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문제 정의
- 이상의연구를통해최근까지대표적인천식유발기전으로인정되고있는호산구의상피세포로 의 이동 및 상피세포에서 호산구의 침윤을 통한 만성염증반응의 유발에 관여하는 화학주성 관련 cytokine의유전자발현및화학주성의기전에대 해五味구가미치는영향과관련하여유의한결과 를얻었기에이를보고하고자한다.
- -1β 로자극한후五味구를시간별로처리하여발현된 유전자를 geneontology로 분석하여 molecular function위주로분석하였다.이를통해염증과관련 된주요특이유전자발현의증감을관찰함으로써 五味구에의한항염증작용기전을밝혀五味구의 효과를극대화를위한연구에활용하고자하였다.
제안 방법
- 이에본저자는기존의기관지천식연구를토대로하고현대과학기술의발달로얻어진유전자칩 (genechip)과그분석기술12을이용함으로써인간기 관지상피세포에서 천식 유발에 관여하는 다양한 pathway에 五味구가 어떠한 영향을 미치는지 oligonucleotidemicroarray를통하여 유전자 발현을 분석하였다.
- Korea) 에서구입하였다.본실험에서 세포배양을 위하여 사용된 media는 10% FetalBovineSerum(FBS, Hyclone, USA), 1% penicillin/streptomycin(BDBioscience, USA)25mM HEPES(MPBiomedicals, LLC, Germany), 2g sodiumbicarbonate(NaHCO3, JRHBIOSCIENCES, USA)가 포함된 RPMI-1640(BD Bioscience, USA)를사용하여37℃에서5%CO2와95%공기 를함유한습도가유지되는조건에서배양하였다.
- " data-before="IL" data-ocr-fix="">Ⅱ.-450ng/㎖과IL-1 β 10ng/㎖을세포에처리한후오미자0.1㎍/㎖의 농도에서 30분, 1, 3, 6시간동안각각37℃에서5% CO2와95%공기를함유한습도가유지되는조건 에서배양하였다.
- 3의방법과같이배양한A549cellpellet을PBS 로세척하고Trizolsolution(Invitrogen, USALife Technologies, USA)에제조사의protocol에준하여 totalRNA를 분리하였다.Cellpellet에 200㎕의 Trizolreagent를넣고pelletpestle(Sigma-Aldrich, USA)로마쇄한후300㎕의Trizolreagent를더넣 은다음반응액을실온에서5분간배양하고, 원심분리하는과정을반복하여totalRNA를분리하였 다.
- 분리된totalRNA는spectrophotometer(ND-1000, NanoDropTechnologiesInc.USA)로측정하였다. 분리된totalRNA는1%agarosegel에서전기영동 하고ethidium-bromide(Et-Br, Sigma-Aldrich, USA) 로염색하여상태를평가하였다.
- USA)로측정하였다. 분리된totalRNA는1%agarosegel에서전기영동 하고ethidium-bromide(Et-Br, Sigma-Aldrich, USA) 로염색하여상태를평가하였다.
- USA)로측정하였다. 분리된totalRNA는1%agarosegel에서전기영동 하고ethidium-bromide(Et-Br, Sigma-Aldrich, USA) 로염색하여상태를평가하였다.
- cDNA정제를위하여합성된cDNA에600㎕의 cDNAbindingbuffer를첨가한뒤3초동안회오 리처럼 흔들어서 잘 섞고 이 중에서 500㎕의 sample을취하여cDNAcleanupcolumn에넣은후 1분동안12, 000×g에서원심분리하기를반복하고, 정제된ds-cDNA는 1% agarose gel에서 전기영동 후, ethidium-bromide(Et-Br, Sigma-Aldrich, USA) 로염색하여상태를평가하였다.
- cRNA정제를위하여합성된cRNA에350㎕의 cDNAbindingbuffer를첨가한뒤3초동안회오 리처럼흔들어서잘섞어250㎕의100%ethanol을 넣고피펫으로계량하여섞어주고700㎕의sample 을취하여cRNAcleanupcolumn에넣은후15초 동안 12,000×g에서 원심 분리하기를 반복하였다. 분리된 cRNA는 spectrophotometer(ND-1000, NanoDropTechnologiesInc.
