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문제 정의
- 지금까지 국내혐기성 환경에서의 혐기성 미생물의 배양, 순수분리에 대한 연구가 매우 미비한 상태이다. 따라서, 본 연구진들은 국내의 대표적인 습지인 우포 늪지대와 해안 갯벌에 서식하고 있는 다양한 황산염 및 황-환원 세균을 분리, 동정하였으며, 특성을 규명하고자 하였다.
- 황화합물은 혐기성환경에서 혐기성호흡을 위한 매우 중요한 전자수용체이다. 본 연구를 통하여 한국의 다양한 습지에서 배양을 통한 황산염/황-환원세균의 특성연구를 실시하였다. 이를 분리하기 위하여 혐기성 roll tube법을 통해 총 11개의 순수 배양체를 확보하였다.
- 전자수용체는 sulfate (5 mM)와 thiosulfate (5 mM)를 사용하였다. 전자수용체 사용 유무에 대한 실험은 5 mM 의 lacate를 기질로 한 인공 담수물 또는 인공 바닷물 배지에서 6개의 다른 전자수용체를 이용 가능 한지 살펴보았다. Sulfate (5 mM), sulfite (5 mM), thiosulfate (5 mM), elemental sulfur (2 g/L), nitrate (5 mM), fumarate (10 mM)를 전자수용체로 넣어 주었다.
제안 방법
- Korea) 10 μl와 10 pmol forward와 reverse primer 각각 1 μl와 3차 증류수 7 μl를 넣고, 분리한 균주로부터 획득한 DNA를 1 μl씩 넣어 총 20 μl의 반응액을 만들었다. 16S rDNA를 증폭시키기 위한 조건은 94℃에서 5분 동안 변성(denaturation) 후, 그 다음 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분동안 반응시키고 이를 30회 반복 수행하였다. 마지막으로 72℃에서 7분간 최종 신장 (extension)을 시켰다.
- 서열 정보는 SeqMan software (DNAStar)를 이용하여 편집하였다. GenBank로부터 연관성이 높은 유전자 서열을 획득하였다. Gap들은 BioEdit program (Hall, 1999)을 이용하여 편집하였다.
- 마지막으로 72℃에서 7분간 최종 신장 (extension)을 시켰다. dsrAB 유전자를 증폭시키기 위한 조건은 94℃에서 15초 동안 변성(denaturation) 후, 그 다음 94℃에서 15초, 54℃에서 20초, 72℃에서 54초 동안 반응시키고 이를 35회 반복 수행하였다. 마지막으로 72℃에서 1분간 최종 신장 (extension)을 시켰다(Wagner et al.
- 계통학적 특성으로 중요한 16S rDNA와 더불어 황산염환원에 있어 가장 중요한 기능을 하는 유전자인 dsrAB의 유연관계 특성을 분석하였다. 총 11종 중에서 Desulfovibrio oceani subsp.
- 그람 염색은 BD사의 Gram-stain kit를 이용하였다. 그 후 광학현미경으로 관찰하였다(Eclipse 80i; Nikon, Japan). 세포의 모양 및 편모 관찰은 1% (wt/v) phosphotungstic acid를 이용한 음성 염색(negative staining)을 이용하여 투과전자현미경(EM-109; Carl Zeisso, Germany)로 관찰하였다.
- 미생물의 생장 확인은 배양액의 탁도와 황화물 형성 측정을 통해 확인 하였다. 그람 염색은 BD사의 Gram-stain kit를 이용하였다. 그 후 광학현미경으로 관찰하였다(Eclipse 80i; Nikon, Japan).
- Nitrate의 환원은 Shinn의 방법(1941)을 이용하여 nitrite의 생성과 Solorzano의 방법 (1969)에 따른 ammonia 생성 유무를 살펴보았다. 또한 듀람관 (Durham tube)을 첨가하여 질소 가스 형성 유무도 살펴보았다. 배양체는 적어도 10일간 각 균주의 최적 온도에서 배양되었다.
