[논문]치마버섯 균사체 배양물로부터 분리한 다당류의 항산화 및 면역 활성

이준우

doi:10.3746/jkfn.2014.43.9.1334

치마버섯 균사체 배양물로부터 분리한 다당류의 항산화 및 면역 활성
Antioxidant and Immunological Activities of Polysaccharide Extracted from Cultured Mycelia of Schizophyllum commune 원문보기

한국식품영양과학회지 = Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, v.43 no.9, 2014년, pp.1334 - 1341

이준우 (경북전문대학교 호텔조리제빵과)

초록
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치마버섯 균사체 배양물로부터 분리된 다당류의 생리활성을 알아보기 위해 항보체 활성, NO 생성능, 지질 과산화 억제능, OH radical 제거 효과, 미백효과, 항균효과 및 피부투과도를 측정하였다. 치마버섯 배양균사체 유래 다당류의 항보체 활성은 열수 추출 알코올침전분획(SC-EP)이 $8.9{\pm}0.3%$, 세포내성 다당류(SC-IP)는 $14.7{\pm}1.7%$, 열수 추출 한외여과분획(SC-UP)은 $10.2{\pm}0.8%$, 균사체외성 무처리 분획(SC-NEP)은 $5.2{\pm}0.7%$로 나타났다. 치마버섯 균사체 배양물의 열수 추출 한외여과 처리한 다당류(SC-UP)는 $12.8{\pm}0.7{\mu}M$의 NO를 생성하는 것으로 조사되었다. 양성 대조물질로 사용한 IFN-${\gamma}$와 LPS에서는 각각 $33.4{\pm}1.7{\mu}M$과 $35.1{\pm}1.5{\mu}M$로 나타났다. AsA-$Fe^{2+}$로 유도된 지질 과산화에 대한 영향은 열수 추출 에탄올 처리 분획(SC-EP) 및 UF 처리 분획(SC-UP)의 경우 각각 $28.9{\pm}0.7nM$ 및 $26.5{\pm}0.3nM$의 MDA를 생성시켰다. ADP-NADPH-$Fe^{3+}$로 유도된 지질 과산화에 대한 영향은 배양 균사체 배양물의 열수 추출 에탄올 처리 분획(SC-EP) 및 UF 처리 분획(SC-UP)이 각각 19.8%와 20.8%의 지질 과산화 생성 억제율을 나타내었다. OH radical의 제거 효과로 균사체 배양물의 열수 추출 UF 처리 분획(SC-UP)의 OH radical 제거 효과에 대한 $IC_{50}$은 3.32 mg/mL로 조사되었다. 균사체 배양물의 열수 추출 UF 처리 분획(SC-UP)의 tyrosinase 저해 효과는 1.0 mg/mL의 농도 처리 시에 19.9%로 나타났다. 또한 여드름 균에 대한 항균효과를 위한 MIC 치는 균사체 배양물의 열수 추출 UF 처리 분획(SC-UP)이 10 mg/mL, 균사체외성 다당류(SC-NEP)의 경우는 20 mg/mL 이상인 것으로 조사되었다. 균사체 배양물의 열수 추출 UF 처리 분획(SC-UP)의 피부투과도는 3시간, 6시간 및 9시간 경과 후 각각 0.47%, 0.73% 및 1.20%를 나타내었다. 상기의 결과들로부터 치마버섯 균사체 배양물로부터 분리된 다당류의 면역 활성, 항산화 활성 등의 생물학적 특성을 이용하여 기능성 소재의 개발이 가능할 것으로 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

