[논문]수온 및 염분 스트레스에 따 른 참담치, Mytilus coruscus에서 Hsp70 및 GST 유전자 발현에 대한 연구

김철원; 강한승

doi:10.11626/kjeb.2015.33.4.450

수온 및 염분 스트레스에 따 른 참담치, Mytilus coruscus에서 Hsp70 및 GST 유전자 발현에 대한 연구
The Expression of Hsp70 and GST Genes in Mytilus coruscus Exposed to Water Temperature and Salinity 원문보기

환경생물 = Korean journal of environmental biology, v.33 no.4, 2015년, pp.450 - 458

김철원 (한국농수산대학교) , 강한승 (엠에스바이오랩)

Abstract ▼ AI-Helper

The heat shock proteins (Hsps), one of the most highly conserved groups of proteins, play crucial roles in protecting cells against environmental stressors, such as temperature, salinity, heavy metals and pathogenic bacteria. The glutathione S-transferases (GST) have important role in detoxification of oxidative damage, environmental chemicals and environmental stress. The purpose of this study is to investigate the gene expression of Hsp70 and GST on change of temperature and salinity in Mytilus coruscus. The M. coruscus was cultured in incubator of separate temperature and salinity (8, 20, $30^{\circ}C{\times}20$‰, 25‰, 30‰) for 28 days. Ten individuals in each group were selected after each 14 and 28 days exposure. Results that the expression of Hsp70 mRNA was no significant changed in M. coruscus exposed to temperature ($8^{\circ}C$, $20^{\circ}C$, $30^{\circ}C$) and salinity (20‰, 25‰, 30‰) for 14 days. Whereas the expression of Hsp70 mRNA was increased in exposure to temperature $30^{\circ}C$ and salinity (20‰, 25‰, 30‰) for 28 days. The expression of GST mRNA was increased in exposure to temperature $30^{\circ}C$, salinity (25‰, 30‰) for 14 days and temperature ($8^{\circ}C$, $20^{\circ}C$, $30^{\circ}C$), salinity (20‰, 25‰, 30‰) for 28 days. These results suggest that Hsp70 and GST were played roles in biomarker gene on the thermal and salinity stress.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 참담치를 이용하여 수온 및 염분 등의 환경요인 변화에 따른 스트레스 관련 유전자인 Hsp70 및 GST 유전자발현양상을 통해 생체 내 스트레스의 상태를 알아보고자 함을 연구의 목적으로 두었다.
본 연구에서는 온도 및 염분 등의 환경요인이 참담치에 미치는 영향에 관한 연구의 일환으로 스트레스 관련 유전자인 Hsp70과 GST 단백질의 mRNA 유전자발현을 조사하고자 한다.
염분농도의 설정은 자연해수에서 평균 염분농도보다 높은 고농도가 발생할 가능성이 낮을 것 이라는 판단에서 자연해수의 염분농도에 비교하여 낮은 염분농도를 설정하여 저염분이 참담치에 미치는 영향을 관찰하고자 하였다.

제안 방법

PCR 수행을 위한 annealing 온도의 설정은 gradient PCR을 수행하여 최적의 온도를 선택하였으며, PCR 수행의 반복 횟수는 각각 18회부터 32회 수행한 PCR 산물을 전기영동하여 PCR 산물의 포화상태가 이루어지기 전의 횟수를 선택하여 결정하였다.
각 유전자의 RT-PCR 조건은 Hsp70 및 GST의 경우 pre-denaturation 95℃, 5분; denaturation, annealing, extension 각각 95℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 30초, 28회; extension 72℃, 10분 수행하였다.
본 연구에서는 참담치의 적정서식 조건에서 온도 및 염분농도의 변화를 준 후, 참담치의 스트레스 정도를 Hsp70 및 GST 유전자의 발현을 통해서 살펴보았다.
수온에 따른 사육 조건은 8℃, 20℃ 및 30℃로 설정하였으며, 각각의 온도조건에 염분 20‰, 25‰ 및 30‰ 농도로 설정하여 28일간 사육하였다.
실험을 위한 온도와 수온이 설정된 다연실배양기에는 실험군당 3반복 실험의 수행을 위하여 각각 3개의 사육용기를 배치하였다.
중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: PCR)은 RT를 통해 얻은 20 μL의 cDNA중에서 cDNA 1 μL와 각각의 유전자 primer인 Hsp70 (Accession No: KF322135) F(5ʹ-TGGAATACCTCCAGCACCAA-3ʹ), R(5ʹ-AGCATCATTGACCATGCGTT-3ʹ), GST(AccessionNo: KC525103) F(5ʹ-GAAATTGTCTTAGTAGGTGGATC-3ʹ), R(5ʹ-CAGGCTGGTTGTCGGAGTAAGT-3ʹ), 내재표준유전자로 사용한 β-actin(Liu et al. 2014b) primer F(5ʹ-ATGAAACCACCTACAACAGT-3ʹ), R(5ʹ-TAGACCCACCAATCCAGACG-3ʹ) 및 AccuPower HotStart PCR premix(Bioneer Co. Daejeon, Korea)를 이용하여 최종 반응용액 20 μL로 시행하였다.
증폭된 PCR산물은 ethidiumbromide(100ng mL-1)가 포함된 2% 아가로즈겔 전기영동을 통해 확인하였으며 band intensity는 Gel DocTM XR+ System(Bio-Rad,California, USA)을 이용하여 분석하였다
RT-PCR은 실험군당 3개의 total RNA를 이용하여 각각 3회 반복 수행하였다.
사육수온 30℃ 및 염분농도(20‰, 25‰, 30‰)에 참담치를 사육한 후, 개체의 생체 내 스트레스 수준을 파악하기 위하여 14일과 24일째 개체를 대상으로 Hsp70 및 GST 유전자의 발현을 관찰하였다.
참담치의 사육수온 20℃ 및 염분농도(20‰, 25‰, 30‰) 변화에 따른 개체의 생체 내 스트레스 수준을 파악하기 위하여 사육한 참담치를 14일과 24일간 노출시킨 후에 Hsp70 및 GST 유전자의 발현을 살펴보았다.
참담치의 저 수온 및 염분에 따른 개체의 생체 내 스트레스 수준을 알아보기 위하여 8℃ 수온에 염분농도(20‰, 25‰, 30‰) 변화를 둔 멸균해수에 사육한 참담치를 14일과 24일간 노출시킨 후에 Hsp70 및 GST 유전자의 발현을 살펴보았다.
추출한 total RNA에서 1 μg을 취하여 oligo(dT)18 (0.5 μg)primer와 AccuPower RT premix(Bioneer Co. Daejeon,Korea)를 이용하여 최종 반응용액 20 μL로 42℃에서 1시간 시행하여 cDNA를 합성하였다.

