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문제 정의
- 본 연구에서는 감태에 있는 유효성분의 분리 및 정제를 위하여 소화효소인 rapidase press L과 rohament CL을 사용하여 감태분획물(enzyme-treated E. cava extracts; EEc)을 추출 하였고, 지방합성 경로를 차단하여 식욕억제 및 체중저하효과를 나타내는 것으로 알려져 있는 garcinia 추출물을(Hong et al., 2009) 양성 대조군으로 사용하여 감태의 항비만 효과를 in vivo 수준에서 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 5)에 넣어 마쇄한 후 원심분리(2,500×g, 4℃, 10 min) 하여 상층액을 회수하였다. BCA protein assay kit(Pierce Biotechnology, IL, USA)를 사용하여 단백질 농도를 측정한 후 동일한 농도의 단백질을 취하여 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)한 다음 Polyvinylidene fluroide (PVDF) membrane (Millipore, USA)에 transfer하였다. Membrane은 실온에서 1% BSA/TBS-T로 blocking 시킨 후, 1차 항체를 TBS-T에 1:1,000 비율로 희석하여 반응시켰다.
- EEc식이에 따른 혈청 중 triglyceride, total cholesterol, HDLcholesterol, LDL-cholesterol의 함량을 측정하였다(Table 5). 혈청 중 total cholesterol 함량은 ND군에 비하여 HFD군에서 119.
- 1차 항체 반응이 끝난 membrane을 TBS-T 용액으로 세척한 다음 2차 항체를 TBS-T에 1:10,000 비율로 희석하여 실온에서 반응 시켰다. Super signal west pico luminal/enhancer solution (Pierce Biotechnology, USA)을 사용하여 KODAK X-ray film에 감광시켜 나타나는 밴드로 단백질 발현 정도를 확인하였다.
- 간, 신장, 부고환과 주변지방을 적출하여 생리식염수에 세척 한 후 여과지로 여분의 물기를 제거하여 무게를 측정하고 액체 질소로 급속냉동 시킨 후 -70℃에서 냉동보관 하였다.
- 감태 칩(Taekyugnongsan, Jeju-do, Korea) 30 kg을 추출 탱크에 넣고 정제수 750 L와 2종의 효소 rapidase press L 0.3 kg, rohament CL 0.3 kg을 투입한 후 50℃에서 24시간 추출하였다. 추출 후 여과한 여액에 주정을 투입하여 18시간 침지하였다.
- 체중은 1주일에 1회, 일정한 시간에 측정하였으며 예비사육 직후의 체중을 초기(initial) 체중으로 하였고, 9주 후의 체중을 마지막(final) 체중으로 하여 체중 증가량을 계산하였다. 식이는 1일 1회 매일 일정한 시간에 규칙적으로 급이하고 다음 날 같은 시간에 잔량을 조사하여 1일 섭취량을 기록하였다. 식이효율은 체중 증가량을 9주간의 총 식이섭취량으로 나누어 계산하였다.
- 식이는 1일 1회 매일 일정한 시간에 규칙적으로 급이하고 다음 날 같은 시간에 잔량을 조사하여 1일 섭취량을 기록하였다. 식이효율은 체중 증가량을 9주간의 총 식이섭취량으로 나누어 계산하였다.
- 생후 4주령 C57BL/6NTac 수컷 mouse (15-18 g)를 샘타코(Samtako Bio Korea, Gyeonggi-do, Korea)에서 구입하여 시판되는 고형사료로 1주일간 예비사육 한 후, 10마리씩 6군으로 나누어 9주간 사육하였다. 실험동물의 분류는 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), garcinia 고지방혼합식이군(GHD), 감태분획물 (EEc) 고지방혼합식이군(EHD250, EHD500, EHD1000)으로 나누었으며, AIN-76 semipurified diet (MP0290545220, MP biomedicals, LLC, OH, USA)를 기본 사료로 사용하였다. 실험식이는 비만을 유도하기 위하여 지방함량을 총 열량의 37% 수준으로 증가시키고, 지질 급원으로 lard와 corn oil을 사용하였다.
- 실험동물의 분류는 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), garcinia 고지방혼합식이군(GHD), 감태분획물 (EEc) 고지방혼합식이군(EHD250, EHD500, EHD1000)으로 나누었으며, AIN-76 semipurified diet (MP0290545220, MP biomedicals, LLC, OH, USA)를 기본 사료로 사용하였다. 실험식이는 비만을 유도하기 위하여 지방함량을 총 열량의 37% 수준으로 증가시키고, 지질 급원으로 lard와 corn oil을 사용하였다. 실험식이에 첨가된 garcinia 추출물 및 효소를 이용한 EEc은 (주)주영엔에스(Ju Yeong NS Co.