To examine the biological activity of polysaccharide extracted from cultured mycelia of Schizophyllum commune, we determined anti-complementary activity and nitric oxide production as a measure of immunological activity, anti-lipidperoxidation and hydroxy radical scavenging activity as a measure of antioxidative activity, tyrosinase inhibitory activity, anti-microbial activity, and transdermal flux of polysaccharide extracted from cultured mycelia of S. commune. Polysaccharide extracted from S. commune activated the complementary system and produced nitric oxide in RAW 264.7 macrophages. Antioxidant activities as malondialdehyde values were $49.5{\pm}0.7$, $39.7{\pm}1.7$, $39.2{\pm}1.2$, and $2.6{\pm}0.5nM/mL$ for control, extracellular polysaccharide extracted from S. commune (SC-EP), ultrafiltrated polysaccharide extracted from S. commune (SC-UP), and butylated hydroxytoluene, respectively. Hydroxy radical scavenging activity ($IC_{50}$) of SC-UP and mannitol were 3.32 and 1.66 mg/mL, respectively. Tyrosinase inhibitory activities of SC-UP, arbutin, and kojic acid were 19.9%, 31.8%, and 99.0%, respectively. Anti-microbial activities of SC-UP appeared to be low, and transdermal fluxes of SC-UP were 0.47%, 0.73%, and 1.20% after 3, 6, and 9 hr, respectively. These findings suggest that polysaccharide extracted from S. commune has potential immunological and antioxidant activities.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 치마버섯으로부터 순수 분리된 균사체를 대량배양 하여 얻은 다당류의 면역 활성을 위해서는 항보체활성과 nitric oxide 생성능, 항산화능을 위해서는 지질과산화 억제능과 hydroxy radical 저해능을 조사하였고, 기타로는 미백효과, 항균효과 및 피부투과도를 측정하였다. 이와 같은 기능성 확인을 통하여 식품, 화장품 및 산업용 소재로 활용하기 위한 기초자료로 이용하고자 한다.
본 연구에서는 치마버섯으로부터 순수 분리된 균사체를 대량배양 하여 얻은 다당류의 면역 활성을 위해서는 항보체활성과 nitric oxide 생성능, 항산화능을 위해서는 지질과산화 억제능과 hydroxy radical 저해능을 조사하였고, 기타로는 미백효과, 항균효과 및 피부투과도를 측정하였다. 이와 같은 기능성 확인을 통하여 식품, 화장품 및 산업용 소재로 활용하기 위한 기초자료로 이용하고자 한다.