- 배양체는 적어도 10일간 각 균주의 최적 온도에서 배양되었다. 미생물의 생장 확인은 배양액의 탁도와 황화물 형성 측정을 통해 확인 하였다. 그람 염색은 BD사의 Gram-stain kit를 이용하였다.
- 하지만, 혐기성 미생물의 배양은 분자생태학적 기법으로 검출된 혐기성 미생물의 생리 ․ 생화학적 특성을 규명하는데 필수적인 역할을 한다. 본 연구를 통하여 국내에서는 보고되지 않았던 총 11종의 황산염/황-환원 세균을 국내 습지로부터 분리동정하고 특성분석을 실시하였다. 본 연구를 통하여 국내 최초로 다양한 황산염환원세균 자원을 확보하였으며, 앞으로 혐기성 미생물의 연구와 이용에 많은 도움을 줄 것이다.
- 분리한 세균의 16S rDNA와 dsrAB 유전자를 증폭하기 위하여 세균의 16S rDNA에 특이적 primer인 8F (5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′)와 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′; Lane, 1991), dsrAB 유전자에 특이적 primer인 dsr1-F (5′-AC[C/G] CACTGGAAGCACG-3′)와 dsr4-R (5′-GTGTAGCAGTTACC GCA-3′; Wagner et al., 1998)을 각각 쌍으로 이용하였다.
- 생장 온도 실험은 7일간 ASW, AFW에 lactate와 sulfate 또는 sulfur 를 전자수용체로 하여 0, 4, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 60℃에서 실험을 진행하였다. 생장 pH 실험은 동일 배지에서 pH 4.0-11.0 (pH 0.5 간격으로) 실험하였다. 본 연구를 통하여 분리된 Desulfovibrio 속에 속하는 균주들은 구부러진 간균형을 띄며, TEM 사진 분석을 통하여 극성 flagella를 가지는 것으로 확인되었다(Fig.
- 세포의 모양 및 편모 관찰은 1% (wt/v) phosphotungstic acid를 이용한 음성 염색(negative staining)을 이용하여 투과전자현미경(EM-109; Carl Zeisso, Germany)로 관찰하였다. 생장 온도 실험은 7일간 ASW, AFW에 lactate와 sulfate 또는 sulfur 를 전자수용체로 하여 0, 4, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 60℃에서 실험을 진행하였다. 생장 pH 실험은 동일 배지에서 pH 4.
- 그 후 광학현미경으로 관찰하였다(Eclipse 80i; Nikon, Japan). 세포의 모양 및 편모 관찰은 1% (wt/v) phosphotungstic acid를 이용한 음성 염색(negative staining)을 이용하여 투과전자현미경(EM-109; Carl Zeisso, Germany)로 관찰하였다. 생장 온도 실험은 7일간 ASW, AFW에 lactate와 sulfate 또는 sulfur 를 전자수용체로 하여 0, 4, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 60℃에서 실험을 진행하였다.
- 이를 혐기성 roll tube법을 이용하여 순수분리를 진행하였다. 순수 분리된 미생물을 아래의 분자생물학적 방법으로 계통 분류학적 분석을 실시하고, 생리, 생화학적 실험을 통해 배양된 미생물의 동정을 실시하였다.
- 시료로부터 혐기성 roll tube 방법을 통해 농화배양체로부터 순수배양을 시도하였다. 3개의 시료로부터 총 11종의 다른 황산염/황환원 미생물을 분리하였다: Desulfovibrio 8종, Desulfitobacterium 1종, Sulfurospirillum 2종(Table 1).
- 시료로부터 황산염/황-환원 세균을 배양하기 위하여 인공해수배지(Artificial sea water, ASW) 및 인공담수배지(Artificial fresh water, AFW)를 이용하였다. ASW의 조성은 다음과 같다.
