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문제 정의
- 외부 형상이 지름 10 mm, 높이가 4 mm인 원형 타입의 인공지지체는 280 μm의 선폭을 가지며 250 μm의 내부 공극을 가지고 있다. 이렇게 제작된 인공지지체는 조직 재생 적용을 위해 기계적 강도 및 세포 실험 평가를 수행하여 골 적용 가능성을 평가하였다.
제안 방법
- 본 연구에서는 폴리머 적층 시스템 (polymer deposition system)을 이용하여 고분자 재료와 바이오 세라믹 재료가 혼합된 3차원 인공지지체를 제작하였다. 폴리머 적층 시스템은 마이크로 단위의 원하는 3차원 형상 구조물을 제작하기 위한 시스템으로서 정밀하고 신속한 제어를 가능하게 한다.
- 또한 공압, 온도, 그리고 이송속도에 따라 적층 되는 재료의 선폭과 선 높이를 결정지을 수 있는 장점을 가지고 있으며, 2축의 적층헤드로 장착 되어있어 다양한 구조물을 빠르게 제작할 수 있다. 먼저 인공지지체를 제작하기 위해 공압을 제어하도록 하는 디스펜서 (Super x-V7, Musashai, Japan)와 공압을 공급 시켜주는 에어 콤프레샤 (S50-50-5.5, airssen, Japan)를 사용하였고, 디스펜서를 통해 최대 700 kPa의 압력 조절을 가능하게 하였다. 시린지에 열을 가해 주기 위한 기기로는 서모마스터(TC U-02, MUSASHI, Japan)를 사용하여 최고 250℃까지 온도 조절을 가능하게 하였다.
- 5, airssen, Japan)를 사용하였고, 디스펜서를 통해 최대 700 kPa의 압력 조절을 가능하게 하였다. 시린지에 열을 가해 주기 위한 기기로는 서모마스터(TC U-02, MUSASHI, Japan)를 사용하여 최고 250℃까지 온도 조절을 가능하게 하였다. 그리고 정밀한 인공지지체 제작을 하기 위해 정밀 분사 시스템 헤드 부분 Z 축을 볼 스크류 (BNK0802-3RRG0+155 LC5Y, Samick THK, Korea)와 AC 서보 모터 (SGMAS, Yaskawa, Korea)를 이용하였으며, X, Y 축에는 리니어 엔코더 (ST36D, Mitutoyo, Japan)와 리니어 모터 (IL06-075A1C1, Kollmorgen, England)로 이용되어 높은 정밀도를 구현하였다.
- 이 후, Hemacrometer 로 세포 수를 측정 및 계산하여 인공지지체에 1×105 만큼 주입하였다.
- PCL과 β-TCP가 혼합된 인공지지체는 원형 타입으로 지름이 10 mm, 높이가 4 mm로 제작되었으며, 이에 맞게 압축시험기 특성 부분을 설정하였다.
- 시린지에 열을 가해 주기 위한 기기로는 서모마스터(TC U-02, MUSASHI, Japan)를 사용하여 최고 250℃까지 온도 조절을 가능하게 하였다. 그리고 정밀한 인공지지체 제작을 하기 위해 정밀 분사 시스템 헤드 부분 Z 축을 볼 스크류 (BNK0802-3RRG0+155 LC5Y, Samick THK, Korea)와 AC 서보 모터 (SGMAS, Yaskawa, Korea)를 이용하였으며, X, Y 축에는 리니어 엔코더 (ST36D, Mitutoyo, Japan)와 리니어 모터 (IL06-075A1C1, Kollmorgen, England)로 이용되어 높은 정밀도를 구현하였다. GMS회사로부터 제작된 모션 제어 시스템을 구축하여 정밀한 구동을 할 수 있도록 하였고 G-code를 통해 X-Y-Z 축의 모션을 제어하였다.
