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문제 정의
- 10,11) 하지만 감도면에서 균일 전기화학 면역 분석법이 불균일 전기화학 면역 분석법보다 대체적으로 작은 단점이 있어 비교적 높은 농도를 검출하는 면역 분석에 사용된다. 이러한 이유로 본 논문에서는 소변에서 비교적 높은 생리적 농도를 가지는 작은 유기분자인 마뇨산 (hippuric acid; HA)의 농도를 측정하기 위해 균일 전기화학 면역 분석법을 채택하였다.
가설 설정
- Schematic illustrating the homogeneous electrochemical immunoassay. (a) In the presence of antigens, antibody is competitively combined with antigens (HA and DA-HA) expected high current. (b) In the absence of antigens, antibody is combined with the DA-HA expected low current.
제안 방법
- Anti-HA와 합성된 DA-HA의 항원-항체 결합을 확인하기 위해, DA-HA의 농도를 1.000 mg/mL (in PBS, pH 7.4 containing 0.14 M NaCl)로 고정한 20 µL와 다양한 농도의 anti-HA(0.000~10.000 mg/mL) 20 µL를 반응시켜 전극 위에서 시차 펄스 전압 전류법 을 이용하여 측정하였다.
- Anti-HA와의 면역반응에서는 0.500 mg/mL 농도의 DA-HA를 이용하여 실험하였지만 경쟁 반응을 더욱 원활히 하기 위해 이 실험에서는 DA-HA의 농도를 0.100 mg/mL으로 시행하였고, 이를 통해 더욱 민감한 면역 분석을 시행할 수 있었다.
- DA-HA와 HA의 경쟁 반응을 통한 anti-HA와의 항원-항체 결합을 통해 HA의 정량적 분석을 시행하였다. 고정된 농도의 anti-HA (0.
- Dopamine hydrochloride (50.000 mg, 0.260 mmol)와 sodium hippuric hydrate (57.000 mg, 0.260 mmol)을 증류수 10 mL에 녹이고, EDC (101.000 mg, 0.520 mmol)와 NHS (60.200 mg, 0.520 mmol)를 첨가하여 1일 동안 질소 기체 하에 환류(refluxed) 시켰다. 반응 후 만들어진 생성물을 TLC를 이용하여 분리됨을 확인하였고, silica column을 이용하여 이동상으로 ethanol/ethyl acetate (5 : 5 wt %)을 이용하여 분리 정제 하였다.
- 본 연구에서는 톨루엔 검출을 위한 체내 대사물질인 HA을 전기화학적 면역센서에 응용하였다. HA은 전기적 활성을 띄지 않는 물질이기 때문에 이를 전기 화학적 방법을 통해 검출하기 위하여 아마이드 결합을 통해 DA을 배위시켜 DA-HA를 합성하였다. 합성 된 DA-HA는 HA를 정성적으로 검출하는 immunochromatographic 검출 키트를 통해 확인하였고, 순환 전압 전류법을 이용하여 전기화학적 산화/환원 매개체로서의 우수한 성능을 확인하였다.
- DA-HA와 HA의 경쟁 반응을 통한 anti-HA와의 항원-항체 결합을 통해 HA의 정량적 분석을 시행하였다. 고정된 농도의 anti-HA (0.500 mg/mL)와 DAHA (0.100 mg/mL)에 다양한 농도의 HA를 튜브에 섞어 20 min간 반응시킨 후 SPCE 에서 측정하였다. Fig.
- 520 mmol)를 첨가하여 1일 동안 질소 기체 하에 환류(refluxed) 시켰다. 반응 후 만들어진 생성물을 TLC를 이용하여 분리됨을 확인하였고, silica column을 이용하여 이동상으로 ethanol/ethyl acetate (5 : 5 wt %)을 이용하여 분리 정제 하였다.(Fig.
- 본 논문에서는 균일 전기화학 면역 분석법을 위해 항원이 결합된 DA-HA를 합성하였고, 이를 통해 경쟁 반응을 이용한 HA의 정량 분석을 시행할 수 있었다. 합성된 DA-HA의 고정된 농도와 HA의 농도 별 용액을 고정된 농도의 HA 항체(HA antibody; anti-HA)에 마이크로 튜브에서 일정 시간 동안 반응 시킨 후 스크린 프린트된 탄소 전극 (screen printed carbon electrodes; SPCEs)위에서 전기적 신호를 측정하였다.
- 본 연구에서는 톨루엔 검출을 위한 체내 대사물질인 HA을 전기화학적 면역센서에 응용하였다. HA은 전기적 활성을 띄지 않는 물질이기 때문에 이를 전기 화학적 방법을 통해 검출하기 위하여 아마이드 결합을 통해 DA을 배위시켜 DA-HA를 합성하였다.