제안 방법

간략하면 100 μL의 배양액과 동량의 Griess reagent(1% sulfanilamide, 0.1% naphthylene diamine dihydrochloride, 2.5% H3PO4)를 가하여 실온에서 10분 동안 반응시킨 후, 540 nm에서 ELISA reader(Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA)를 이용하여 측정하였다.
에탄올 분획(SC-EP)은 치마버섯 균사체 배양액에 3배의 물을 가해 100°C에서 2시간 동안 추출하고, 7,000×g에서 20분간 원심분리 하여 얻어진 상등액에 2배량의 에탄올을 첨가한 후 24시간 동안 방치하여 침전시킨 것을 투석하여 동결 건조하였다. 균사체내성 분획(SCIP)은 치마버섯 균사체 배양액을 원심분리 하여 얻어진 침전물에 10% NaOH 용액을 5배량 첨가한 다음 24시간 동안 추출하고 빙초산으로 중화(pH 7.0)하여 에탄올을 3배량 첨가하여 침전물을 투석하고 동결 건조하였다. 한외여과막을 이용한 다당류(SC-UP) 제조는 균사체 배양액에 3배의 물을 가해 100°C에서 2시간 동안 추출하고, 7,000×g에서 20분간 원심분리 하여 얻어진 상등액은 한외여과(membrane, MW 10 kD)를 실시하여 동결 건조하였다.
대조군은 mL당 44.6±2.0 nM의 MDA를 생성시켰으며, 치마버섯 균사체 배양물의열수 에탄올 처리 분획(SC-EP) 및 UF 처리 분획(SC-UP)의 경우 각각 28.9±0.7 nM 및 26.5±0.3 nM의 MDA를 생성시켰다.
보체 활성은 Yamada 등(19)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시험관에 150 μL의 GVB²⁺ buffer(0.
5 MEDTA를 가하고 혼합하여 반응을 중단시킨 다음 400×g에서 5분간 원심분리 하여 상등액을 얻은 다음 541 nm에서 흡광도를 측정하였다. 보체의 활성은 대조군의 total com-plement hemolytic activity에 대한 저해율(ITCH₅₀, %)로 표시하였다.
에탄올 분획(SC-EP)은 치마버섯 균사체 배양액에 3배의 물을 가해 100°C에서 2시간 동안 추출하고, 7,000×g에서 20분간 원심분리 하여 얻어진 상등액에 2배량의 에탄올을 첨가한 후 24시간 동안 방치하여 침전시킨 것을 투석하여 동결 건조하였다.
투과도의 측정은 다음과 같이 실시하였다. 전 처리된 guinea pig 피부를 실험장치 위에 올려놓아 고정시킨 다음, 정제수에 녹인 시료1 mL를 피부 위에 적하하여 일정시간 경과 후에 진피 층으로 이동한 용액의 일부를 취하여 총 당을 측정하였다.
접종이 끝난 평판을 37°C에서 약 18~24시간 배양 후 육안으로 관찰하여 생육이 억제된 항생제 농도를 MIC로 정하였다.
조제된 시험균은 접종 tray에 200 μL씩 넣고 반자동 접종기를 이용하여 항균 물질이 들어 있는 평판 위에 균을 접종하였다.
치마버섯 균사체 배양물로부터 분리된 다당류의 생리활성 을 알아보기 위해 항보체 활성, NO 생성능, 지질 과산화 억제능, OH radical 제거 효과, 미백효과, 항균효과 및 피부투과도를 측정하였다. 치마버섯 배양균사체 유래 다당류의 항보체 활성은 열수 추출 알코올침전분획(SC-EP)이 8.
치마버섯 배양균사체의 열수 추출 및 에탄올(SC-EP), UF 처리하여 얻어진 다당류(SC-UP)의 지질 과산화 억제활성을 조사하기 위하여 in vitro에서 간 microsome에 시료를 가한 후, 비효소적인 방법으로 유도시켜 생성된 MDA의 양을 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. 대조군은 mL당 44.
치마버섯 유래 다당류 및 대조물질은 각 well에 10 μg/mL 농도로 가하여 37°C에서 5% CO2 in-cubator에서 24시간 동안 배양한 후 NO를 측정하였다.
1% 내외인 것으로 알려졌다(8). 치마버섯도 균사체 배양물의 분획별 다당류 수율로 에탄올 분획(SC-EP)은 0.32%, 균사체내성 분획(SC-IP)은 0.19%, 한외여과 분획(SC-UP)은 0.26%, 균사체외성 다당류(SC-NEP)는 1.63%인 것으로 보고하였으나(16), 산업화를 위한 대량생산의 용이성과 경제성을 고려하여 본 연구에서 사용된 다당류는 한외여과 분획(SC-UP)을 중심으로 하였다.
한외여과막을 이용한 다당류(SC-UP) 제조는 균사체 배양액에 3배의 물을 가해 100°C에서 2시간 동안 추출하고, 7,000×g에서 20분간 원심분리 하여 얻어진 상등액은 한외여과(membrane, MW 10 kD)를 실시하여 동결 건조하였다.
효소적 지질 과산화 유발에 대한 영향을 조사하기 위하여 치마버섯 배양 균사체의 열수 추출 에탄올 처리 및 UF 처리하여 얻은 다당류에 microsome을 가한 후 생성된 MDA의 양을 측정한 결과는 Fig. 2와 같다. 무첨가 대조군에서는 mL당 49.