- 그리고 정밀한 인공지지체 제작을 하기 위해 정밀 분사 시스템 헤드 부분 Z 축을 볼 스크류 (BNK0802-3RRG0+155 LC5Y, Samick THK, Korea)와 AC 서보 모터 (SGMAS, Yaskawa, Korea)를 이용하였으며, X, Y 축에는 리니어 엔코더 (ST36D, Mitutoyo, Japan)와 리니어 모터 (IL06-075A1C1, Kollmorgen, England)로 이용되어 높은 정밀도를 구현하였다. GMS회사로부터 제작된 모션 제어 시스템을 구축하여 정밀한 구동을 할 수 있도록 하였고 G-code를 통해 X-Y-Z 축의 모션을 제어하였다.
- 바이오 세라믹 재료인 β-TCP는 Berkeley Advanced Biomaterials 에서 구매하였다. 제작된 인공지지체는 스퍼터링 (Sputtering) 장치를 이용하여 골드 코팅 후, 주사전자현미경 (Scanning electron microscopy, Tescan VEGA II LMU, Czech)을 이용하여 관찰하였다.
- 인공지지체의 특성을 평가하기 위해 기계적 강도 실험과 세포 증식 평가를 수행하였다. 먼저 제작된 인공지지체의 기계적 강도를 평가하기 위해 압축시험기 (JSV H1000, KISC, Japan)를 이용하였다.
- 인공지지체의 특성을 평가하기 위해 기계적 강도 실험과 세포 증식 평가를 수행하였다. 먼저 제작된 인공지지체의 기계적 강도를 평가하기 위해 압축시험기 (JSV H1000, KISC, Japan)를 이용하였다. PCL과 β-TCP가 혼합된 인공지지체는 원형 타입으로 지름이 10 mm, 높이가 4 mm로 제작되었으며, 이에 맞게 압축시험기 특성 부분을 설정하였다.
- 다음 세포 증식 평가를 하기 위해 인공지지체를 70% 에탄올을 이용하여 클린벤치에서 4시간 동안 자외선으로 살균하였다. 그리고 PBS를 이용하여 인공지지체의 표면을 씻어 주었고, 배지에 2시간 동안 넣어 표면에 세포들이 잘 증착 될 수 있도록 하였다.
- 다음 세포 증식 평가를 하기 위해 인공지지체를 70% 에탄올을 이용하여 클린벤치에서 4시간 동안 자외선으로 살균하였다. 그리고 PBS를 이용하여 인공지지체의 표면을 씻어 주었고, 배지에 2시간 동안 넣어 표면에 세포들이 잘 증착 될 수 있도록 하였다. 세포를 주입한 인공지지체는 7일 동안 인큐베이터에서 배양을 시켰고, 1, 4, 7일에 거쳐 CCK-8 용액을 이용한 세포 증식 평가를 진행하였다.
- 그리고 PBS를 이용하여 인공지지체의 표면을 씻어 주었고, 배지에 2시간 동안 넣어 표면에 세포들이 잘 증착 될 수 있도록 하였다. 세포를 주입한 인공지지체는 7일 동안 인큐베이터에서 배양을 시켰고, 1, 4, 7일에 거쳐 CCK-8 용액을 이용한 세포 증식 평가를 진행하였다. 이때, 세포 증식 평가를 하기 위해 Microreader (UVM340, Elisa, USA)를 이용하였다.
- 인공지지체의 세포 증식 평가를 하기 위해 MG-63 세포를 배양하였다. 세포 배양에 있어 배지는 DMEM (D-minimum essential medium/high glucose, Hyclone, USA)과 10% FBS (Fetal bovin serum, Gibco, Rockvile, USA), 그리고 1% PS (Penicillin streptomycin, Sigma, USA)를 혼합하여 만들었다. 원활한 세포 배양을 위해서 37℃의 온도와 5% CO2의 환경을 가지는 인큐베이터에 배양 되었으며, 일정한 주기를 가지고 배지 교체 및 계대 배양을 하였다.
