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문제 정의
- 본 연구에서는 높은 활성을 갖는 재조합 FfIBP를 Pichia pastoris의 유가식 배양을 통해 생산함에 있어 최적 배양 조건을 찾고자 하였다. 다양한 온도 및 pH 조건하에서 재조합 FfIBP 생산하고 분비된 단백질을 정량하고 TH 활성을 비교하였다.
제안 방법
- Protino Ni-NTA agarose로 충전된 컬럼을 NPI-5 (5 mM imidazole) 용액으로 평형화한 후, 불순물이 제거된 상등액을 공급하여 주었다. 10배 부피의 NPI-15 (15 mM imidazole)를 컬럼에 2회 주입하여 컬럼에 결합하지 않은 단백질을 제거한 후, NPI-300 (300 mM imidazole) 용액으로 FfIBP 단백질을 용출하였다. 정제된 FfIBP 단백질 용출액을 10-K cut-off Amicon Ultra-15 필터 (Merck Millipore, Germany) 원심분리 농축한 후 20 mM Tris–HCl (pH 8) 용액으로 완충액 전환시켰다.
- 6 mL/h L의 초기 속도로 주입하였다. DO-stat 유가식 배양은 1분 단위로 용존산소 농도를 측정하여 설정농도인 공기포화농도의 20% 이하로 내려가면 메탄올 용액의 주입을 멈추었다가 다시 회복되면 주입을 하는 식으로 수행하였다.
- FfIBP는 남극세균유래의 결빙방지단백질이므로 온도를 낮추는 것이 단백질 생산에 유리할 수 있으므로 배양액의 pH를 5로 유지시키고 온도를 25℃로 낮추어 생산을 시도하였다. 최대 세포농도는 발현 유도 95시간 후 84 g/L 였고, 120시간 후에는 81 g/L로 감소하였다 (Fig.
- 23 g/L에 해당하는 값이다. FfIBP의 발현은 SDS-PAGE로 확인하였고, 결빙방지 활성은 온도이력 (Thermal hysteresis, TH)을 측정하여 확인하였다. TH 활성은 배양액을 적절하게 희석하여 Nanoliter Osmometer (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand)를 이용하여 측정하였다 [7].
- FfIBP의 생산을 위한 유가식 배양은 메탄올을 탄소원 및 발현유도체로 사용하여 7-L 발효조 (Kobiotech, Incheon, Korea)에서 다양한 온도와 pH 하에서 수행되었다. YPD 배지에서 30℃, 200 rpm, 20시간 동안 배양한 종배양액은 미량금속원소가 13.
- FfIBP의 이종발현은 플라즈미드 벡터 pPICZαA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 호스트 균주 Pichia pastoris X-33 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 수행하였다 [12].
- AY30 (이전 Leucosporidium으로 명명)으로부터 약 25 kDa의 결빙방지단백질 LeIBP (Leucosporidium ice-binding protein)을 분리하여 특성연구를 수행해오고 있다 [7-9]. LeIBP의 대량생산을 위해 재조합 Pichia pastoris에 코돈 최적화된 유전자를 삽입하여 실험실 규모 (7 L)의 유가식 배양을 통해 최적생산 조건을 찾았고 (25℃, pH 6), 파일롯 규모 (700 L)에서 rLeIBP (recombinant LeIBP)를 300 mg/L 생산하였다 [10]. 한편, rLeIBP의 온도이력 (Thermal hysteresis, TH) 활성은 0.
- FfIBP의 발현은 SDS-PAGE로 확인하였고, 결빙방지 활성은 온도이력 (Thermal hysteresis, TH)을 측정하여 확인하였다. TH 활성은 배양액을 적절하게 희석하여 Nanoliter Osmometer (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand)를 이용하여 측정하였다 [7].
- 본 연구에서는 높은 활성을 갖는 재조합 FfIBP를 Pichia pastoris의 유가식 배양을 통해 생산함에 있어 최적 배양 조건을 찾고자 하였다. 다양한 온도 및 pH 조건하에서 재조합 FfIBP 생산하고 분비된 단백질을 정량하고 TH 활성을 비교하였다.
- 배양액의 pH 5, 30℃에서 유가식 배양할 경우 시간에 따른 FfIBP의 TH활성을 비교하였다. TH활성은 발현유도 후에 급격하게 증가하여 24시간이 되면 0.
- 1 mL 함유된 3L의 FBS 배지가 들어있는 발효조에 접종되었다. 배양액의 pH를 5.0으로 유지하면서 배양온도 25℃ 또는 30℃에서 FfIBP를 생산하였고, 배양온도를 30℃로유지하면서 배양액의 pH를 6.0으로 변경하여 발효를 수행하였다. 배양액의 pH는 암모니아수를 자동적으로 주입하여 유지하였다.
- 세포의 농도는 건조중량 (Dry cell weight, DCW)를 측정하여 표시하였으며 간접적으로 분광광도계 (Ultrospec 3300 pro, Amersham Biosciences, USA)로 600 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 흡광도 OD=1은 DCW=0.