- 반복하였다. 분리된 cRNA는 spectrophotometer(ND-1000, NanoDropTechnologiesInc.USA)로측정하였다. 분리된totalRNA는1%agarosegel에서전기영동 하고 ethidium-bromide(Et-Br, Sigma-Aldrich, USA)로염색하여상태를평가하였다.
- 40㎕의반응액은94℃에서35분간배양 하여35-200bp의분절이되게하였다.1%agarose gel에서 전기영동하고 ethidium-bromide(Et-Br, Sigma-Aldrich, USA) 로염색하여분절상태를평가하였다.
- Hybridization반응이종료된genechipeGenechip FluidicsStation(Affymetrix)의mini_euk1protocol 에 따라 세척 및 염색한 후 GenechipSystem ConfocalScanner(Hewlett-Packard)를이용하여3 μmresolution으로두번scan하여평균값을취하 였다.
- 각군의cDNA, cRNA및fragmentedcRNA는 1㎍을1%agarosegel에전기영동하여size분포를 평가하였다.
- 4을이용하여분석하였다. Hybridization의 완전성은 control oligonucleotideB2, bioB, bioC, bioD, cre의signal 을비교함으로써평가하였다.
- 각 시간(30분, 1, 3과 6시간)에 대해서 五味子 처리유무에따라probeset의발현이일정수준 이상변화하는유전자를찾기위해comparison분 석을시행하였다.각각시간대별로control에비해五 味구투여군에서발현차이가나는유의유전자를선별 하는데발현차이는FoldChangecutoff=2(2-fold)로 하여2배이상발현되거나(Up-regulated)2배이하 발현되는(Down-regulated)유전자를선별하는데, 이때모든샘플에서실험상에서발현이나타나지 않은유전자즉, detection이“Absent”인 유전자를 제거하였다.
- 석을시행하였다.각각시간대별로control에비해五 味구투여군에서발현차이가나는유의유전자를선별 하는데발현차이는FoldChangecutoff=2(2-fold)로 하여2배이상발현되거나(Up-regulated)2배이하 발현되는(Down-regulated)유전자를선별하는데, 이때모든샘플에서실험상에서발현이나타나지 않은유전자즉, detection이“Absent”인 유전자를 제거하였다.(NC:Negativecontrol, SF:Schizandrae Fructus, C:Positivecontrol, 1:30min, 2:1hr, 3 :3hr, 4:6hr) 아래테이블에나타난수치는각기준에따라선정된probeset의개수이다.
- 구처리후시간에 따라 유사한 발현패턴을 나타내는 probeset을 grouping하기 위해 clustering 분석을 수행하였다.분석의 대상은 AffymetrixHGU133Plus2의총54675개의유전자 중에서NegativeControl, 30min, 1hr, 3hr, 6hr모든샘플에서표준편차(SD:StandardDeviation)가큰 순서대로10, 000개의 유전자를 선정하여 진행하였다.
- 이에저자는오미자의효능을검증하기위하여 유전자발현조사도구로대규모유전자발현을검 색할수있고광범위한유전자발현상태를분석할 수 있는 인간의 유전자 54675여개가 탑재된 oligonucleotidechipmicroarray를이용하였다.염증 세포들의활성화와생존을증가시켜급성및만성 적인기도염증반응을조절하는능동적인세포인 기관지상피세포(A549cell)에 Th2 cell계통의 proinflammatorycytokine인 IL-4, TNF-α, " data-before="IL" data-ocr-fix="">Ⅱ.-1β 로자극한후五味구를시간별로처리하여발현된 유전자를 geneontology로 분석하여 molecular function위주로분석하였다.이를통해염증과관련 된주요특이유전자발현의증감을관찰함으로써 五味구에의한항염증작용기전을밝혀五味구의 효과를극대화를위한연구에활용하고자하였다.
- 구를A549에투여한후시간별(30min, 1hr, 3hr, 그리고6hr) 로배양하여totalcRNA를분리하고 totalcRNA에서 mRNA를 정제하고 double strandcDNA를합성하였다.Biotin-labeledcRNA 를 합성하고 cRNA를 분절화한 후 genechip hybridization, 염색 및 scanning을 하였으며, oligonucleotidechip(AffiyMetrix사)을사용하였다.
- strandcDNA를합성하였다.Biotin-labeledcRNA 를 합성하고 cRNA를 분절화한 후 genechip hybridization, 염색 및 scanning을 하였으며, oligonucleotidechip(AffiyMetrix사)을사용하였다.