- 세포 배양에 있어 배지는 DMEM (D-minimum essential medium/high glucose, Hyclone, USA)과 10% FBS (Fetal bovin serum, Gibco, Rockvile, USA), 그리고 1% PS (Penicillin streptomycin, Sigma, USA)를 혼합하여 만들었다. 원활한 세포 배양을 위해서 37℃의 온도와 5% CO2의 환경을 가지는 인큐베이터에 배양 되었으며, 일정한 주기를 가지고 배지 교체 및 계대 배양을 하였다. 그리고 배양 접시에서 충분히 배양되어 있는 세포를 0.
- 먼저 폴리머 적층 시스템을 이용하여 제작된 인공지지체는 250 μm 의 정밀 노즐을 이용하여 적층되었고, 평균 650 kPa의 압력과 110℃의 온도를 적용하였다.
- PCL/β-TCP 인공지지체의 강도 및 변형률을 알아보기 위해 Fig. 4와 같이 응력-변형률 곡선을 이용하였다.
- 폴리머 적층 시스템의 적층 헤드는 180 mm/sec 의 이송속도로 설정하였으며, 250 μm ± 10 μm 의 공극 크기를 가지도록 코드를 제작하였다.
- 먼저, 각각의 재료인 PCL과 β-TCP 를 저울을 통하여 무게를 측정한 뒤, 핫플레이트를 통하여 혼합된 재료를 녹인다.
- SEM 사진을 보면 3차원 원형타입의 인공지지체가 원하는 형상에 맞게 잘 제작된 것을 확인할 수가 있다. 제작된 인공지지체를 압축시험기를 통하여 기계적 특성을 평가하였다. PCL/β-TCP 인공지지체의 강도 및 변형률을 알아보기 위해 Fig.
- 그리고 제작된 PCL/β-TCP 인공지지체가 세포적합성이 우수한지 확인하기 위해 세포 증식 실험을 진행하였다.
- 폴리머 적층 시스템을 이용하여 고분자 재료인 PCL 과 바이오 세라믹 재료인 β-TCP 를 혼합한 3차원 PCL/β-TCP 인공지지체를 성공적으로 제작하였다.
- PCL/β-TCP 인공지지체의 세포 증식 평가를 위해 MG-63 세포를 배양하였다. 그리고 인공지지체의 세포 증식을 평가하기 위해 CCK-8 Kit를 이용하여 Microreader 장치를 통한 흡광도 측정 및 세포 증식을 확인하였다. 배양된 MG-63 세포를 인공지지체 내부에 주입하여 시간에 따른 세포 증식을 비교하였다.
- 그리고 인공지지체의 세포 증식을 평가하기 위해 CCK-8 Kit를 이용하여 Microreader 장치를 통한 흡광도 측정 및 세포 증식을 확인하였다. 배양된 MG-63 세포를 인공지지체 내부에 주입하여 시간에 따른 세포 증식을 비교하였다. Fig.
- 인공지지체 제작을 위해 사용된 폴리머 적층 시스템은 골 조직 형상을 위해 원하는 공극의 크기와 혼합재료의 인공지지체 제작이 가능하다. 그리고 제작된 인공지지체를 통하여 기계적 강도 평가와 세포 증식 평가를 수행하였다. PCL 재료에 바이오 세라믹 재료인 β-TCP 를 혼합한 인공지지체를 이용하여 세포 증식 실험과 기계 강도 테스트를 진행한 결과, 세포 증식은 PCL 재료에 β-TCP 의 함유량이 높을수록 시간이 지남에 따라 OD 값이 증가하는 것을 볼 수 있었다.
- 본 연구를 통해 β-TCP 혼합 비율에 따른 인공지지체를 폴리머 적층 시스템을 이용하여 제작하였으며, β-TCP 함유량에 따른 기계적 특성과 세포증식을 확인하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 고분자 재료인 PCL과 바이오 세라믹 재료인 β-TCP를 혼합한 3차원 인공지지체를 제작하였다.
- 바이오 세라믹 재료인 β-TCP는 Berkeley Advanced Biomaterials 에서 구매하였다.
- 인공지지체 제작에 사용된 고분자 재료인 PCL (Average Mn 45,000) 은 Sigma Aldrich 에서 구매하였다. 바이오 세라믹 재료인 β-TCP는 Berkeley Advanced Biomaterials 에서 구매하였다.