대상 데이터

Mouse의 복강대식세포나 RAW 264.7 대식세포는 부착성 세포로서 단층 배양을 하였고, 배양을 위한 배지로서는 streptomycin(100 μg/mL)과 penicillin(100 U/mL)이 함유된 DMEM에 1 M HEPES buffer 용액 10 mL, sodium bicarbonate 3.7 g 및 불활성화 시킨 fetal bovine serum 10%(v/v)를 사용하였으며, 세포는 petri-dish를 이용하여 2~3일마다 계대 배양하여 사용하였다.
보체 실험을 위한 혈청은 삼육축산(Eumseong, Korea)에서 구입한 guinea pig로부터 분리하여 사용하였다. 적혈구로 면양적혈구는 한국 메디아(Seongnam, Korea), 토끼는 삼육축산의 적혈구를 사용하였으며, 항체는 antisheep hemolysin(Difco Co.
본 배양은 종균 배양한 배양액을 5 L 발효조(Kobiotech Co., Incheon, Korea)에 5%(v/v) 되게 접종하고, working volume 3 L, 교반속도 150 rpm, 통기량 0.5 vvm으로 하여 27.5°C에서 6일간 배양한 균사체를 조다당류 제조에 이용하였다.
본 연구에 사용된 치마버섯은 자연산 자실체로부터 무균적으로 분리한 균사를 potato dextrose agar(PDA, DifcoCo.)에서 27.5°C, 10일 동안 배양한 후 순수 분리된 균사체를 이용하였다.
여드름 균액은 16~18시간 배양한 균액 12 μL를 Fleisch Extract Broth(FEB) 1 mL로 혼합하여 제조하였다.
, San Jose, CA, USA)을 사용하였다. 완충액 조제를 위해 barbital은 Merck 사(Darmstadt, Hessen, Germany), gelatin과 MgCl₂는 Sigma 사(St. Louis, MO, USA)의 것을 사용하였다. RPMI 1640, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지 및 fetal new born calf serum은 GIBCO 사(Grand Island, NY, USA), streptomycin 및 penicillin, LPS(E.
보체 실험을 위한 혈청은 삼육축산(Eumseong, Korea)에서 구입한 guinea pig로부터 분리하여 사용하였다. 적혈구로 면양적혈구는 한국 메디아(Seongnam, Korea), 토끼는 삼육축산의 적혈구를 사용하였으며, 항체는 antisheep hemolysin(Difco Co., San Jose, CA, USA)을 사용하였다. 완충액 조제를 위해 barbital은 Merck 사(Darmstadt, Hessen, Germany), gelatin과 MgCl₂는 Sigma 사(St.
치마버섯 유래 다당류의 여드름균에 대한 항균효과는 P. acnes ATCC11827, P. acnes ATCC11828 및 P. acnes ATCC6919 등의 균주를 이용하여 실험을 수행하였다 (Table 5). 천연물에서 얻어지는 다당류의 항균효과는 일반적으로 MIC 치가 약 100 mg/mL인 것으로 알려지고 있다(36).
치마버섯 유래 다당류의 피부 흡수율을 측정하기 위하여 실험에 사용한 피부로 guinea pig는 삼육축산으로부터 구입하여 사용하였다. 피부는 guinea pig의 머리 부분과 다리부분 사이인 등 및 배 부분 피부를 적출하여 알루미늄 호일로 감싸 -4°C에서 냉동보관 하였다.

데이터처리

본 실험에서의 통계처리는 Student t-test를 이용하였고, 결과는 평균±표준편차로 표시하였으며 P-value를 구하여 유의성을 검정하였다.

이론/모형

After incubation at 37°C for 20 min with ADP-NADPH-Fe3+, the lipid peroxide was measured by the method of Ohkawa et al. (22).
After incubation at 37°C for 20 min with ascorbate-Fe2+, the lipid peroxide was measured by the method of Ohkawa et al. (22).
Microsome은 Kiso 등(21)의 방법에 따라 얻었다. 간략하면 pentobarbital로 마취된 흰쥐를 개복하여 50 mL용 주사기로 50 mM Tris-Cl buffer(pH 7.
Microsome을 이용한 in vitro 지질 과산화 반응의 유도는 Kiso 등(21)의 방법에 따라 비효소적 지질 과산화 유도를 위해서는 ascorbic acid(AsA)와 Fe²⁺, 효소적 지질 과산화는 ADP, NADPH와 Fe^3＋를 이용하여 지질 과산화를 유도하였다. 지질 과산화 정도는 Ohkawa 등(22)의 방법에 준하여 표준물질로 1,1,3,3-tetramethoxypropane(TMP)을 이용하여 표준곡선을 작성하고 시료의 지질 과산화물(malondialdehyde, MDA) 양을 측정하였다.
치마버섯 유래 다당류 및 대조물질은 각 well에 10 μg/mL 농도로 가하여 37°C에서 5% CO₂in-cubator에서 24시간 동안 배양한 후 NO를 측정하였다. 대식세포에 의해 생성되는 NO는 Ding 등(20)의 방법에 따라 정량하였다. 간략하면 100 μL의 배양액과 동량의 Griess reagent(1% sulfanilamide, 0.
를 이용하여 지질 과산화를 유도하였다. 지질 과산화 정도는 Ohkawa 등(22)의 방법에 준하여 표준물질로 1,1,3,3-tetramethoxypropane(TMP)을 이용하여 표준곡선을 작성하고 시료의 지질 과산화물(malondialdehyde, MDA) 양을 측정하였다. 또한 지질 과산화 억제정도는 다음의 계산식으로 표시하였다.
치마버섯 유래 다당류의 OH radical의 제거 효과는 Aruoma(23)의 방법에 따라 2-deoxy-ribose method로서 hydroxy radical(OH․)에 의한 2-deoxy-ribose의 fragmentation 유발 방법을 사용하였다. 간략하면 potassium phosphate buffer(20 mM, pH 7.
치마버섯 유래 다당류의 미백 효과는 Ishihara 등(24)의 방법을 이용하였다. 적정량의 검체 15 μL를 96 well plate에 넣고, 0.

