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문제 정의
- 본 연구에서는 nicotine의 cotinine의 전환연구가 전무한 후코이단을 이용하여 nicotine의 cotinine 전환 효과 및 항산화 효과를 측정하고자 하였다.
- 천연물 추출물에 대한 nicotine 분해 효과에 대한 연구결과를 보면, 이들 대부분의 천연물은 일반적으로 페놀 화합물과 플라보노이드 함량이 풍부하다. 따라서 후코이단 및 녹차 추출물의 총 페놀 화합물과 플라보노이드 함량의 증가가 nicotine의 분해 효과와 어떤 상관성이 있는지를 알아보기 위하여 각각의 함량을 측정하였다. 후코이단의 총 페놀 화합물과 플라보노이드의 함량은 각각 4.
제안 방법
- 1.5 mL 튜브에 10 mM의 nicotine 200 μL와 시료를 같은 양으로 혼합한 후 37℃에서 0 min, 30 min, 60 min 및 120 min 때에 시료를 회수하여 생성된 cotinine의 양을 HPLC로 측정하였다.
- 컬럼은 역상 컬럼(YMC-Pack ODS-A, Pore size 12 nm, Particle size 5 μm, length 150×4.6 mm)을 이용하였고, 기기는 high performance liquid chromatography(HPLC) 시스템(Waters, Korea)과 자외선 검출기(Waters, PDA Detector)를 이용하여 측정하였다.
- 후코이단 추출을 위한 미역 포자엽은 완도산 미역 포자엽을 이용하였다. 미역 포자엽 100 g을 1,000 mL 증류수에 투입 후, 100℃에서 2시간 교반하여 포자엽에서 다당을 추출하였다. 추출된 다당에서 후코이단은 먼저 알긴산을 분리․제거하여 남은 것을 후코이단의 시료로 이용하였다.
- 6 mm)을 이용하였고, 기기는 high performance liquid chromatography(HPLC) 시스템(Waters, Korea)과 자외선 검출기(Waters, PDA Detector)를 이용하여 측정하였다. 시료를 물에 녹인 후 dichloromethane으로 추출하여 dichloromethane 층과 물 층에 대하여 분석하였다. Nicotine 표준품과 검출시간(RT; retention time)과 검출 피크의 UV 파장을 비교하여 분석 및 함량을 구하였다.
- 시료를 물에 녹인 후 dichloromethane으로 추출하여 dichloromethane 층과 물 층에 대하여 분석하였다. Nicotine 표준품과 검출시간(RT; retention time)과 검출 피크의 UV 파장을 비교하여 분석 및 함량을 구하였다. 이동상으로는 100 mM sodium perchlorate가 함유된 10 mM sodium phosphate(pH 2.
- Nicotine에서 cotinine의 전환능의 측정은 Ghosheh 등(2000)의 방법을 변경하여 실시하였다. HPLC 분석 컬럼과 UV 검출 파장은 니코틴 함량 측정과 동일하게 하였다.
- 6 mL를 가하고, 15분간 혼합한 다음 2,000×g에서 5분간 원심분리 하였다. 질소가스를 이용하여 dichloromethane 층을 날려 보낸 다음, 이동상 용액 0.5 mL를 가하여 다시 녹인 용액으로 분석하였다. 이동상으로는 triethylamine이 함유된 0.
- 후코이단의 nicotine에서 cotinine으로의 분해 정도는 nicotine과 시료(1 mg/mL)를 직접 혼합한 후 cotinine의 생성량을 측정하였다. 1.
- 5 mg/mL 및 1 mg/mL의 농도로 첨가하여 시간대 별(1 hr, 2 hr 및 3 hr)로 배양하였다. 시료 노출 후, 배양액과 세포를 회수하여 cotinine을 HPLC로 정량하였다. 세포는 4℃에 보관된 PBS로 3~4차례 씻어낸 다음, 스크래퍼를 이용하여 세포를 수거하였다.
