[국내논문]사람 폐 섬유아 세포에서 Brunfelsia grandiflora 에탄올 추출물이 Autophagy에 미치는 영향 The Effect of Brunfelsia grandiflora Ethanol Extract on the Induction of Autophagy in Human Lung Fibroblasts원문보기
이 연구의 목적은 사람 폐 섬유아세포인 IMR 90 에서 Brunfelsia grandiflora 에탄올 추출물(BGEE)이 SIRT1 및 p53 활성화를 통해 autophagy의 유도에 대한 효과를 조사한 것이다. BGEE는 $5{\mu}g/ml$ 이상의 농도에서 IMR 90 세포에서 세포독성을 나타내었다. 본 연구에서 처음으로 BGEE가 autophagy를 유도 하는 것이 발견되었다. 또한, BGEE는 $2.5{\mu}g/ml$ 이하에서 Beclin-1 및 $5{\mu}g/ml$ 이상에서 Atg7 의 활성화가 autophagy의 유도에 관여함을 확인하였다. 더욱이 BGEE는 autophagy와 관련된 단백질 발현을 조절하였는데 p53 및 p-p53 단백질 발현이 세포독성이 없는 농도의 BGEE존재하에서 감소되었다. 하였다. 반면에, SIRT1의 발현수준은 세포독성이 없는 농도의 BGEE로 처리된 IMR 90 세포에서 증가되었다. 더욱이 BGEE로 처리된 사람 페 섬유아세포에서 노화 마커의 지표인 SA-${\beta}$-gal staning이 감소되는 것이 관찰되었다. 이상의 발견들은 BGEE는 사람 폐 섬유아세포에서 p53 및 SIRT1의 조절을 통하여 autophagy 및 항노화 유발을 촉진 시키는 것을 시사하고 있다.
이 연구의 목적은 사람 폐 섬유아세포인 IMR 90 에서 Brunfelsia grandiflora 에탄올 추출물(BGEE)이 SIRT1 및 p53 활성화를 통해 autophagy의 유도에 대한 효과를 조사한 것이다. BGEE는 $5{\mu}g/ml$ 이상의 농도에서 IMR 90 세포에서 세포독성을 나타내었다. 본 연구에서 처음으로 BGEE가 autophagy를 유도 하는 것이 발견되었다. 또한, BGEE는 $2.5{\mu}g/ml$ 이하에서 Beclin-1 및 $5{\mu}g/ml$ 이상에서 Atg7 의 활성화가 autophagy의 유도에 관여함을 확인하였다. 더욱이 BGEE는 autophagy와 관련된 단백질 발현을 조절하였는데 p53 및 p-p53 단백질 발현이 세포독성이 없는 농도의 BGEE존재하에서 감소되었다. 하였다. 반면에, SIRT1의 발현수준은 세포독성이 없는 농도의 BGEE로 처리된 IMR 90 세포에서 증가되었다. 더욱이 BGEE로 처리된 사람 페 섬유아세포에서 노화 마커의 지표인 SA-${\beta}$-gal staning이 감소되는 것이 관찰되었다. 이상의 발견들은 BGEE는 사람 폐 섬유아세포에서 p53 및 SIRT1의 조절을 통하여 autophagy 및 항노화 유발을 촉진 시키는 것을 시사하고 있다.
The purpose of this study was to investigate the effect of Brunfelsia grandiflora ethanol extract (BGEE) on the induction of autophagy via regulation of SIRT1 expression and p53 activation in a human lung fibroblast cell line, IMR 90. BGEE at a concentration of $5{\mu}g/ml$ or more exhibi...