성능/효과

3 nM의 MDA를 생성시켰다. ADP-NADPH-Fe³⁺로 유도된 지질 과산화에 대한 영향은 배양 균사체 배양물의열수 추출 에탄올 처리 분획(SC-EP) 및 UF 처리 분획(SCUP)이 각각 19.8%와 20.8%의 지질 과산화 생성 억제율을 나타내었다. OH radical의 제거 효과로 균사체 배양물의 열수 추출 UF 처리 분획(SC-UP)의 OH radical 제거 효과에 대한 IC₅₀은 3.
또한 여드름 균에 대한 항균효과를 위한 MIC 치는 균사체 배양물의 열수 추출 UF 처리 분획(SC-UP)이 10 mg/mL, 균사체외성 다당류(SC-NEP)의 경우는 20 mg/mL 이상인 것으로 조사되었다. 균사체 배양물의 열수 추출 UF 처리 분획(SC-UP)의 피부투과도는 3시간, 6시간 및 9시간 경과 후 각각0.47%, 0.73% 및 1.20%를 나타내었다. 상기의 결과들로부터 치마버섯 균사체 배양물로부터 분리된 다당류의 면역 활성, 항산화 활성 등의 생물학적 특성을 이용하여 기능성 소재의 개발이 가능할 것으로 판단된다.
무첨가 대조군에서는 mL당 49.5±0.7 nM의 MDA가 생성되었으며, 배양 균사체 배양물의 열수 추출 에탄올 처리 분획(SC-EP) 및 UF 처리 분획(SC-UP)은 각각 19.8%와 20.8%의 지질 과산화 생성 억제율을 나타내었다.
20%의 투과도를 나타내었다(Table 6). 물질의 피부 투과 흡수는 물질의 분자량, pH, 전하 및 외부 상태 등에 영향을 받는 것으로 알려졌다. 일반적으로 분자량 500 Da 이하는 잘 통과하고, 패취제는 1~3%, gel 제제는 5% 정도의 투과도를 갖는 것으로 알려졌다(39).
치마버섯 균사체의 배양물을 추출하여 분리한 다당류의 미백효과를 알아보기 위하여 melanin 합성의 초기 단계에 관여하는 tyrosinase의 활성 저해를 측정한 결과를 Table4에 나타내었다. 배양 균사체 배양물의 열수 추출 UF 처리분획(SC-UP)의 tyrosinase 저해 효과는 1.0 mg/mL의 농도 처리 시에 19.9%로 나타났다. 미백 화장품의 첨가 원료로 많이 사용하고 있는 arbutin(31)과 kojic acid(32)는 동일 농도에서 각각 31.
간 microsome에 의한 지질 과산화는 NADPH cytochrome P-450과 NADPH(ADP-Fe3+)가 관여하는 효소적 반응과 ascorbate-Fe2+가 관여하는 비효소적 반응에 의해 야기된다(21). 상기의 결과들로부터 치마버섯 배양 균사체 유래 다당류는 효소 작용에 의해 발생된지질 과산화를 억제하였을 뿐만 아니라 비효소적인 지질 과산화에 대한 억제능을 가지는 것으로 조사되었으므로, 치마버섯 배양균사체 유래 다당류는 세포막 또는 간세포의 보호에도 일정한 역할을 할 수 있을 것으로 여겨진다.
3 nM의 MDA를 생성시켰다. 양성 대조군으로 사용한 BHT의 지질 과산화 억제율은 94.2%로 높게 나타났으나 UF 처리 분획(SC-UP)은 40.6%로 조사되어 어느 정도는 지질 과산화에 대한 억제능을 갖는 것으로 조사되었다.
7%로 조사되었다. 추출 및 제조 방법을 달리하여 얻어진 치마버섯 균사체 유래 다당류는 보체계를 활성화 시키는 것으로 나타났다.
치마버섯 유래 다당류를 임상에 적용하기 위해서는 피부투과도가 매우 중요한 요소이다. 치마버섯 균사체 배양물을 열수 추출하여 한외여과장치를 이용하여 얻은 다당류(SC-UP)에 guinea pig의 피부투과도는 3시간, 6시간 및 9시간경과 후, 각각 0.47%, 0.73% 및 1.20%의 투과도를 나타내었다(Table 6). 물질의 피부 투과 흡수는 물질의 분자량, pH, 전하 및 외부 상태 등에 영향을 받는 것으로 알려졌다.
치마버섯 배양균사체 유래 다당류의 항보체 활성은 열수 추출 알코올침전분획(SC-EP)이 8.9±0.3%, 세포내성 다당류(SC-IP)는 14.7±1.7%, 열수 추출 한외여과분획(SC-UP)은 10.2±0.8%, 균사체외성 무처리 분획(SC-NEP)은 5.2±0.7%로 나타났다.
치마버섯 배양균사체의 유래 다당류의 항보체 활성은 열수 추출 알코올침전분획(SC-EP)이 8.9±0.3%, 균사체내성다당류(SC-IP)는 14.7±1.7%, 열수 추출 한외여과분획(SC-UP)은 10.2±0.8%, 균사체외성 무처리분획(SC-NEP)은 5.2±0.7%로 나타났다.