- 구투여후대조군과비교하여30min, 1hr, 3hr과6hr시간대별유전자발현을genechip결과 에서발현된유전자를분석하여보았다.DAplot 을통해lowintensity에서발현이주로일어나는 것을확인하였고, 그 중 log 값이 4배 이상 또는 이하 발현된유전자중30min, 1hr, 3hr과6hr시간대에공통적으로발현된유전자를DEGselection하 여 살펴보았고 overexpression된 것과 down expression된 유전자를 molecularfunction위주로분석하였다.
- 에서발현된유전자를분석하여보았다.DAplot 을통해lowintensity에서발현이주로일어나는 것을확인하였고, 그 중 log 값이 4배 이상 또는 이하 발현된유전자중30min, 1hr, 3hr과6hr시간대에공통적으로발현된유전자를DEGselection하 여 살펴보았고 overexpression된 것과 down expression된 유전자를 molecularfunction위주로분석하였다.특히genechip을통하여A549에서유 전자발현양상을확인한결과발현량이유의한차 이를보인유전자중호산구의접근, 유착, 경내피이동그리고염증과연관된중요한유전자를검색 하였다.
- DAplot 을통해lowintensity에서발현이주로일어나는 것을확인하였고, 그 중 log 값이 4배 이상 또는 이하 발현된유전자중30min, 1hr, 3hr과6hr시간대에공통적으로발현된유전자를DEGselection하 여 살펴보았고 overexpression된 것과 down expression된 유전자를 molecularfunction위주로분석하였다.특히genechip을통하여A549에서유 전자발현양상을확인한결과발현량이유의한차 이를보인유전자중호산구의접근, 유착, 경내피이동그리고염증과연관된중요한유전자를검색 하였다.
- 구가천식에미치는영향을알아보고자인간기관지상피세포주인A549cell에五味구를처리하고 30min, 1hr, 3hr과 6hr시간대별로 oligonucleotide chip을 이용하여 발현된 유전자의 발현 양상을 geneontology로분석하여 molecular function 위주로 분석하고, 다양한 유전자들의 발현양상을 평가한바 다음과 같은결론을얻었다.
대상 데이터
- 인간기관지상피세포주A549(HumantypeⅡ-like epithelialcells)cellline을 KoreanTypeCulture Collection(Seoul, Korea) 에서구입하였다.본실험에서 세포배양을 위하여 사용된 media는 10% FetalBovineSerum(FBS, Hyclone, USA), 1% penicillin/streptomycin(BDBioscience, USA)25mM HEPES(MPBiomedicals, LLC, Germany), 2g sodiumbicarbonate(NaHCO3, JRHBIOSCIENCES, USA)가 포함된 RPMI-1640(BD Bioscience, USA)를사용하여37℃에서5%CO2와95%공기 를함유한습도가유지되는조건에서배양하였다.
- )BAILL.)는썬텐제약(SuntenPharmaceutical Co, Taipei, Taiwan)으로 부터 구입하였다.1g의오미자분무건조물에는0.
- USA)로정량한후각 각3㎍을ds-cDNA합성에사용하였다.cDNA합 성eGeneChip®Expression3'-AmplificationOne- CyclecDNASynthesiskit(AffymetrixInc.USA) 를사용하였다.
- biotin-labeledcRNA합성에사용되었다.Biotin-labeledcRNA합성eGeneChip® Expression3'-AmplificationReagentforInvitro transcript(IVT)LabelingKit(AffymetrixInc., USA)를사용하였다.
- FragmentedcRNA15㎍를 GeneChip®Human GenomeU133Plus2.0Array(P/N900470, Affymetrix Inc., USA)에적용하였다.일련의과정은제조사의추천대로standardformat으로GeneChip®Hybridization, WashandStainkit를이용하여protocol을따랐다
- 분석을 수행하였다.분석의 대상은 AffymetrixHGU133Plus2의총54675개의유전자 중에서NegativeControl, 30min, 1hr, 3hr, 6hr모든샘플에서표준편차(SD:StandardDeviation)가큰 순서대로10, 000개의 유전자를 선정하여 진행하였다.
데이터처리
- Genechip의 scandata는 GeneChipversion5 software(Affymetrix)과 GenPlexv2.4을이용하여분석하였다. Hybridization의 완전성은 control oligonucleotideB2, bioB, bioC, bioD, cre의signal 을비교함으로써평가하였다.