- 실험식이에 첨가된 garcinia 추출물 및 효소를 이용한 EEc은 (주)주영엔에스(Ju Yeong NS Co., Ltd, Gangwon-do, Korea)로 부터 제공받았으며 garcinia 250 mg/kg/day, EEc 250, 500, 1,000 mg/kg/day로 조성하여 급이하였고, 사육실의 온도는 23±2℃, 습도 50±5%, 12 h light-dark cycle로 조절하였다.
- 본 연구에 사용된 감태(Ecklonia cava)는 제주산 감태원물을 구입하여 1차 세척하고 뿌리와 줄기 및 중심 잎을 제거한 가지 잎을 5 cm 내외가 되도록 세절하고 완전 건조하여 칩 형태로 제조한 것을 시료로 사용하였다. 염에 의한 영향이 있는지 확인하고자 시료 10 g을 25배수의 증류수에 2분간 교반하고 100 mesh sieve로 여과한 여과액을 염도 측정기(PAL-3, ATAGL, JAPAN)를 이용하여 측정하였다. 그 결과 0.
- 조직 내의 단백질 발현 변화를 관찰하기 위하여 간 조직을 RIPA buffer (1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5)에 넣어 마쇄한 후 원심분리(2,500×g, 4℃, 10 min) 하여 상층액을 회수하였다.
- 체중은 1주일에 1회, 일정한 시간에 측정하였으며 예비사육 직후의 체중을 초기(initial) 체중으로 하였고, 9주 후의 체중을 마지막(final) 체중으로 하여 체중 증가량을 계산하였다. 식이는 1일 1회 매일 일정한 시간에 규칙적으로 급이하고 다음 날 같은 시간에 잔량을 조사하여 1일 섭취량을 기록하였다.
- 혈청 중 glutamic oxaloacetic tansaminase (GOT), glutamic pyruvic tansaminase (GPT), total cholesterol (T-CHO), high density lipoprotein-cholesterol (HDL-C), low density lipoprotein-cholesterol (LDL-C) 함량은 혈액생화학측정기 (Thermo fisher Scientific, USA)를 이용하여 측정하였다. 혈청 중 triglyceride 함량은 TG 측정 kit (AM 157S-K, Asan Pharm, Seoul, Korea)를 사용하였고, 혈당 함량 및 혈청 leptin 농도는 glucose 측정 kit (AM 201-K, Asan Pharm)와 Leptin ELISA kit (ADI-900-019A, Enzo Life Sciences, Switzerland)를 사용하여 각각 측정하였다.
- 혈청 중 glutamic oxaloacetic tansaminase (GOT), glutamic pyruvic tansaminase (GPT), total cholesterol (T-CHO), high density lipoprotein-cholesterol (HDL-C), low density lipoprotein-cholesterol (LDL-C) 함량은 혈액생화학측정기 (Thermo fisher Scientific, USA)를 이용하여 측정하였다. 혈청 중 triglyceride 함량은 TG 측정 kit (AM 157S-K, Asan Pharm, Seoul, Korea)를 사용하였고, 혈당 함량 및 혈청 leptin 농도는 glucose 측정 kit (AM 201-K, Asan Pharm)와 Leptin ELISA kit (ADI-900-019A, Enzo Life Sciences, Switzerland)를 사용하여 각각 측정하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 감태(Ecklonia cava)는 제주산 감태원물을 구입하여 1차 세척하고 뿌리와 줄기 및 중심 잎을 제거한 가지 잎을 5 cm 내외가 되도록 세절하고 완전 건조하여 칩 형태로 제조한 것을 시료로 사용하였다. 염에 의한 영향이 있는지 확인하고자 시료 10 g을 25배수의 증류수에 2분간 교반하고 100 mesh sieve로 여과한 여과액을 염도 측정기(PAL-3, ATAGL, JAPAN)를 이용하여 측정하였다.
- 본 연구에 사용된 실험동물은 부경대학교 동물실험윤리위원 회의 승인을 받아 진행하였다(승인번호 2013-01). 생후 4주령 C57BL/6NTac 수컷 mouse (15-18 g)를 샘타코(Samtako Bio Korea, Gyeonggi-do, Korea)에서 구입하여 시판되는 고형사료로 1주일간 예비사육 한 후, 10마리씩 6군으로 나누어 9주간 사육하였다. 실험동물의 분류는 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), garcinia 고지방혼합식이군(GHD), 감태분획물 (EEc) 고지방혼합식이군(EHD250, EHD500, EHD1000)으로 나누었으며, AIN-76 semipurified diet (MP0290545220, MP biomedicals, LLC, OH, USA)를 기본 사료로 사용하였다.