후속연구

20%를 나타내었다. 상기의 결과들로부터 치마버섯 균사체 배양물로부터 분리된 다당류의 면역 활성, 항산화 활성 등의 생물학적 특성을 이용하여 기능성 소재의 개발이 가능할 것으로 판단된다.
치마버섯 액체배양 여액을 알코올 침전하고 투석하여 얻은 다당류는 세균 및 염증과 관계되는 세균과 곰팡이의 성장을 억제하는 것으로 보고하였으며, 상처 치유에도 효과적인 것으로 보고하였다(38). 이러한 결과들로부터 치마버섯 유래 다당류는 피부보호를 위한 화장품 및 상처 치유를 위한 소재로의 활용이 가능할 것으로 여겨진다.
생체 내에서 free radical에 의한 세포 손상은 지질 과산화에 의한 막 구조의 파괴와 이들의 중간 산물에 의해 독성작용뿐만 아니라, 생체 내에서 생성된 OH radical은 반응성이 아주 강하여 DNA를 손상시키고 탐식세포에 의해 생성되는 superoxide radical과 이들에 의해 생성된 hydrogen peroxide 등과 같이 염증반응에 깊이 관여하고 있는 것으로 알려졌다(30). 즉 OH radical의 제거 효과는 free radical에 의한 세포 조직의 상해에 따라 형성되는 반응물들에 의한 염증반응을 억제하는 데 기여할 것으로 여겨진다.
일반적으로 분자량 500 Da 이하는 잘 통과하고, 패취제는 1~3%, gel 제제는 5% 정도의 투과도를 갖는 것으로 알려졌다(39). 치마버섯 유래 다당류를 직접 임상에 적용시키기 위해서는 피부투과도 상승에 대한 제제학적 연구가 수반되어야 할 것으로 생각된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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