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문제 정의
- 8-13) 본 연구의 목표는 지금 까지 진행되어 왔던 한 가지 생체시료를 검출하기 위한 바이오센서를 바탕으로 두 개의 다른 전위를 갖는 산화 · 환원매개체(redox mediator) 고분자를 함께 탄소 전극 (Screen Printed Carbon Electrodes) 위에 고정화 하여 각각의 고분자가 다르게 생체시료에 감응하는 바이오센서 제작의 가능성을 확인하였다.
제안 방법
- [Os(4,4'-dichloro-2,2'-bipyridine)2Cl2]와 polyacrylamidepoly (4-vinyl pyridine) (PAA-PVP)을 1 : 7의 몰 비로 에탄올에 녹여 100 mL 둥근바닥 플라스크 안에서 환류냉각기에 플라스크를 연결하고 3일 동안 반응을 시켰다.
- 같은 방법으로 촉매환원전류 값이 비교적 일정하게 유지되는 산화전위인 −0.1 V (versus Ag/AgCl)에 전위를 고정하여 환원전류크기와 HRP 농도에 관련된 검정곡선을 도시하여 HRP 농도별로 발생하는 과산화수소 환원촉매전류의 상관관계를 확인 하였다.
- 4은 탄소전극 위에 고정된 두 폴리머 PVI-[Os(4,4'-dimethoxy-2,2'-bipyridine)2Cl]+/2+와 PAA-PVP-[Os(4,4'-dichloro-2,2'-bipyridine)2Cl]+/2+에 과산화수소 (H2O2)와 과산화수소 환원 효소 (HRP) (5 mg/ml in PBS)와 가한 후에 측정한 CV 그림이다. 과산화수소 (H2O2)와 과산화수소 환원 효소 (HRP)의 촉매반응으로 osmium polymer가 전자를 전극으로부터 효소로 전달할 때 발생하는 환원촉매전류를 순환전압전류법을 이용하여 여러 가지 다른 HRP 농도 (0 unit, 100 unit, 200 unit, 300 unit, 400 unit)와 H2O2농도(그림 생략) 별로 측정하였다. 앞선 결과와 반대로 낮은 전위를 갖는 PVI-[Os(4,4'-dimethoxy-2,2'-bipyridine)2Cl]+/2+에 의한 환원촉매전류 만이 나타남을 볼 수 있다.
- 다음 1 mg/mL PAA-PVP-Os-dCl-bpy용액을 전극 위에 올리고 같은 방법으로 −0.4~0.8V (vs. Ag/AgCl)를 10회 반복하여 순환전압전류법을 실행하였다.
- 3은 탄소전극 위에 고정된 두 폴리머 PVI-[Os(4,4'-dimethoxy-2,2'-bipyridine)2Cl]+/2+와 PAA-PVP-[Os(4,4'-dichloro-2,2'-bipyridine)2Cl]+/2+에 당 (glucose)과 당 산화 효소 (GOx) (5 mg/ml in PBS)와 가한 후에 측정한 CV 그림이다. 당과 당 산화 효소 (GOx)의 촉매반응으로 발생하는 전자를 수용성 전자전달 매개체인 osmium polymer가 전자를 전극으로 전달할 때 발생하는 산화촉매전류를 순환전압전류법을 이용하여 여러 가지 다른 glucose농도 (0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 30 mM)별로 측정하였다. 두 개의 산화환원 매개체가 모두 전자 전달반응에 관여하지 않고 주로 높은 전위를 갖는 PAA-PVP-[Os(4,4'-dichloro-2,2'-bipyridine)2Cl]+/2+에 의한 산화촉매전류만이 나타남을 볼 수 있다.
- 세척과 건조 후에 PBS (40 μl)를 올리고 두 개의 오스뮴 고분자 막의 고정화를 확인하였다. 바이오센서 실험을 위하여 각각의 고정된 농도의 효소 (5 mg/ in PBS 1 ml)에 기질 농도를 변화시키며 CHI 660B Electrochemical Workstation 의 순환전압전류법과 전류/시간 법을 이용하여 산화/환원 촉매전류를 확인하였다.
- ] (100 mg)와 PVI (80 mg)을 50 mL의 에탄올에 녹여 100 mL 둥근바닥 플라스크 안에서 환류냉각기에 플라스크를 연결하고 3일 동안 반응을 시켰다. 반응 후 생성물을 50 mM NaCI과 10 mM HEPE가 포함된ethanol/water (30 : 70 v/v) 전개용매로 Sephadex G-25 크기 배제 크로마토그래피로 정제하고 다시 용매를 회전증발기를 이용 하여 증발시켜 얻었다.16)
- 낮은 산화환원 전위값을 갖는 PVI-[Os(4,4'-dimethoxy-2,2'-bipyridine)2Cl]+/2+경우에 피리딘 리간드에 위치한 전자주게 작용기인 −OCH3로 인하여 중심 금속인 Os의 산화환원전위를 수소가 위치한 리간드에 비교하여 약 200 mV 가량 음의 방향으로 이동시키고, 반면에 PAA-PVP-[Os(4,4'-dichloro-2,2'-bipyridine)2Cl]+/2+경우에 피리딘 리간드에 위치한 전자끌게 작용기인 −Cl 로 인하여 중심 금속인 Os의 산화환원전위를 약 200 mV 가량 양의 방향으로 이동시켜 두 오스뮴 폴리머의 전위 차를 약 400 mV를 보여 준다. 산화 전하량과 환원 전하량 값들을 각각 적분하여 전극의 단위 면적당 고정된 오스뮴의 착화합물의 moles 수를 확인하였다. 계산된 값은 단위면적당 (surface coverage) moles 수는Γ0 = ~5.