데이터처리
- Within each column, values with different superscripts are significantly from each other (P<0.05), as determined by Duncan’s multiple range test.
- 각 군에 대한 유의성 검증은 ANOVA test와 Duncan's multiple range test를 P<0.05 수준에서 분석하였다.
- 모든 실험결과는 각 군별의 평균과 표준편차(mean±S.D.)로 나타내었으며, 각 실험군 간의 유의성은 SPSS ver. 18.0 프로그램을 사용하여 통계처리 하였다.
성능/효과
- 혈청 중 total cholesterol 함량은 ND군에 비하여 HFD군에서 119.9%로 급격한 증가를 나타내었으며, HFD군에 비해 EHD 군에서는 유의적인 감소를 보였다.
- , 2003). GOT 및 GPT 활성 변화를 측정한 결과 HFD군이 ND군에 비하여 유의적 증가를 보였고, EHD군에서 농도의존적으로 감소하였다. 이는 고지방 식이군에서는 간 조직 내에 지방 축적이 발생하여 GOT, GPT 활성이 증가하였으나, 증가된 GOT 및 GPT의 활성이 EEc식이군에서는 저하된 것으로 보아 EEc가 간 독성 예방 효과와 간 기능 회복에 효과를 나타낸 것으로 사료된다.
- HFD군이 144.5±16.25 mg/dL로 ND 군 74.4±12.84 mg/dL에 비하여 94.4% 증가하였으며 특히 EHD1000군은 52.5±13.34 mg/dL로 HFD군에 비하여 63.7% 감소하여 EHD군 중에서도 triglyceride의 축적이 가장 저해되 었음을 확인할 수 있었다.
- Triglyceride 함량 측정 결과, ND군과 HFD군에서는 유의적 차이를 나타내지 않았지만, HFD군에 비하여 GHD과 EHD군에서는 유의적인 감소경향을 나타내었다. 복부비만일수록 혈 중 triglyceride의 함량이 높은 것으로 알려져 있는데(Lee et al.
- 27 g/9 weeks보다도 더 낮은 체중 증가량을 보여 EEc에 의한 체중감소효과를 확인하였다. 각 군 별 식이효율은 HFD군은 ND군에 비해 80.6% 증가하였으며, EHD군은 ND군과 GHD군 수준과 유사하였다.
- 실험 종료 후 간, 신장과 부고환 장기 및 주변지방의 무게를 측정한 결과를 Table 3에 제시하였다. 간 무게 측정 결과 HFD군 에 비하여 GHD군과 EHD군에서 유의적 감소를 나타내었으며, 특히 EHD1000군은 HFD군에 비하여 34.4% 감소하여 양성 대조군인 GHD군보다도 감소하는 경향을 나타내었다. 신장 및 부고환 주변지방의 무게는 HFD군에 비하여 GHD군, EHD 군에서 유의적인 감소를 나타내었고, EEc 농도에 따른 유의적 차이는 나타나지 않았다.
- 9%로 급격한 증가를 나타내었으며, HFD군에 비해 EHD 군에서는 유의적인 감소를 보였다. 또한 LDL-cholesterol함량은 ND군에 비하여 HFD군에서 70.2% 증가하였고, HDL-cholesterol함량은 HFD군에 비하여 유의적인 증가는 보이지 않았으나 EHD250군, EHD500군에서 각각 129.3 mg/dL, 123.9 mg/dL로 8.8%, 8.35%의 증가를 보여주었다. HDL-cholesterol 및 LDL-cholesterol은 체내 cholesterol을 운반하는 역할을 하며, 특히 LDL-cholesterol의 경우 체내 다른 조직에 cholesterol을 축적하여 심혈관계 질환의 발병의 원인이 된다(Imano et al.
- 마우스의 간에서 회수한 단백질로 지방생성억제효과를 western blot을 통해 분석한 결과, HFD군에서는 CCAAT/enhancerbinding proteins (C/EBP) family의 발현이유의적으로 증가하고, EHD군에서 농도의존적으로 감소하는 것을 관찰할 수 있다(Fig. 3). C/EBP family는 갈색지방세포와 백색지방세포에 서 발현되는 전사인자로 C/EBPβ와 C/EBPδ는 지방세포 분화초기 단계에서 발현이 증가되고 C/EBPα는 분화과정의 후 반기에 발현이 촉진되는 인자로 알려져 있다(Cowherd et al.
- Triglyceride 함량 측정 결과, ND군과 HFD군에서는 유의적 차이를 나타내지 않았지만, HFD군에 비하여 GHD과 EHD군에서는 유의적인 감소경향을 나타내었다. 복부비만일수록 혈 중 triglyceride의 함량이 높은 것으로 알려져 있는데(Lee et al., 2011), 본 연구에서도 부고환 주변 지방의 무게가 가장 많았던 HFD군에서 혈중 triglyceride 함량이 증가되는 것을 확인할 수 있었다(Table 5).