The purpose of this study was to investigate the effect of Brunfelsia grandiflora ethanol extract (BGEE) on the induction of autophagy via regulation of SIRT1 expression and p53 activation in a human lung fibroblast cell line, IMR 90. BGEE at a concentration of $5{\mu}g/ml$ or more exhibited a cytotoxic effect on IMR 90 cells. For the first time, this study showed that BGEE induces autophagy in normal human lung fibroblasts. BGEE also increased the expression level of beclin-1 at $2.5{\mu}g/ml$ or less and Atg7 at $5{\mu}g/ml$, both of which are known to be involved in the induction of autophagy. In addition, BGEE modulated the expression of other proteins related to autophagy in normal human lung fibroblasts. The expression levels of p53 and p-p53, an active form of p53, were decreased in the presence of BGEE at a noncytotoxic concentration. In contrast, the expression level of SIRT1 was increased in human lung fibroblasts treated with BGEE at a noncytotoxic concentration. Moreover, SA-${\beta}$-Gal staining, an aging marker, was reduced in the normal human lung fibroblasts treated with BGEE. These findings suggest that BGEE promotes the induction of autophagy and antiaging through the modulation of p53 and SIRT1 in human lung fibroblasts.
The purpose of this study was to investigate the effect of Brunfelsia grandiflora ethanol extract (BGEE) on the induction of autophagy via regulation of SIRT1 expression and p53 activation in a human lung fibroblast cell line, IMR 90. BGEE at a concentration of $5{\mu}g/ml$ or more exhibited a cytotoxic effect on IMR 90 cells. For the first time, this study showed that BGEE induces autophagy in normal human lung fibroblasts. BGEE also increased the expression level of beclin-1 at $2.5{\mu}g/ml$ or less and Atg7 at $5{\mu}g/ml$, both of which are known to be involved in the induction of autophagy. In addition, BGEE modulated the expression of other proteins related to autophagy in normal human lung fibroblasts. The expression levels of p53 and p-p53, an active form of p53, were decreased in the presence of BGEE at a noncytotoxic concentration. In contrast, the expression level of SIRT1 was increased in human lung fibroblasts treated with BGEE at a noncytotoxic concentration. Moreover, SA-${\beta}$-Gal staining, an aging marker, was reduced in the normal human lung fibroblasts treated with BGEE. These findings suggest that BGEE promotes the induction of autophagy and antiaging through the modulation of p53 and SIRT1 in human lung fibroblasts.
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문제 정의
이 식물은 전통적인 약재로 열병, 류머티즘, 매독 그리고 관절염의 치료에 타고난 범위에서 이용되어 왔다[5]. 이러한 약리적 성질 외에는 그 과학적 효능이 검증되어 있지 않아 자체적인 연구를 통해 노화와 관련된 효능을 알아보고자 한다. 결과적으로 현대인의 건강증진과 수명연장에 매우 중요한 노화관련 질환에서 Brunfelsia grandiflora의 중요성이 잘 알려져 있지 않아, 이를 바탕으로 향후 과학적인 효능연구 및 기전에 대한 연구가 필요한 것으로 전망된다.
제안 방법
BGEE의 항노화 효과 및 autophagy에 관여하는 단백질 발현을 조사하기 위하여 Atg7, Beclin-1, p53, p-p53과 SIRT1 단백질 발현을 조사하였다. Fig.
대상 데이터
세포 배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin / streptomycin / amphotericin (각각 10,000 U/ml, 10,000 μg/ml 및 2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (USA)로부터 구입하였다. IMR 90 cell line (human lung fibroblast)은 ATCC (American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하였다.
세포 배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin / streptomycin / amphotericin (각각 10,000 U/ml, 10,000 μg/ml 및 2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (USA)로부터 구입하였다. IMR 90 cell line (human lung fibroblast)은 ATCC (American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하였다. MTT reagent, gelatin, agarose와 기타시약은 Sigma Chemical Co.
Louis, MO, USA)로 부터 구입하였다. 본 실험에 사용된 Brunfelsia grandiflora 시료는 한국생명 공학 연구원의 해양생물소재허브센터에서 분양을 받아 진행하였다. 95%의 ethyl alcohol 용매에 추출되었으므로 BGEE라 명명하였고, 시험농도로 희석되어 본 연구에 사용되었다.
데이터처리
각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 시료농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다. 각 시료 농도군에 대한 유의검정은 대조군과 비교하여 Student’s t test한 후 *p<0.
각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 시료농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다. 각 시료 농도군에 대한 유의검정은 대조군과 비교하여 Student’s t test한 후 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.