- 세척과 건조 후에 PBS (40 μl)를 올리고 두 개의 오스뮴 고분자 막의 고정화를 확인하였다.
- 실험 후에 탄소 전극을 증류수로 여러 번 세척 하고 말린 다음 PBS (40 μL)를 올리고 고분자 막의 고정화를 확인하였다.
- 잘 세척된 지름 3 mm탄소전극 위에 PBS 완충용 액에 녹인 40 μL의 1 mg/mL PVI-Os-dmo-bpy 용액을 전극 위에 올리고 −0.4~0.8 V (vs. Ag/AgCl)를 10회 반복하여 순환전압전류법을 실행하였다.
- 두 개의 산화환원 매개체가 모두 전자 전달반응에 관여하지 않고 주로 높은 전위를 갖는 PAA-PVP-[Os(4,4'-dichloro-2,2'-bipyridine)2Cl]+/2+에 의한 산화촉매전류만이 나타남을 볼 수 있다. 촉매산화전류 값이 비교적 일정하게 유지되는 산화전위인 0.6 V (versus Ag/ AgCl)에 전위를 고정하여 산화전류크기와 당 농도에 관련된 검정곡선을 도시하여 glucose의 농도별로 발생 하는 당 산화촉매전류의 상관관계를 확인 하였다. glucose 의 농도가 비교적 낮은 10 mM까지는 농도에 비례하여 일정한 전류의 양이 직선적으로 증가하는 것을 볼 수 있었고 10 mM 이상 일 때 전극 상에서 glucose가 산화 되는 최대 값에 접근함에 따라, 즉 포화 (saturation)상태에 도달함에 따라 전류의 증가폭이 점차 작아지면서한계촉매전류에 도달하는 것을 확인할 수 있었다.
- 반응 후 1 M의 sodium hydrosulfite (10 ml)를 첨가하여 생성된 침전물을 0℃에서 30분가량 식혔다. 침전물을 Nylon membrane filter (Whatman, 0.45 m)을 이용하여 여과하고, 차가운 증류수와 에테르를 사용하여 세척하여 수득하였다.
- 반응 후 1 M의 sodium hydrosulfite (10 ml)를 첨가하여 생성된 침전물을 0℃에서 30분가량 식혔다. 침전물을 Nylon membrane filter (Whatman, 0.45 m)을 이용하여 여과하고, 차가운 증류수와 에테르를 사용하여 세척하여 수득하였다.
- 합성된 100 [Os(4,4'-dimethoxy-2,2'-bipyridine)2Cl2] (100 mg)와 PVI (80 mg)을 50 mL의 에탄올에 녹여 100 mL 둥근바닥 플라스크 안에서 환류냉각기에 플라스크를 연결하고 3일 동안 반응을 시켰다.
대상 데이터
- 15) 합성물 정제를 위하여 TLC는 aluminum oxide (60 F254 , 0.2 mm, Merck)판을 이용 하였으며, 관 크로마토그래피 (column chromatography)에 이용된 aluminum oxide는 50~200 μm (Acrose)를 사용하였다.
- 0, Phosphate Buffered Saline)를 사용하였고, 모든 용액의 제조와 실험을 위하여 3차 증류수 (저항 18 MΩ · cm)와 용매는 Aldrich사에서 구입하여 분석시약 급을 그대로 사용하였다. 분석센서 스트립에 사용된 carbon paste (Electrodag 423SS)는 Acheson사 (Port Huron, MI)의 제품을 사용하였다.
- 실험에 사용 된 Glucose oxidase (GOx), Horseradish peroxidase (HRP)는 Sigma사에서 Potassium hexachloroosmate(IV), 4,4'-dimethoxy-2,2'-dipyridyl, 1-(3-aminopropyl)-imidazole, sodium hydrosulfite (Aldrich Chem. Co.)에서 정제 없이 분석시약 급을 그대로 사용하였다.
- 전해질로는 0.1 M NaCl을 포함한 PBS (pH 7.0, Phosphate Buffered Saline)를 사용하였고, 모든 용액의 제조와 실험을 위하여 3차 증류수 (저항 18 MΩ · cm)와 용매는 Aldrich사에서 구입하여 분석시약 급을 그대로 사용하였다.
이론/모형
- l-Vinylimidazole (Aldrich)는 사용 전에 증류하여 Poly(1-vinylimidazole) (PVI)를 합성하였다.14) Polyacrylamide-poly (N-vinylpyridine) (PAA-PVP) 문헌에 보고된 방법을 따라 합성하여 정제하여 사용하였다.15) 합성물 정제를 위하여 TLC는 aluminum oxide (60 F254 , 0.