- 유전자의 증폭 반응을 위해 2× EF Taq mixture (SolGent Co., Ltd. Korea) 10 μl와 10 pmol forward와 reverse primer 각각 1 μl와 3차 증류수 7 μl를 넣고, 분리한 균주로부터 획득한 DNA를 1 μl씩 넣어 총 20 μl의 반응액을 만들었다.
- 1B). 학계에서 제시된 새로운 종의 세균 기준인 97% 16S rDNA 유사성을 따라, 이들 분리균주들을 가장 가까운 해당 종의 균주들로 분류하였다. 따라서, 이들 미생물들은, 국외에서는 배양되어 보고되었지만, 국내에서는 배양된 바가 없는 ‘국내 미기록종’ 이라 할 수 있다.
대상 데이터
- 분리된 황산염/황-환원 세균의 생리학적 실험은 일반적으로 10 ml 인공 담수물 또는 인공 바닷물 배지에서 이루어졌다. 기질 사용 특성에 따른 배양은 8개의 다양한 기질을 이용하여 실시되었고, 각 기질의 농도는 다음과 같다. Lactate (10 mM), acetate (10 mM), formate (10 mM), pyruvate (10 mM), malate (10 mM), fumarate (10 mM), succinate (10 mM), alanine (20 mM), serine (20 mM).
- 본 실험을 위하여 국내의 대표적인 습지인 서해와 남해의 갯벌, 우포의 늪지대로부터 시료를 채취하였다. 시료를 채취하기 위하여 약 50 cm 깊이를 직경 10 cm의 알루미늄 원통관을 이용하여 천공하였으며, 천공된 시료는 50 ml conical 시험관에 담아서 실험 시까지 4℃에서 혐기적으로 냉장 보관하였다.
- 분리한 균주의 16S rDNA와 dsrAB 유전자는 GenBank 데이터베이스에 등록하였다(16S rDNA: KF933831, KF933832, KF601938-KF601943; dsrAB 유전자: KJ801797-KJ801803). 또한 분리한 균주는 국립생물자원관에 기탁하였다(Table 1).
- Lactate (10 mM), acetate (10 mM), formate (10 mM), pyruvate (10 mM), malate (10 mM), fumarate (10 mM), succinate (10 mM), alanine (20 mM), serine (20 mM). 전자수용체는 sulfate (5 mM)와 thiosulfate (5 mM)를 사용하였다. 전자수용체 사용 유무에 대한 실험은 5 mM 의 lacate를 기질로 한 인공 담수물 또는 인공 바닷물 배지에서 6개의 다른 전자수용체를 이용 가능 한지 살펴보았다.
이론/모형
- , 2011)을 이용하여 그려졌다. 16S rDNA 상동성은 ez-biocloud 를 통해 계산되었다(http://www.ezbiocloud.net/).
- 이때 methylene blue 방법을 사용하였다(Kelly and Wood, 1998). Nitrate의 환원은 Shinn의 방법(1941)을 이용하여 nitrite의 생성과 Solorzano의 방법 (1969)에 따른 ammonia 생성 유무를 살펴보았다. 또한 듀람관 (Durham tube)을 첨가하여 질소 가스 형성 유무도 살펴보았다.
- Gap들은 BioEdit program (Hall, 1999)을 이용하여 편집하였다. 계통수는 neighbor- joining 방법 (Saitou and Nei, 1987)을 이용하고 MEGA 5 프로그램(Tamura et al., 2011)을 이용하여 그려졌다. 16S rDNA 상동성은 ez-biocloud 를 통해 계산되었다(http://www.
- 황화합물의 경우 환원된 황화물(sulfide) 측정을 통해 전자 수용체가 환원됨을 확인하였다. 이때 methylene blue 방법을 사용하였다(Kelly and Wood, 1998). Nitrate의 환원은 Shinn의 방법(1941)을 이용하여 nitrite의 생성과 Solorzano의 방법 (1969)에 따른 ammonia 생성 유무를 살펴보았다.