- , USA)에서 파쇄하였다. 파쇄한 세포 및 배양액은 cotinine HPLC 정량법에 근거하여 시료를 처리하여 cotinine을 정량하였다. 양성대조군으로 녹차 추출물(100 g을 증류수 80℃에서 12 시간 추출 후, 동결건조)을 이용하여 비교 측정하였다.
- 파쇄한 세포 및 배양액은 cotinine HPLC 정량법에 근거하여 시료를 처리하여 cotinine을 정량하였다. 양성대조군으로 녹차 추출물(100 g을 증류수 80℃에서 12 시간 추출 후, 동결건조)을 이용하여 비교 측정하였다. 후코이단및 녹차 추출물의 처리 농도는 모두 1 μg/mL로 하였다.
- DPPH 분석은 Padda & Picha(2008)의 방법을 변형하여 사용하였다.
- 시료의 농도를 1,000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 및 15.63 μg/mL 농도로 희석하여 96 well plate에 100 μL씩 하여 0.01 mM DPPH 용액을 동량 가하여 25℃에서 30분간 반응시킨 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 3 mL를 차례로 가하여 혼합하고, 실온에서 40분간 방치한 다음 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. Quercetin(Sigma Co., USA)을 표준물질로 하여 총 플라보노이드 함량을 계산하였다(Moreno 등 2000).
- 01 mM DPPH 용액을 동량 가하여 25℃에서 30분간 반응시킨 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 시료대신 에탄올을 첨가하여 흡광도를 측정하였다. 시료의 DPPH 라디칼 소거 활성은 아래의 식을 이용하여 계산하였으며, 각 실험은 3회 반복 실험하였다.
- 후코이단의 nicotine 제거 효능을 인체에 무해한 cotinine의 생성도를 통하여 직접혼합법을 이용하여 측정하였다. 후코이단의 nicotine 분해능을 cotinine으로의 전환량을 시간별로 측정하였다. 아무것도 처리하지 않은 대조군의 경우는 시험 종료 시점인 120분 후에도 nicotine의 cotinine으로의 전환되는 양은 11 ng/mL를 나타내었으며, 그 양은 시험 30분 및 60분 후 측정값은 각각 5 ng/mL와 7 ng/mL로 시간이 경과하면서 nicotine의 cotinine으로의 전환량은 의미 있는 증가를 나타내지 않았다.
- 아무것도 처리하지 않은 대조군의 경우는 시험 종료 시점인 120분 후에도 nicotine의 cotinine으로의 전환되는 양은 11 ng/mL를 나타내었으며, 그 양은 시험 30분 및 60분 후 측정값은 각각 5 ng/mL와 7 ng/mL로 시간이 경과하면서 nicotine의 cotinine으로의 전환량은 의미 있는 증가를 나타내지 않았다. 시험군의 후코이단의 경우는 시험 30분, 60분 및 120분 후에 cotinine의 양은 각각 12 ng/mL, 51 ng/mL 및 170 ng/mL로 측정되었다. Nicotine의 cotinine으로의 전환량은 초기 30분에서 60분 경과 시점에서 약 4배가 증가하였고, 120분 경과 시점에서는 14배가 증가하여 통계적으로 유의차 있는 증가 수치를 나타내었다(p<0.
- 세포 배양에 있어 각 시간대가 경과함에 따라서 첨가되어 세포내에 축적된 nicotine이 cotinine으로 전환되는 양이 증가하였다. 본 시험에서는 3시간까지의 cotinine 전환량을 측정하였으며, 그 이후 시간대에서는 전환되는 양이 증가하지 않았다(Data not shown). 무 처리 대조군의 경우는 1시간, 2시간 및 시험 종료 시점인 3시간까지 각각 8 ng/mL, 10 ng/mL 및 17 ng/mL로 측정되어, 시간이 경과하면서 nicotine의 cotinine 으로의 전환량은 의미 있는 증가는 나타나지 않았다.