대상 데이터

14일째와 28일째 각 조건별 실험군에 위치한 3개의 사육용기에서 각각 10개체씩 30마리를 수집하여 실험에 사용하였다.
본 연구에 사용된 참담치 (Mytilus coruscus, Gould)는 각고 1.62~1.71 cm 정도의 미성숙 개체로서 국립한국농수산대학교 생물사육장에서 사육한 생물이며 사육을 위한 해수는 멸균해수를 사용하였다.

데이터처리

대조군과 실험군 간의 유의성 검정을 위해 Student’s t-test를 수행하였으며, p값이 0.05 이하인 경우에 유의한 것으로 판정하였다.

성능/효과

28일간의 사육수온 30℃ 및 염분농도(20‰, 25‰, 30‰) 사육에서의 개체는 대조군에 비하여 모든 실험군에서 유의적인 발현의 증가가 나타났다(Fig. 4).
생산량이 감소한 참담치의 복원 및 인공종묘생산을 통한 양식산업을 수행할 시에는 장시간 적정하지 않은 환경요인에 노출된 개체에게 스트레스를 유발하여 생산량의 감소를 유발시킬 수 있는 것이 확인되었다.
연구결과 온도 및 염분 등의 환경요인은 참담치의 성장 및 생존에 영향을 미치는 스트레스와 관계한다는 것을 알 수 있었고 또한 유전자 발현변화 측면에서 GST 유전자는 Hsp70 유전자에 비해 민감한 것을 확인하였다.

후속연구

따라서 향후 참담치를 이용한 온도 및 염분이 미치는 스트레스의 연구에 있어서 조기 발현시기의 확인과 온도 및 염분 등의 복합 영향이 아닌 단일 영향에 관한 연구가 필요하리라 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	참담치란?	이매패강(Bivalvia), 홍합목(Mytiloida), 홍합과(Mytildae)에 속하는 이매패류인 참담치 (Mytilus coruscus, Gould)는우리나라, 일본 북태평양 및 중국 황해 연안에만 서식하는고유종으로 산업적 가치가 있는 중요한 패류이며, 생식은 자웅이체로서 체외수정을 한다(Yoo 1988). 형태적 특징은 껍질이 두껍고 칠흑색이며, 모양은 긴 계란형으로서, 접착성이강한 단백질성 섬유 다발인 표류용 족사(drifting thread) 및부착용 족사(attachment thread)를 가지고 있어서, 암초에 군집으로 부착해서 서식하는 특성이 있다 (Lane et al.
	참담치의 형태적 특징은?	이매패강(Bivalvia), 홍합목(Mytiloida), 홍합과(Mytildae)에 속하는 이매패류인 참담치 (Mytilus coruscus, Gould)는우리나라, 일본 북태평양 및 중국 황해 연안에만 서식하는고유종으로 산업적 가치가 있는 중요한 패류이며, 생식은 자웅이체로서 체외수정을 한다(Yoo 1988). 형태적 특징은 껍질이 두껍고 칠흑색이며, 모양은 긴 계란형으로서, 접착성이강한 단백질성 섬유 다발인 표류용 족사(drifting thread) 및부착용 족사(attachment thread)를 가지고 있어서, 암초에 군집으로 부착해서 서식하는 특성이 있다 (Lane et al. 1985).
	패류의 환경요인이 불안정할 경우 발생하는 현상은?	참담치는 서식의 특성상 환경변화가 많은 조건에 노출되어있다. 참담치 등을 비롯한 패류는 수온 및 염분 등의 외부환경요인에 영향을 받으며 이들 환경요인이 불안정할 경우생화학 및 생리적 변화의 유도에 따른 대사유지를 위한 에너지 불균형에 의해 생산력이 감소된다(Shin and Wi 2004). 이들 환경요인 중 온도는 직접적인 요인으로 대사 및 에너지균형에 영향을 미친다(Newell and Kofoed 1977; Loomiset al.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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