이론/모형
Hansen [8]의 방법에 IMR 90 세포에 대한 BGEE의 세포독성을 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.
BGEE가 세포독성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. IMR-90 세포에 대한 BGEE의 세포독성을 측정한 결과, Fig.
BGEE가 IMR-90 세포의 노화를 억제하는지의 여부를 확인하기 위하여 노화마커로 잘 알려진 SA-β-gal staining assay를 수행하였다. Fig.
성능/효과
4에서는 형광염색을 통한 autophagy의 유도효과를 알아 보았는데, autophagy를 나타내는 autophagosome은 형광화합물인 monodansylcadaverine (MDC)에 의해 검출 하였고, 핵은 propidium iodide로 형광염색되었다. 결과적으로, tamoxifen 뿐만 아니라 BGEE가 autophagy를 유발시킬 수 있다는 것을 유안적으로 확인하였으며, 몇몇 죽은 세포들에서도 autophagosome이 생성됨이 관찰되었다.
노화는 유전정보의 손상이 축적됨에 따른 현상으로 설명할 수 있어 유전정보의 안정성을 유지하는 것이 노화의 진행을 막고 수명을 연장하는 데 중요하다[14]. BGEE을 IMR 90 세포에 농도별로 처리하여 노화의 지표를 측정하기 위해 β-galactosidase에 의해 X-gal의 분해가 일어나 파란색을 띄게 되는[6] SA-β-gal assay를 수행한 결과, 농도가 증가 할수록 SA-β-gal 염색이 감소함을 알 수 있었다. 이를 통해 BGEE가 항노화 효과를 가지고 있다는 가능성을 추측해 볼 수 있다.
그 동안 자가포식에 의한 세포 내 소기관의 끊임없는 사멸과 재생의 생리적 기능 및 임상적 의미가 불분명하였으나, 최근 관련 연구가 진행되면서 자가포식과 각종 질병 또는 노화의 관련성이 제시되고 있다[19]. BGEE를 처리한 세포군에서 autophagy를 유도하였을 뿐만 아니라 몇몇 죽은 세포들은 자주빛을 나타내어 autophagosome이 생성됨을 확인하였다. 단백질 수준에서 BGEE의 항노화 효과 및 autophagy에 관여하는 단백질 발현을 조사한 결과 BGEE를 처리한 사람의 정상적인 폐섬유아세포인 IMR-90에서 Beclin-1 및 Atg7의 발현수준이 저 농도와 고농도에서 각각 증가하는 것으로 보아 autophagy가 유도 되었음을 확인하였고, p53와 p-p53 및 SIRT1발현수준은 세포독성이 없는 농도에서 감소한 반면에, 세포독성이 있는 농도에서는 발현이 감소하였다.
BGEE를 처리한 세포군에서 autophagy를 유도하였을 뿐만 아니라 몇몇 죽은 세포들은 자주빛을 나타내어 autophagosome이 생성됨을 확인하였다. 단백질 수준에서 BGEE의 항노화 효과 및 autophagy에 관여하는 단백질 발현을 조사한 결과 BGEE를 처리한 사람의 정상적인 폐섬유아세포인 IMR-90에서 Beclin-1 및 Atg7의 발현수준이 저 농도와 고농도에서 각각 증가하는 것으로 보아 autophagy가 유도 되었음을 확인하였고, p53와 p-p53 및 SIRT1발현수준은 세포독성이 없는 농도에서 감소한 반면에, 세포독성이 있는 농도에서는 발현이 감소하였다. 이전의 연구에서 세포질내의 p53은 autophagy에 대하여 억제하는 조절작용이 있는 것으로 보고되어 p53 유전자를 낙아웃시키면 autophagy가 자극된다는 보고가 있는데 이러한 보고는 본 연구의 결과와 일치된다[21].
Fig. 2B에서는 SA-β-gal staining을 정량하여 blank군의 SA-β-gal staining 수준을 100%로 하여 상대적인 값을 그래프로 나타내었는데, BGEE는 농도 의존적으로 IMR 90 세포의 노화를 억제함을 알 수 있었다.