- 무 처리 대조군의 경우는 1시간, 2시간 및 시험 종료 시점인 3시간까지 각각 8 ng/mL, 10 ng/mL 및 17 ng/mL로 측정되어, 시간이 경과하면서 nicotine의 cotinine 으로의 전환량은 의미 있는 증가는 나타나지 않았다. 시험군의 후코이단의 경우는 시험 1시간, 2시간 및 3시간 후에 cotinine의 양은 각각 23 ng/mL, 54 ng/mL 및 98 ng/mL로 측정되었다. Nicotine의 cotinine으로의 전환량은 초기 1시간에서 2시간 경과 시점에서 약 2배가 증가하였고, 3시간 경과 시점에서는 4배가 증가하여 의미 있는 증가 수치를 나타내었다(p<0.
- 후코이단과 녹차 추출물의 항산화능을 DPPH 라디칼 소거능으로 측정하였다. 후코이단과 녹차 추출물의 항산화 효능은 Table 3과 같았다.
- 본 연구에서는 nicotine 분해에 효과에 대하여 해양식물 유래의 후코이단을 이용하여 시험관에서 직접 혼합법 및 세포주 시험에서 nicotine의 cotinine으로의 전환능을 측정하였다. 직접 혼합법 시험결과, 후코이단 1 μg/mL에서 시간이 경과함에 따라서 nicotine의 cotinine으로의 전환 정도가 대조군 대비 증가하여 시험 종료 시점에서 15배의 증가율을 나타내었다.
대상 데이터
- 전해조는 폴리프로필렌 500 mL에 두 전극과 온도계를 고정시키고, 발생가스가 유출될 수 있는 관이 꽂혀 있는 실리콘 마개로 구성하였으며, 직경이 50 μm인 백금선을 양극으로 하고, 면적 10×30 mm 백금망을 음극으로 사용하였다.
- 세포 배양을 이용한 nicotine 분해능 측정에 사용된 세포주는 한국세포주은행에서 분양받은 간세포에서 유래한 Hep-G2 세포주를 사용하였으며, 일주일간 배양한 간세포를 1 mM nicotine 이 함유되고 5% FBS가 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium) 배지에서 1일간 배양하였다.
- 후코이단 추출을 위한 미역 포자엽은 완도산 미역 포자엽을 이용하였다. 미역 포자엽 100 g을 1,000 mL 증류수에 투입 후, 100℃에서 2시간 교반하여 포자엽에서 다당을 추출하였다.
- 미역 포자엽 100 g을 1,000 mL 증류수에 투입 후, 100℃에서 2시간 교반하여 포자엽에서 다당을 추출하였다. 추출된 다당에서 후코이단은 먼저 알긴산을 분리․제거하여 남은 것을 후코이단의 시료로 이용하였다. 알긴산만 선택적으로 제거하기 위해 여과액에 50 mM CaCl2 용액을 가하여 겔화된 알긴산을 원심분리(Hanil, Supra 22K, 한국)로 제거하였다.
- 추출된 다당에서 후코이단은 먼저 알긴산을 분리․제거하여 남은 것을 후코이단의 시료로 이용하였다. 알긴산만 선택적으로 제거하기 위해 여과액에 50 mM CaCl2 용액을 가하여 겔화된 알긴산을 원심분리(Hanil, Supra 22K, 한국)로 제거하였다. 알긴산을 제거하고 남은 여과액을 한외여과장치(Pall, SLP-3053)에서 탈염 처리하여 후코이단을 얻었다.
- Nicotine 표준품과 검출시간(RT; retention time)과 검출 피크의 UV 파장을 비교하여 분석 및 함량을 구하였다. 이동상으로는 100 mM sodium perchlorate가 함유된 10 mM sodium phosphate(pH 2.6)/acetonitrile(70/30)을 사용하였으며, 유속은 1 mL/min로 하였다. 분석시의 UV 검출기의 파장은 254 nm으로 고정하여 사용하였다.
- 6)/acetonitrile(70/30)을 사용하였으며, 유속은 1 mL/min로 하였다. 분석시의 UV 검출기의 파장은 254 nm으로 고정하여 사용하였다.