- 본 연구를 통하여 한국의 다양한 습지에서 배양을 통한 황산염/황-환원세균의 특성연구를 실시하였다. 이를 분리하기 위하여 혐기성 roll tube법을 통해 총 11개의 순수 배양체를 확보하였다. 16S rDNA를 이용한 계통분석 및 상동성 분석을 실시하여 Desulfovibrio 속의 세균 8종, Sulfurospirillum 속의 세균 2종, Desulfitobacterium 속의 세균 1종을 얻을 수 있었다.
- 배지에 시료를 연속희석법으로 넣은 후 30℃ 배양기에서 1주간 농화 배양하였다. 이를 혐기성 roll tube법을 이용하여 순수분리를 진행하였다. 순수 분리된 미생물을 아래의 분자생물학적 방법으로 계통 분류학적 분석을 실시하고, 생리, 생화학적 실험을 통해 배양된 미생물의 동정을 실시하였다.
- , 1998). 증폭된 유전자는 1.5% Agarose gel 전기영동법을 이용하여 크기를 확인하였다. 증폭된 유전자는 PCR purification kit (Cosmo Genetech Co.
성능/효과
- 각각의 균주들은 16S rDNA 분석을 통하여 알게 된 가장 가까운 Desulfovibrio 표준 균주(type strain)들과 서식지가 유사함을 확인 할 수 있다. 16S rDNA 분석결과 이들은 국외에서 기존에 배양되었던 표준 균주(type strain)들과 99% 이상의 상동성을 보이는 균주들이었다. 계통수 분석결과를 통한 이들의 유연관계는 Fig.
- 이를 분리하기 위하여 혐기성 roll tube법을 통해 총 11개의 순수 배양체를 확보하였다. 16S rDNA를 이용한 계통분석 및 상동성 분석을 실시하여 Desulfovibrio 속의 세균 8종, Sulfurospirillum 속의 세균 2종, Desulfitobacterium 속의 세균 1종을 얻을 수 있었다. 이들 황산염/황-환원세균은 모두 lactate와 pyruvate를 전자 공여체로 이용하였으며, sulfite and thiosulfate를 전자수용체로 이용할 수 있었다.
- 시료로부터 혐기성 roll tube 방법을 통해 농화배양체로부터 순수배양을 시도하였다. 3개의 시료로부터 총 11종의 다른 황산염/황환원 미생물을 분리하였다: Desulfovibrio 8종, Desulfitobacterium 1종, Sulfurospirillum 2종(Table 1). Desulfovibrio 균주 들은 담수환경(우포늪)과 해양환경(무창포 해수욕장, 순천만)에서 모두 발견되었다.
- Desulfitobacterium dichloroeliminans IRF24를 제외한 나머지 10종의 황산염/황-환원 세균균주들은 모두 그람 음성균으로 확인되었다. 분리된 모든 균주들은 공통으로 formate, lactate, acetate를 전자공여체(electron donor)로 이용할 수 있었다.
- SR22 균주는 Desulfovibrio marinisediminis C/L2와 rDNA 상동성은 99.6%, dsrAB 유전자 상동성은 95.7%이다. 성장 온도는 10–40℃이며, 최적 온도는 30℃이다.
- wp6균주는 Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans DSM 642와 16S rDNA 상동성은 99.1%, dsrAB 유전자 상동성은 90.8%이다. 성장 온도는 15–40℃이며, 최적 온도는 37℃이다.
- wp13균주는 Desulfovibrio oxamicus DSM 1925와 16S rDNA 상동성은 99.6%, dsrAB 유전자 상동성은 97.4%이다. 성장 온도는 15–50℃이며, 최적 온도는 37℃이다.