- Anti-HA와 결합된 DA-HA는 큰 분자량 (약 150,000Da) 의 anti-HA에 의해 확산 계수 (diffusion coefficient)가 작아지고 이로 인해 전극으로의 물질전달 (mass transfer)이 어려워 져서 전류 신호가 작게 나온다. 이를 이용하여 anti-HA 농도 (0.000~10.000 mg/mL)를 달리하여 DA-HA 1.000 mg/mL과 튜브에서 반응 후 SPCEs에 서 시차 펄스 전압 전류 신호 (DPV)를 측정하였다.
- 지금까지 연구 된 항원이나 항체에 결합된 물질은 페로센,14) 납 이온,15) 오스뮴16) 등이 있는데 대부분 금속 물질들로 가격이 비싸고, 결합하는 과정이 복잡하다는 단점이 있다. 이에 본 논문에서는 생물체 내에서 신경전달물질인 도파민 (dopamine; DA)을 사용하여 작은 유기 화합물 항원인 마뇨산과 간단한 펩타이드 공유결합 반응방법으로 결합하였고, dopamine-hippuric acid (DA-HA)의 분자량 또한 상대적으로 적어 적은 농도에서도 높은 전류 신호를 갖는 항원이 결합된 산화/환원 매개체를 합성하였다.
- 1(b)). 즉, 용액 안에 존재하는 HA의 농도를 정량적으로 분석할 수 있었고, 이를 통해 항원의 농도를 정량적으로 분석할 수 있는 균일 전기화학 면역 분석법을 개발하였다.
- 본 논문에서는 균일 전기화학 면역 분석법을 위해 항원이 결합된 DA-HA를 합성하였고, 이를 통해 경쟁 반응을 이용한 HA의 정량 분석을 시행할 수 있었다. 합성된 DA-HA의 고정된 농도와 HA의 농도 별 용액을 고정된 농도의 HA 항체(HA antibody; anti-HA)에 마이크로 튜브에서 일정 시간 동안 반응 시킨 후 스크린 프린트된 탄소 전극 (screen printed carbon electrodes; SPCEs)위에서 전기적 신호를 측정하였다. 이 때 HA의 농도가 증가하게 되면 경쟁적인 반응을 통해 anti-HA와 결합되고, 상대적으로 결합되지 못한 DA-HA가 증가하게 되어 자유로운 DA-HA의 전기 신호는 증가된다 (Scheme.
- 환원 전류를 기준으로 측정한 이유는 산화 전류의 위치가 0.250 V 이상이며 이때 실제 소변이나 혈액에서 측정을 하게 되면 ascorbic acid, uric acid, urea 와 같은 방해 물질에 의한 간섭효과로 정확한 측정이 어렵기 때문에21) 환원 전류를 측정하였다.
대상 데이터
- 200 mm) 은 Merck (Darmstadt, Germany)사의 제품을 사용하였다. Monoclonal HA antibody (anti-HA) 와 immunochromatographic strip은 HBi (seoul, Korea)사에 의해 제공 받았다. 용액의 제조와 실험을 위하여 3차 증류수 (Millipore, Bedford, MA ; 저항 18 M·Ωcm)를 사용하였다.
- 실험에 사용된 시약인 dopamine hydrochloride (DA), N-ethyl-N'-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), hippuric acid (HA), ethanol and sodium hippurate hydrate (NaHA)는 Aldrich(Milwaukee, WI)사의 제품을 정제 없이 그대로 사용하였고 위에 사용된 모든 시약은 분석시약 급이었다.
- 전기화학 실험에서 작업 전극으로는, OHP(overhead projector film)위에 screen printing machine (BS860AP, Bando, Korea)을 이용하여 탄소 잉크 (Electrodag, 423SS, Acheson, USA)를 인쇄하여 만든 screen printed carbon electrode (SPCE)를 사용하였고, 상대 전극과 기준 전극으로는 백금(Platinum)선과 Ag/AgCl 전극 (ESA, EE009)을 사용하였다.
- 실험에 사용된 시약인 dopamine hydrochloride (DA), N-ethyl-N'-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), hippuric acid (HA), ethanol and sodium hippurate hydrate (NaHA)는 Aldrich(Milwaukee, WI)사의 제품을 정제 없이 그대로 사용하였고 위에 사용된 모든 시약은 분석시약 급이었다. 정제를 위한 TLC Silicagel plate (F254) 와 Silica gel 60 (0.063~0.200 mm) 은 Merck (Darmstadt, Germany)사의 제품을 사용하였다. Monoclonal HA antibody (anti-HA) 와 immunochromatographic strip은 HBi (seoul, Korea)사에 의해 제공 받았다.
이론/모형
- 000 mg/mL 이다. 반응 후 SPCE위에 올려 시차 펄스 전압 전류법 (DPV)을 이용하여 측정하였다. 측정에 사용된 시차 펄스 전압 전류법의 조건은 전위의 범위가 −0.
- 순환 전압 전류법 (Cyclic Voltammetry; CV)과 시차 펄스 전압 전류법 (Differential pulse voltammetry; DPV) 측정을 하는데 사용된 기기는 CH Instruments (Austin, TX, USA)의 model 660B Elctrochemical workstation을 사용하였다.