- 5 mL를 가하여 다시 녹인 용액으로 분석하였다. 이동상으로는 triethylamine이 함유된 0.1 M sodium phosphate/methanol(v/v, 90/10, pH 4.7)을 사용하였으며, 유속은 1 mL/min로 하였다. Nicotine과 cotinine의 검출시간은 각각 22분 및 7분이었다.
데이터처리
- 그룹간의 유의적인 통계차를 분석하기 위하여 p<0.05의 유의수준으로 일원분산분석(one-way ANOVA)을 실시한 후, Duncan의 다중범위 검정법(Duncan’s multiple range test)을 이용하여 검증하였다.
- 실험 결과의 통계분석은 SPSS 프로그램(version 20.0.0, Chicago, llinois, USA)을 이용하여 평균 및 표준편차를 구하였다. 그룹간의 유의적인 통계차를 분석하기 위하여 p<0.
이론/모형
- 후코이단의 저분자화는 접촉 글로우 방전 전기분해 방법 (Contact Glow Discharge Electrolysis, CGDE)으로 하였다. 전해조는 폴리프로필렌 500 mL에 두 전극과 온도계를 고정시키고, 발생가스가 유출될 수 있는 관이 꽂혀 있는 실리콘 마개로 구성하였으며, 직경이 50 μm인 백금선을 양극으로 하고, 면적 10×30 mm 백금망을 음극으로 사용하였다.
- 총 페놀 화합물 함량은 Folin-Denis 방법(Dewanto 등 2002)을 이용하였다. 시료를 1 μg/mL 농도로 조제한 후, 시료 1 mL에 증류수 3 mL를 첨가하고, Folin-Ciocalteau's phenol reagent 1 mL를 첨가한 후 27℃에서 혼합하였다.
- 후코이단의 nicotine 제거 효능을 인체에 무해한 cotinine의 생성도를 통하여 직접혼합법을 이용하여 측정하였다. 후코이단의 nicotine 분해능을 cotinine으로의 전환량을 시간별로 측정하였다.
성능/효과
- 시험 30분 시점에서 대조군은 5 ng/mL이었고, 후코이단 처리군은 12 ng/mL로 대조군 대비 2배 정도 높은 cotinine의 양이 측정되었으며, 시간이 경과하면서 60분 후에는 7배, 120분 후에는 15배의 증가를 보여 후코이단의 nicotine 분해 효과가 나타났다(p<0.05).
- 녹차 추출물 처리에 의한 nicotine의 cotinine으로의 전환 정도는 초기 30분에서 60분 경과 시점에서 약 2배가 증가하였고(p<0.05), 120분 경과 시점에서는 8배가 증가하여 의미 있는 증가 수치를 나타내었으나, 후코이단 대비는 증가 정도가 낮았다.
- Nicotine의 cotinine으로의 전환량은 초기 30분에서 60분 경과 시점에서 약 4배가 증가하였고, 120분 경과 시점에서는 14배가 증가하여 통계적으로 유의차 있는 증가 수치를 나타내었다(p<0.05).
- 05). 양성 대조군으로 사용한 녹차 추출물에 비하여 60분 및 120분 시점에서는 후코이단은 각각 1.5배 및 1.3배의 cotinine 양이 측정되어 녹차 추출물 대비 효과가 우수한 것으로 평가되었다(Fig. 1).
- Nicotine의 cotinine으로의 전환량은 초기 1시간에서 2시간 경과 시점에서 약 2배가 증가하였고, 3시간 경과 시점에서는 4배가 증가하여 의미 있는 증가 수치를 나타내었다(p<0.05).
- 후코이단의 총 페놀 화합물과 플라보노이드의 함량은 각각 4.5±0.07 mg/g과 2.5±0.04 mg/g이었고, 녹차 추출물의 함량은 각각 74.5±2.9 mg/g과 20.8±3.4 mg/g이었다(Table 2).