- wpp1균주는 Desulfovibrio termitidis HI1와 16S rDNA 상동성은 99.5%, dsrAB 유전자 상동성은 97.8%이다. 성장 온도는 20–45℃이며, 최적 온도는 37℃이다.
- Desulfovibrio 균주 들은 담수환경(우포늪)과 해양환경(무창포 해수욕장, 순천만)에서 모두 발견되었다. 각각의 균주들은 16S rDNA 분석을 통하여 알게 된 가장 가까운 Desulfovibrio 표준 균주(type strain)들과 서식지가 유사함을 확인 할 수 있다. 16S rDNA 분석결과 이들은 국외에서 기존에 배양되었던 표준 균주(type strain)들과 99% 이상의 상동성을 보이는 균주들이었다.
- , 2006). 본 실험에서 분리된 모든 균주들은 전자 수용체로 sulfite와 thiosulfate를 모두 이용하여 sulfide를 생산함을 알 수 있었다. 본 실험을 통하여 분리된 몇 균주들은 elemental sulfur 또는 질삼염을 전자수용체로 이용하는 특성을 나타냄을 알 수 있었다(Table 1).
- 본 실험에서 분리된 모든 균주들은 전자 수용체로 sulfite와 thiosulfate를 모두 이용하여 sulfide를 생산함을 알 수 있었다. 본 실험을 통하여 분리된 몇 균주들은 elemental sulfur 또는 질삼염을 전자수용체로 이용하는 특성을 나타냄을 알 수 있었다(Table 1).
- 5 간격으로) 실험하였다. 본 연구를 통하여 분리된 Desulfovibrio 속에 속하는 균주들은 구부러진 간균형을 띄며, TEM 사진 분석을 통하여 극성 flagella를 가지는 것으로 확인되었다(Fig. 3A and 3B). 분리된 균주들의 활발한 운동성은 flagella와 세포의 모양에 기인하는 것을 알 수 있다.
- 분리된 균주들의 활발한 운동성은 flagella와 세포의 모양에 기인하는 것을 알 수 있다. 분리된 Desulfitobacterium 속의 균주들은 곧은 간균 형태이며(Fig. 3C), Sulfurospiriilum은 나선형 간균임을 관찰 할 수 있었다 (Fig. 3D).
- net/). 분리된 황산염-환원 세균의 경우 모두 Desulfovibrio 속에 속하는 것을 확인할 수 있었는데, 이는 영양요구성이 비교적 까다롭지 않고, 성장이 빠르기 때문으로 추측되며, 따라서, 일반적인 현상이라 할 수 있다.
후속연구
- 본 연구를 통하여 국내에서는 보고되지 않았던 총 11종의 황산염/황-환원 세균을 국내 습지로부터 분리동정하고 특성분석을 실시하였다. 본 연구를 통하여 국내 최초로 다양한 황산염환원세균 자원을 확보하였으며, 앞으로 혐기성 미생물의 연구와 이용에 많은 도움을 줄 것이다. 또한 절대 혐기성 미생물 특히, 황산염환원미생물의 배양과 특성규명에 대한 보고가 국내에서는 거의 되어 있지 않은 현실에서, 매우 중요한 연구사례라 할 수 있다.
- 또한 절대 혐기성 미생물 특히, 황산염환원미생물의 배양과 특성규명에 대한 보고가 국내에서는 거의 되어 있지 않은 현실에서, 매우 중요한 연구사례라 할 수 있다. 앞으로 다양한 전자공여체나 배양조건을 시도하여 보다 유용한 절대혐기성 생물자원을 확보하는데 기여할 것이다.
- 이들 황산염/황-환원세균은 모두 lactate와 pyruvate를 전자 공여체로 이용하였으며, sulfite and thiosulfate를 전자수용체로 이용할 수 있었다. 앞으로, 다양한 전자공여체와 배양조건을 통하여 유용한 절대혐기성 황산염/황-환원세균의 생물자원 확보에 기여할 것으로 기대된다.
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