- 인공지지체의 세포 증식 평가를 하기 위해 MG-63 세포를 배양하였다. 세포 배양에 있어 배지는 DMEM (D-minimum essential medium/high glucose, Hyclone, USA)과 10% FBS (Fetal bovin serum, Gibco, Rockvile, USA), 그리고 1% PS (Penicillin streptomycin, Sigma, USA)를 혼합하여 만들었다.
- 본 연구에서 제작한 PCL/β-TCP 인공지지체는 원형타입으로 지름이 10 mm, 높이는 4 mm 의 형상을 갖추고 있다.
- PCL/β-TCP 인공지지체의 세포 증식 평가를 위해 MG-63 세포를 배양하였다.
데이터처리
- 1 mm/min의 속도로 10 mm의 면적에 하중을 주었다. 결과로 압축시험기 프로그램을 통해 응력-변형률의 그래프와 데이터 값을 얻었으며, 3개 샘플의 평균값으로 계산하였다.
성능/효과
- 따라서 β-TCP 세라믹 재료가 고분자 재료인 PCL에 함유량이 높을 수록 기계적인 특성면에서 큰 영향이 미치는 것을 확인할 수 있었다.
- 그래프에서 보는 바와 같이 10 wt% PCL/β-TCP 인공지지체가 30 wt% PCL/β-TCP 인공지지체보다 기계적 강도가 높은 것을 확인할 수 있다.
- 따라서 바이오 세라믹 재료인 β-TCP 가 고분자 재료인 PCL에 함유되어 있는 양에 따라 기계적 특성면에서 큰 영향을 미치는 것으로 확인되었다.
- 그리고 기계 강도 테스트에서는 β-TCP 함유량이 높은 인공지지체에서 기계적 강도가 약한 것을 확인하였다.
- 즉, 세포 증식은 혼합된 PCL/β-TCP 인공지지체의 β-TCP 함량 비율이 높을수록 세포 증식에 탁월한 효과가 있는 것을 확인하였다.
- 바이오 세라믹 재료인 β-TCP 의 함유량이 높은 인공지지체에서 세포 초기 증착은 낮았지만, 세포의 증식률을 다른 인공지지체 보다 높아지는 것을 확인 할 수 있었다.
- PCL 재료에 바이오 세라믹 재료인 β-TCP 를 혼합한 인공지지체를 이용하여 세포 증식 실험과 기계 강도 테스트를 진행한 결과, 세포 증식은 PCL 재료에 β-TCP 의 함유량이 높을수록 시간이 지남에 따라 OD 값이 증가하는 것을 볼 수 있었다.
- 세포 증식 평가를 통해 바이오 세라믹 재료인 β-TCP의 함량이 높을수록 세포 증식에 큰 영향을 미치는 것을 확인할 수가 있었으며, 이는 골 전도성이 좋은 β-TCP의 재료로 인해 β-TCP 함량이 높은 인공지지체에서 세포 증식이 더 좋은 것으로 확인하였다.
- 즉, 소수성 표면을 가지는 PCL 의 재료에서 세포 초기증착이 잘 이루어지며, 골 전도성이 우수한 β-TCP 의 재료 특성 상 세포 증식률이 좋은 것으로 여겨진다.
- 그림에서 보는 바와 같이, 1일차 결과에서 세포의 초기 증착이 blended PCL (90 wt%)/β-TCP (10 wt%)의 인공지지체가 Optical density (OD) 값이 가장 높게 나타난 것을 확인할 수 있다.
후속연구
- 본 연구를 통해 β-TCP 혼합 비율에 따른 인공지지체를 폴리머 적층 시스템을 이용하여 제작하였으며, β-TCP 함유량에 따른 기계적 특성과 세포증식을 확인하였다. 향 후, 골 조직 재생을 위해 다른 바이오 세라믹 재료를 이용하여 인공지지체 제작 및 특성 평가를 수행할 것이다.
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