- 녹차 추출물 처리에 의한 nicotine의 cotinine으로의 전환 정도는 초기 1시간에서 2시간 경과 시점에서 약 2배가 증가하였고, 3시간 경과 시점에서는 3배가 증가하여 의미 있는 증가 수치를 나타내었으나(p<0.05), 후코이단 대비 cotinine의 전환량의 증가 정도가 낮았다(Fig. 2).
- 2). 한편, 후코이단 및 녹차 추출물의 처리 시에 시료 자체 내에 포함이 되어 nicotine의 cotinine 전환으로 인한 실험의 오류를 점검하기 위하여 시료에서의 nicotine의 함량을 측정한 결과, 후코이단 및 녹차 추출물에는 전혀 nicotine이 검출되지 않았다(Table 1).
- 4 mg/g이었다(Table 2). 녹차 추출물의 총 페놀 화합물의 함량은 후코이단보다 16배 정도 높았고, 총 플라보노이드 함량도 후코이단보다 8배 정도 높게 측정이 되었다. Nicotine의 분해능을 위하여 직접혼합법과 세포주를 이용한 분해능의 측정에서 후코이단이 녹차 추출물 대비 분해능이 뛰어났으며, 그 효력을 나타내는 성분을 정확히는 알 수 없었다.
- 녹차 추출물의 총 페놀 화합물의 함량은 후코이단보다 16배 정도 높았고, 총 플라보노이드 함량도 후코이단보다 8배 정도 높게 측정이 되었다. Nicotine의 분해능을 위하여 직접혼합법과 세포주를 이용한 분해능의 측정에서 후코이단이 녹차 추출물 대비 분해능이 뛰어났으며, 그 효력을 나타내는 성분을 정확히는 알 수 없었다. 다만 천연물에서 항산화 효과가 뛰어난 것으로 알려진 페놀 화합물 및 플라보노이드 함량을 측정한 결과, 녹차 추출물이 높았으며, 이러한 높은 함량이 nicotine 분해능과는 관련이 없는 것으로 보였다.
- Nicotine의 분해능을 위하여 직접혼합법과 세포주를 이용한 분해능의 측정에서 후코이단이 녹차 추출물 대비 분해능이 뛰어났으며, 그 효력을 나타내는 성분을 정확히는 알 수 없었다. 다만 천연물에서 항산화 효과가 뛰어난 것으로 알려진 페놀 화합물 및 플라보노이드 함량을 측정한 결과, 녹차 추출물이 높았으며, 이러한 높은 함량이 nicotine 분해능과는 관련이 없는 것으로 보였다.
- 후코이단과 녹차 추출물의 항산화 효능은 Table 3과 같았다. 후코이단과 녹차 추출물의 항산화 효능은 각각 36% 및 70%이었다. Table 2의 결과와 같이 녹차 추출물은 후코이단보다 총 페놀 화합물과 총 플라보노이드 함량이 높았고, 항산화 효능은 총 페놀 화합물과 플라보노이드 함량과 비례하는 것으로 나타났다.
- 직접 혼합법 시험결과, 후코이단 1 μg/mL에서 시간이 경과함에 따라서 nicotine의 cotinine으로의 전환 정도가 대조군 대비 증가하여 시험 종료 시점에서 15배의 증가율을 나타내었다.
- 후코이단과 녹차 추출물의 항산화 효능은 각각 36% 및 70%이었다. Table 2의 결과와 같이 녹차 추출물은 후코이단보다 총 페놀 화합물과 총 플라보노이드 함량이 높았고, 항산화 효능은 총 페놀 화합물과 플라보노이드 함량과 비례하는 것으로 나타났다.