- Pathway는입력데이터(발현값을갖는유전자리 스트)의KEGGpathway목록과해당pathway의 p-value를계산하여분석하였다.
이론/모형
- 군집분석(Clusteringanalysis)은 계층적 군집 (Hierarchicalclustering)연산방식을 이용하였다. Pathway는입력데이터(발현값을갖는유전자리 스트)의KEGGpathway목록과해당pathway의 p-value를계산하여분석하였다.
성능/효과
- 또한IL-8 eIL-5, RANTES 등과 함께 복합적으로 호산구의화학주성에관여하는것으로보고되었으며20, 특히호중구와동시에활성화되었을때에만호산구 의경기저세포막이동이증대되는것으로확인되었 다.따라서이결과를통해五味구추출액이IL-8 의발현을억제함으로써호중구와호산구의침윤 을능동적으로억제하여천식및기도개형과관련 된 염증반응을 치료할 수 있다는 사실을 추측할 수 있었다.
- ICAM-1과VCAM-1은이러한유착상 태의 활성화를 기관지 병소에서도 수행함으로서염증세포, 특히호산구의기관지침윤을매개한다는점에서치료의중요한목표분자로인식되고있 다.실험결과로볼 때 五味子 추출액은 호산구의 침윤 시 기관지 상피세포의 ICAM-1, VCAM-1유전자 발현을 억제함으로써 호산구가 혈관으로부터경내피로이동하여기관지상피조직으로침윤하는 마지막과정에도영향을미치는것으로파악할수 있었다.五味구가기도의염증반응을다양한측면 에서 억제하여 천식치료에 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 실험결과로볼 때 五味子 추출액은 호산구의 침윤 시 기관지 상피세포의 ICAM-1, VCAM-1유전자 발현을 억제함으로써 호산구가 혈관으로부터경내피로이동하여기관지상피조직으로침윤하는 마지막과정에도영향을미치는것으로파악할수 있었다.五味구가기도의염증반응을다양한측면 에서 억제하여 천식치료에 효과가 있음을 알 수 있었다.
- " data-ocr-fix="">수 있었다.이번연구를통하여五味구가기관지상 피세포에서 호산구의 침윤을 유도하는 PAFR, LTB4R, LTC4S, RANTES, 그리고MCP1R를억제하여호산구의이동과경기저세포막이동을유 의하게 저해함과 동시에 ICAM-1과 VCAM-1의발현을억제함으로써기관지상피세포로호산구침 윤을방해하고이를통해만성염증반응의억제에 효과가있는것으로유추할수 있었다.
- 1.A549cell에IL-4, TNF-α, IL-1β cytokine으로 자극하여 chemo kine의 발현을 유도한 후五味 子 추출액으로 처리한 결과, 염증에 관여하는 MMP2, MMP11, MMP14, MMP15, MMP16, MMP19, MMP25, MMP27그리고 MMP 28의 유전자 발현이 감소하는 경향을보였다.
- 3. 五味구추출액을 처리한 A549 cell에서세포이동에관여하는FN1, 그리고FNDC3B와호산구의 침윤 유도에 관여하는 PAFR, LTB4R, LTC4S, RANTES, 그리고 MCP 1R 와세포유착분자에 속하는 ITGB1, ITGBL1, SelectinP ligand, SelectinE, ICAM2, ICAM3, VCAM1, PECAM, 그리고 FCER1G의 발현이 감소하는 경향을 보였다.
- 2.五味子 추출액을 처리한 A549 cell에서 proinflammatorycytokine과 관련된 Ⅱ.1F8, IL1F9, IL1R1, IL1RN, IL1RAPL1, Ⅱ.8, TNFRSF4, TNFSF10c, TNFSF13, TRAF5, 그리고TRAF7의발현이감소하는경향을보였 다.
후속연구
- 이에 면역약물학적 연구에 의해 최근에는 cytokine과chemokine억제제, 유착분자차단제, 항 IgE치료와같은하향매체의억제와Th2활성화를 억제하거나새로운면역치료방법을이용한Th2표 현의 예방 및 억제와 T 림프구 기능의 직접적인 차단, 그리고흡입스테로이드제와베타자극제의병합요법등다양한약물에대한연구개발이진행 되고 있다.또한 앞으로는유전학적 연구를 통해천식관련유전자나혹은그유전자의단백을직 접조절하는약물의개발이촉진될수있을것이 다.
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