- , 2011). 본 실험 결과, EEc는 고지방식이에 의하여 증가된 total cholesterol 및 LDL-cholesterol 함량의 수치를 감소시켜 비만에 의한 고지혈증, 심혈관계 질환의 위험성을 줄여줄 것으로 여겨진다.
- Kwon은 감태의 polyphenol 추출물인 seanol을 비만 모델 마우스에 경구 투여한 결과 체중과 식이효율에서 감소효과를 나타내었는데, 이는 seanol이 영양소의 소화흡수에 영향을 미쳐 체중 및 식이효율이 감소된 것이라고 하였다(Kwon, 2013). 본 실험에서는 고지방식이에 인한 체중 증가가 EEc섭취에 의하여 정상식이군 수준으로 감소되는 것을 확인하였다. 즉, 비만을 유도한 그룹과 비교하여 EEc를 고지방식이와 혼합하여 급이한 그룹의 경우 농도의존적인 체중저하 효과를 확인할 수 있었다.
- 지방조직에서 분비되는 leptin의 양은 지방세포의 수, 크기와 관련이 있으며 지방조직의 양이 감소하면 혈중 leptin의 양이 줄어드는 것으로 알려져 있다(David and Michael, 2004). 본 연구에서 혈중 leptin의 농도는 ND군에 비하여 HFD군에서 유의적인 증가를 나타내었고, EHD군에서 농도에 따른 유의적인 감소는 나타나지 않았으나 HFD군에 비하 여 유의적인 감소를 보였다. 특히 EHD1000군의 혈중 leptin 농도는 171.
- , 2010). 본 연구에서는 EHD군에서 C/EBP family 발현이 감소함을 확인하였는데, 이는 EEc가 지방세포 생성을 억제하고 triglyceride 생성을 감소시킴으로써 항비만효과를 나타내는 것으로 사료된다.
- 4% 감소하여 양성 대조군인 GHD군보다도 감소하는 경향을 나타내었다. 신장 및 부고환 주변지방의 무게는 HFD군에 비하여 GHD군, EHD 군에서 유의적인 감소를 나타내었고, EEc 농도에 따른 유의적 차이는 나타나지 않았다.
- 본 실험에서는 고지방식이에 인한 체중 증가가 EEc섭취에 의하여 정상식이군 수준으로 감소되는 것을 확인하였다. 즉, 비만을 유도한 그룹과 비교하여 EEc를 고지방식이와 혼합하여 급이한 그룹의 경우 농도의존적인 체중저하 효과를 확인할 수 있었다.
- 9주간의 실험기간 동안 변화된 체중과 식이섭취량, 식이효율을 측정한 결과를 Table 4에 나타내었다. 체중 증가량은 실험 종료 직후 체중(final)에서 예비사육 직후의 무게(initial)를 뺀 것으로 나타내었으며, HFD군에 비하여 GHD군 및 EHD군에서 유의적인 감소를 나타내었다. 특히, EHD1000군은 6.
- 본 연구에서 혈중 leptin의 농도는 ND군에 비하여 HFD군에서 유의적인 증가를 나타내었고, EHD군에서 농도에 따른 유의적인 감소는 나타나지 않았으나 HFD군에 비하 여 유의적인 감소를 보였다. 특히 EHD1000군의 혈중 leptin 농도는 171.9 pg/mL로 HFD군(617.4 pg/mL)에 비해 73.0% 감소되었다. Hong et al.
- 특히, EHD1000군은 6.4±0.34 g/9 weeks로 ND군 7.2±0.27 g/9 weeks보다도 더 낮은 체중 증가량을 보여 EEc에 의한 체중감소효과를 확인하였다.
- 혈청 glucose 함량 측정 결과 HFD군은 226.4±12.66 mg/dL로 ND군에 비하여 유의적인 증가를 나타내었고, EHD250, EHD500, EHD1000군은 각각 166.2±13.13 mg/ dL, 137.9±16.44 mg/dL, 123.0±14.04 mg/dL으로 HFD군에 비하여 26.6%, 39.1%, 45.7%씩 감소하였다.
후속연구
- 7%씩 감소하였다. 이러한 결과는 해조류에 다량 함유되어있는 알긴산이 포도당의 흡수를 저해하여 혈중 glucose 수치를 낮추어 주었다는 연구결과(Lee et al., 2004)와 동일하게 본 연구의 EEc 또한 비만에 의한 당뇨병 및 내당능 장애에 효과가 있을 것으로 사료된다.
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