- 결빙방지단백질 LeIBP의 최적조건 탐색에 관한 선행연구에서 pH 6에서 생산성이 pH 5에서의 생산성보다 높았다 [10]. 이러한 결과를 반영하여 배양액의 pH를 6으로 조절하면서 30℃에서 P. pastoris를 배양하면서 메탄올을 투입하여 FfIBP의 발현을 유도하였다. 이 경우 최대 세포농도는 발현 유도 72시간 후 86 g/L였고, 120시간 후에 84 g/L로 약간 감소하였다 (Fig.
- 재조합 결빙방지 단백질을 생산하는 최적의 온도 및 pH 조건을 탐색하기 위하여 pH 5 또는 6에서 각각 30℃ 및 25℃에서 P. pastoris를 배양하면서 FfIBP를 생산하였다.
- 42였으며 이는 야생형 LeIBP와 유사한 값이었다. 최근에 본 연구팀에서는 남극 호냉성 세균 Flavobacterium frigoris PS1으로부터 결빙방지단백질 (FfIBP)을 분리하여 LeIBP와 얼음 결합능을 분자 구조적인 관점에서 비교하였다 [11]. FfIBP는 LeIBP과 유사한 3차원 구조를 가짐에도 불구하고 LeIBP보다 10배 이상 높은 TH 활성을 가지고 있다.
대상 데이터
- 재조합 P. pastoris의 종배양은 YPD 배지 (yeast extract, 10 g/L; peptone, 20 g/L; dextrose, 20 g/L)를 이용하였으며 발효기를 사용한 본 배양은 미량금속원소 (CuSO4·5H2O, 6.0 g/L; NaI, 0.08 g/L; MnSO4·H2O, 3.0 g/L; NaMo2·H2O, 0.2 g/L; H3BO4, 0.02 g/L; CoCl2, 0.5 g/L; ZnCl2, 20.0 g/L; FeSO4·7H2O, 65.0 g/L; biotin, 0.2 g/L; H2SO4, 5.0 ml/L)가 포함된 FBS (Fermentation basal salts)배지 (glycerol, 40 g/L; CaSO4, 0.93 g/L; K2SO4, 18.2 g/L; MgSO4·7H2O, 14.9 g/L; KOH, 4.13 g/L; H3PO4 [85%], 26.7 mL/L) 에서 수행되었다 [10].
성능/효과
- 1A, ●). SDS-PAGE 결과 pH 5에서 배양한 결과와 달리 발현유도 초기에 FfIBP가 발현되지 않았으며 (Fig. 2C), 총 발현량도 크게 낮아 정제된 FfIBP는 23 mg/L를 얻었다 (Fig. 1B).
- 1A, □). SDS-PAGE 결과 발현 유도 12시간 후부터는 FfIBP가 생산되었으며 (Fig. 2B), 정제된 FfIBP는 73 mg/L를 얻었다 (Fig. 1B). 배양액의 pH를 5로 유지한 상태에서 온도를 5℃ 낮추어도 FfIBP의 생산성은 큰 차이가 없음을 의미한다.
- 배양액의 pH 5, 30℃에서 유가식 배양할 경우 시간에 따른 FfIBP의 TH활성을 비교하였다. TH활성은 발현유도 후에 급격하게 증가하여 24시간이 되면 0.85로 최대값을 보였고 발효 종료 시까지 거의 일정하게 유지되었다 (Fig. 3). 재조합 P.
- 남극 세균 Flavobacterium frigoris PS1 유래 결빙방지 단백질 FfIBP를 Pichia pastoris 의 유가식 배양을 통해 생산한 결과 30°C, pH 5의 조건에서 최대 생산성을 보였다.
- 1A, ○). 배양액을 채취하여 SDS-PAGE를 수행한 결과, 발현 유도 7.5시간 후부터 FfIBP가 생산되는 것이 확인되었다 (Fig. 2A). 배양이 종료된 최종 상등액을 정제하여 FfIBP를 획득한 결과 배양액 1L당 75 mg(75 mg/L)을 얻었다 (Fig.
- 남극 세균 Flavobacterium frigoris PS1 유래 결빙방지 단백질 FfIBP를 Pichia pastoris 의 유가식 배양을 통해 생산한 결과 30°C, pH 5의 조건에서 최대 생산성을 보였다. 정제된 FfIBP의 TH활성은 0.85로 같은 농도에서의 LeIBP 보다 약 2배 높았다. 본 연구는 재조합 FfIBP 등 다양한 결빙방지단백질의 대량생산을 위한 기초자료로 사용될 것이다.
후속연구
- 85로 같은 농도에서의 LeIBP 보다 약 2배 높았다. 본 연구는 재조합 FfIBP 등 다양한 결빙방지단백질의 대량생산을 위한 기초자료로 사용될 것이다.
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