- 본 시험결과에서 후코이단은 기존에 nicotine의 cotinine으로의 전환 효과가 알려져 있는 녹차 추출물보다 그 전환능이 우수한 것으로 나타났으나, 그 기전에 관해서는 알 수 없었다. 녹차 추출물의 경우도 nicotine을 cotinine으로 전환한다는 보고가 있으나, 녹차의 어떤 성분들에 의한 것인지는 아직까지 알려진 바가 없고, 다만 폴리페놀과 플라보노이드 성분들이나 기타 성분들에 의한 전환 가능성만을 언급하고 있다(Yeo 등 1995).
- 녹차 추출물의 경우도 nicotine을 cotinine으로 전환한다는 보고가 있으나, 녹차의 어떤 성분들에 의한 것인지는 아직까지 알려진 바가 없고, 다만 폴리페놀과 플라보노이드 성분들이나 기타 성분들에 의한 전환 가능성만을 언급하고 있다(Yeo 등 1995). 하지만 본 시험결과에서는 후코이단의 경우, 녹차추출물에 비하여 폴리페놀 및 플라보노이드 성분 함량이 적었고, 또한 그로 인한 항산화능 역시 떨어졌다. 따라서 항산화 성분에 의하여 nicotine이 cotinine으로 전환된다고는 할 수 없었다.
- 따라서 항산화 성분에 의하여 nicotine이 cotinine으로 전환된다고는 할 수 없었다. 본 시험 결과의 의의는 후코이단의 nicotine의 cotinine으로의 전환능에 대한 입증을 하였으며, 이는 금연 보조제로서의 기존의 천연식물 추출물과 함께 기능성 식품으로 후코이단 역시 사용 가능하다는 기능성의 발견에 있다고 할 수 있겠다. 하지만 그 기전 및 성분에 관하여서는 향후 추가적 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 직접 혼합법 시험결과, 후코이단 1 μg/mL에서 시간이 경과함에 따라서 nicotine의 cotinine으로의 전환 정도가 대조군 대비 증가하여 시험 종료 시점에서 15배의 증가율을 나타내었다. 세포주을 이용한 nicotine의 분해능 시험 결과, 시험 종료 시점에서 대조군 대비 6배의 cotinine 증가율을 나타내었다. 양성 대조군으로 사용한 녹차 추출물 대비 nicotine 분해능은 우수한 것으로 평가되었다.
- 세포주을 이용한 nicotine의 분해능 시험 결과, 시험 종료 시점에서 대조군 대비 6배의 cotinine 증가율을 나타내었다. 양성 대조군으로 사용한 녹차 추출물 대비 nicotine 분해능은 우수한 것으로 평가되었다. 그러나 후코이단의 항산화능은 녹차 추출물과 대비하여 낮았으며, 항산화 주요 기능을 갖는 폴리페놀 및 플라보노이드 성분 역시 낮았다.
- 양성 대조군으로 사용한 녹차 추출물 대비 nicotine 분해능은 우수한 것으로 평가되었다. 그러나 후코이단의 항산화능은 녹차 추출물과 대비하여 낮았으며, 항산화 주요 기능을 갖는 폴리페놀 및 플라보노이드 성분 역시 낮았다. 본 시험 결과가 나타내는 바는 후코이단의 nicotine의 cotinine으로의 전환능에 대한 입증을 하였으며 이는 금연 보조 역할을 할 수 있는 기능성 소재로 사료된다.
후속연구
- 본 시험 결과의 의의는 후코이단의 nicotine의 cotinine으로의 전환능에 대한 입증을 하였으며, 이는 금연 보조제로서의 기존의 천연식물 추출물과 함께 기능성 식품으로 후코이단 역시 사용 가능하다는 기능성의 발견에 있다고 할 수 있겠다. 하지만 그 기전 및 성분에 관하여서는 향후 추가적 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 그러나 후코이단의 항산화능은 녹차 추출물과 대비하여 낮았으며, 항산화 주요 기능을 갖는 폴리페놀 및 플라보노이드 성분 역시 낮았다. 본 시험 결과가 나타내는 바는 후코이단의 nicotine의 cotinine으로의 전환능에 대한 입증을 하였으며 이는 금연 보조 역할을 할 수 있는 기능성 소재로 사료된다.
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