- 두 개의 오스뮴 고분자 막을 얻기 위하여 CHI 660B Electrochemical Workstation의 순환전압전류법을 이용하 였다. 잘 세척된 지름 3 mm탄소전극 위에 PBS 완충용 액에 녹인 40 μL의 1 mg/mL PVI-Os-dmo-bpy 용액을 전극 위에 올리고 −0.
성능/효과
- 1 V (versus Ag/AgCl)에 전위를 고정하여 환원전류크기와 HRP 농도에 관련된 검정곡선을 도시하여 HRP 농도별로 발생하는 과산화수소 환원촉매전류의 상관관계를 확인 하였다. HRP의 농도가 비교적 낮은 100 unit까지는 농도에 비례하여 일정한 환원전류의 양이 직선적 으로 증가하는 것을 볼 수 있었고 100 unit 이상 일 때 전극 상에서 과산화수소가 환원되는 최대값에 접근함에 따라, 즉 포화 (saturation)상태에 도달함에 따라 전류의 증가폭이 점차 작아지면서 한계촉매전류에 도달 하는 것을 확인할 수 있었다. 위의 두 결과로 부터 서로 다른 전위를 갖은 산화 · 환원매개체는 촉매반응에 의하여 두 매개체가 산화형 또는 환원형의 농도가 sd증가 될 때, 전극 상에 인접한 두 산화·환원매개체 사이에서 빠른 내부 전자 전달반응으로 인하여 하나의 산화·환원매개체만 촉매반응에 관여함을 볼 수 있었다.
- 6 V (versus Ag/ AgCl)에 전위를 고정하여 산화전류크기와 당 농도에 관련된 검정곡선을 도시하여 glucose의 농도별로 발생 하는 당 산화촉매전류의 상관관계를 확인 하였다. glucose 의 농도가 비교적 낮은 10 mM까지는 농도에 비례하여 일정한 전류의 양이 직선적으로 증가하는 것을 볼 수 있었고 10 mM 이상 일 때 전극 상에서 glucose가 산화 되는 최대 값에 접근함에 따라, 즉 포화 (saturation)상태에 도달함에 따라 전류의 증가폭이 점차 작아지면서한계촉매전류에 도달하는 것을 확인할 수 있었다.
- 위의 두 결과로 부터 서로 다른 전위를 갖은 산화 · 환원매개체는 촉매반응에 의하여 두 매개체가 산화형 또는 환원형의 농도가 sd증가 될 때, 전극 상에 인접한 두 산화·환원매개체 사이에서 빠른 내부 전자 전달반응으로 인하여 하나의 산화·환원매개체만 촉매반응에 관여함을 볼 수 있었다. 결론적으로 본 연구를 통하여 서로 다른 두 전위를 갖는 전자전달매개체를 이용하여 동시에 여러 가지 생체시료를 측정 할 수 있는 다중 검출 바이오센서의 제작에 대한 가능성을 확인 할 수 있었다.
- 고분자를 합성하여 전기적 특성을 확인 할 수 있었다. 두 개의 각기 다른 전위를 갖는 전자전달 산화 · 환원 매개체는 촉매전류의 방향에 따라 두 매개체 간의 빠른 내부 전자전달반응의 가능성을 예측할 수 있었다. 이러한 두 매개체의 내부전자전달 반응으로 인하여 다중의 생체시료를 측정 할 수 있는 바이오센서의 제작에 대한 가능성을 확인 할 수 있었다.
- 산화·환원 전자전달매개체로 오스뮴을 중심 금속으로 두 PVI-[Os(4,4'-dimethoxy-2,2'-bipyridine)2Cl]+/2+와 PAA-PVP-[Os(4,4'-dichloro-2,2'-bipyridine)2Cl]+/2+ 고분자를 합성하여 전기적 특성을 확인 할 수 있었다.
- 위의 두 결과로 부터 서로 다른 전위를 갖은 산화 · 환원매개체는 촉매반응에 의하여 두 매개체가 산화형 또는 환원형의 농도가 sd증가 될 때, 전극 상에 인접한 두 산화·환원매개체 사이에서 빠른 내부 전자 전달반응으로 인하여 하나의 산화·환원매개체만 촉매반응에 관여함을 볼 수 있었다.
- 이러한 결과는 문헌에 발표된 매끈한 금 전극표면이 갖는 surface coverage는 Γ0 = 4.5 × 10−11 mole/㎠ 결과와 비교하여 본실험에 사용한 스크린 프린팅 카본반죽전극이 거친 표면으로 인하여 매끈한 표면을 갖는 전극보다 surface coverage가 많이 증가함을 확인 할 수 있었다.
- 두 개의 각기 다른 전위를 갖는 전자전달 산화 · 환원 매개체는 촉매전류의 방향에 따라 두 매개체 간의 빠른 내부 전자전달반응의 가능성을 예측할 수 있었다. 이러한 두 매개체의 내부전자전달 반응으로 인하여 다중의 생체시료를 측정 할 수 있는 바이오센서의 제작에 대한 가능성을 확인 할 수 있었다.
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