성능/효과
- Fig. 5(a)에서 HA가 존재하지 않을 때는 DA-HA와 anti-HA의 반응으로 전극으로의 전자 전달이 원할 하지 않아 신호가 감소하는 것을 확인 할 수 있는데, HA의 농도가 증가 할수록 DA-HA와의 경쟁적 반응으로 anti-HA에 결합하여 anti-HA에 결합되지 않는 DA-HA의 신호가 증가함을 확인할 수 있었다. 또한 DA-HA가 anti-HA에 결합되지 않을수록 신호의 위치도 양의 전위(positive potential)로 이동됨을 알 수 있 었다.
- 000 mg/mL의 DA-HA의 결과이다. DA-HA의 전기화학적 신호를 보면 0.253 V에서 산화 신호와 0.016 V에서 환원 신호가 나타남을 확인 할 수 있었고, 이는 DA-HA가 빠르고, quasi-reversible한 산화/환원 전자 전달체임을 알 수 있었다.
- 5(a)에서 HA가 존재하지 않을 때는 DA-HA와 anti-HA의 반응으로 전극으로의 전자 전달이 원할 하지 않아 신호가 감소하는 것을 확인 할 수 있는데, HA의 농도가 증가 할수록 DA-HA와의 경쟁적 반응으로 anti-HA에 결합하여 anti-HA에 결합되지 않는 DA-HA의 신호가 증가함을 확인할 수 있었다. 또한 DA-HA가 anti-HA에 결합되지 않을수록 신호의 위치도 양의 전위(positive potential)로 이동됨을 알 수 있 었다. 이 결과 또한 여러 전극으로 측정 시 발생되는 기준 오차를 제거하여 Fig.
- 2(B~F)) 이는 DA에 HA가 결합되어진 것을 입증 할 수 있다. 또한 이 키트의 검출 한계는 1.000 mg/mL의 HA임을 감안 할 때, 합성된 DA-HA의 분자량이 HA 보다 대략 2배 가까이 커 2.000 mg/mL에서 확실히 T line이 없어지는 것으로 보아 반응 후 초기 물질의 정제 또한 된 것을 알 수 있었다.
- 합성 된 DA-HA는 HA를 정성적으로 검출하는 immunochromatographic 검출 키트를 통해 확인하였고, 순환 전압 전류법을 이용하여 전기화학적 산화/환원 매개체로서의 우수한 성능을 확인하였다. 면역반응을 위하여 anti-HA와의 항원-항체 결합을 시켜 환원 전류 신호의 감소와 전위에 이동을 확인하였고, 균일한 방법으로 HA와의 경쟁반응을 통해 측정한 결과 HA의 농도가 증가함에 따라 전류 값도 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 환원 전류의 값이 Ag/AgCl 전극을 기준으로 0.
- 4(B)를 이용하여 각각의 anti-HA 농도에 따른 전위의 위치 중 전류 값이 최고 점인 지점으로 도시한 것이다. 이때 anti-HA 의 농도가 0.500 mg/mL까지는 크게 감소하다가 이후로는 포화 (saturation) 상태가 되어 anti-HA가 DA-HA와 더 이상 결합할 수 없는 한계전류에 도달하는 것을 확인 할 수 있었다. 이 때의 anti-HA와의 incubation time 은 20 min 이었고, 이는 다른 전극으로 4회 실험하여 반복적인 재현성 (reproducibility)을 얻을 수 있었다.
- HA은 전기적 활성을 띄지 않는 물질이기 때문에 이를 전기 화학적 방법을 통해 검출하기 위하여 아마이드 결합을 통해 DA을 배위시켜 DA-HA를 합성하였다. 합성 된 DA-HA는 HA를 정성적으로 검출하는 immunochromatographic 검출 키트를 통해 확인하였고, 순환 전압 전류법을 이용하여 전기화학적 산화/환원 매개체로서의 우수한 성능을 확인하였다. 면역반응을 위하여 anti-HA와의 항원-항체 결합을 시켜 환원 전류 신호의 감소와 전위에 이동을 확인하였고, 균일한 방법으로 HA와의 경쟁반응을 통해 측정한 결과 HA의 농도가 증가함에 따라 전류 값도 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.
- 확산이 느려지는 결과로 본래의 환원 신호가 0.016 V에서 −0.030 V로 치우침을 볼 수 있고, 항체의 농도가 5.000 mg/mL 이상에서는 −0.065 V까지 전위가 이동됨을 확인하였다.
후속연구
- 016 V 근처에서 측정되기 때문에 소변이나 혈액에 존재하는 방해물질의 간섭을 피할 수 있었다. 이러한 결과는 다양한 전기화학적 분석에 적용할 수 있고, 이를 통해 건강 관리 분야 (healthcare area) 에서 현장진단 (point-of-care)에 사용 될 수 있다고 사료된다.
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