레르기 비염을 개선시킬 수 있음을 의미한다.
또한 히스타민은 염증물질의 합성과 분비를 촉진함으로써 알레르기비염을 만성적 염증질환으로 진행시키는데 기여하게 되어 전반적인 알레르기 면역반응에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다^22,23). 본 연구에서 방풍 물추출물은 난알부민 유도 알레르기 비염 마우스에서 혈청 내 히스타민과 IgE의 농도를 유의적으로 감소를 유도하였다. 이는 지연형 알레르기 반응에 대해서 비만세포막 안정화에 기여할 뿐 아니라 B 세포로부터 생성되는 IgE의 항체 생산을 감소시킴으로써 면역조절을 통해 알레르기 비염을 개선시킬 수 있음을 의미한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	알레르기의 대표적인 질환은 무엇인가?	외부 자극 즉 항원(allergen)으로부터 반복적인 노출에 따른 변화된 상태 또는 이상반응이라는 광범위한 의미로부터 자극 적이거나 해로운 작용을 일으키는 면역반응으로 해석되고 있다1). 대표적인 질환으로 두드러기, 비염, 천식, 아토피 등이 있으며, 보통 면역글로불린 E(IgE) 매개의 과민반응과 같은 의미로 사용되고 있다2,3). 항원(allergen)에는 유전적 요인이나 연령, 성별, 기후변화와 생활환경과 같은 소인적인 측면뿐만 아니라 집먼지진드기, 꽃가루, 동물의 털, 기타 약물 등과 같은 외인성 알레르겐 등을 들 수 있으며 산업의 발전으로 인한 대기오염의 증가와 흡연이나 바이러스성 상기도 감염 등의 유발 인자 증가 등도 알레르기 반응 증가 요인으로 작용할 수 있다4).
	알레르기란 무엇인가?	알레르기(allergy)는 비정상적으로 일어나는 면역학적 기전에 의하여 발생하는 과민반응의 일종으로 만성염증 질환이다. 외부 자극 즉 항원(allergen)으로부터 반복적인 노출에 따른 변화된 상태 또는 이상반응이라는 광범위한 의미로부터 자극 적이거나 해로운 작용을 일으키는 면역반응으로 해석되고 있다1).
	알레르기 비염의 주요 증상은 무엇인가?	알레르기 비염은 IgE를 매개로 하는 비강 내에서 발생하는 만성염증질환으로 주요 증상으로는 재채기, 가려움, 비루, 코막힘 등 이며, 알레르기 비염이 장기적으로 지속되면 부비동염과 같은 만성 염증질환으로 발전하게 되고 더욱 나아가 천식으로 진행되는 것으로 보고되고 있다7-9).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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