후속연구
이러한 약리적 성질 외에는 그 과학적 효능이 검증되어 있지 않아 자체적인 연구를 통해 노화와 관련된 효능을 알아보고자 한다. 결과적으로 현대인의 건강증진과 수명연장에 매우 중요한 노화관련 질환에서 Brunfelsia grandiflora의 중요성이 잘 알려져 있지 않아, 이를 바탕으로 향후 과학적인 효능연구 및 기전에 대한 연구가 필요한 것으로 전망된다.
이러한 단백질의 발현이 autophagy 및 항노화에 영향을 미칠 수 있다고 판단된다. 아직까지 노화의 정도를 손쉽게 측정할 수 있으며 재현성 있게 평가할 수 있는 측정 지표가 마련되지 않았다는 점이 노화 연구를 수행하는 데 한계점으로 임상단계에서 적용할 수 있는 노화의 지표 개발이 필요할 것으로 예상된다[9]. 그러므로 본 결과들은 BGEE가 정상세포인 사람의 폐 섬유아 세포에서 Autophagy활성을 유도하여 노화를 예방하고 낡은 세포 내 소기관은 소멸시키고 새로운 세포 내 소기관을 재생하는데 필요한 영양 공급원으로 autophagy 관련 단백질의 발현을 증가 시켜 여러 질병의 치료의 주성분으로서 잠재적인 가능성이 기대된다.
아직까지 노화의 정도를 손쉽게 측정할 수 있으며 재현성 있게 평가할 수 있는 측정 지표가 마련되지 않았다는 점이 노화 연구를 수행하는 데 한계점으로 임상단계에서 적용할 수 있는 노화의 지표 개발이 필요할 것으로 예상된다[9]. 그러므로 본 결과들은 BGEE가 정상세포인 사람의 폐 섬유아 세포에서 Autophagy활성을 유도하여 노화를 예방하고 낡은 세포 내 소기관은 소멸시키고 새로운 세포 내 소기관을 재생하는데 필요한 영양 공급원으로 autophagy 관련 단백질의 발현을 증가 시켜 여러 질병의 치료의 주성분으로서 잠재적인 가능성이 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
노화현상이란?
노화현상은 외부 자극에 대한 반응성이 저하되고 항상성을 유지할 수 있는 능력이 감퇴되어, 외부 스트레스에 취약해지고 질병에 대한 저항성이 감소하여 만성 질환의 가능성이 높아지는 변화 과정으로 정의될 수 있다[7]. 활성산소는 세포를 손상시켜 노화를 유발시킴과 동시에 우리 몸에서 필요한 에너지를 얻기 위한 대사 과정에서 생성된다[22].
Brunfelsia grandiflora는 어떠한 질병 치료에 이용되어왔는가?
외형적으로 보았을 때 번갈아 배열된 각각 12인치 길이의 잎이 밀집되어 있고 거의 매년 향기로운 꽃을 피우며 하얗고 자주 빛을 띤다[11]. 이 식물은 전통적인 약재로 열병, 류머티즘, 매독 그리고 관절염의 치료에 타고난 범위에서 이용되어 왔다[5]. 이러한 약리적 성질 외에는 그 과학적 효능이 검증되어 있지 않아 자체적인 연구를 통해 노화와 관련된 효능을 알아보고자 한다.
노화와 관련된 질환들의 원인은?
노화의 자유 라디칼 가설은 최근까지도 지속적인 학문적 관심의 대상으로 많은 연구가 이루어 졌으며, 일부 보고에서 항산화 능력을 증가시킬 때 세포 손상이 줄어드는 긍정적인 결과를 보였다[20]. 즉 체내에서 생성된 산화제(proxidant)와 항산화제가 불균형을 이루었을 때 산화 스트레스에 의한 세포 손상이 초래되고 이것들이 지속적으로 축적될 때 기관의 기능이 저하되고 노화와 관련된 질환들, 즉 심혈관계 질환, 암, 당뇨병, 치매 등의 원인이 된다[12]. 이러한 현상은 자가포식(autophagy)과 연관이 있는 것으로 세포 자가 포식작용이 제대로 작동되지 않으면 노화가 가속되는 것으로 설명하고 있다[18].
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