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문제 정의
- 본 연구에서는 작잠 실크피브로인을 이용한 기초적인 연구를 기반으로 작잠 실크피브로인을 이용한 응용 소재 개발을 위하여 재생 작잠 실크피브로인 스펀지를 제조하고, 작잠 실크피브로인의 구조 전이에 미치는 에탄올의 효과를 살펴보았다. 또한 재생 작잠 실크피브로인의 in vitro 상처회복 효과에 대하여 살펴보았다.
제안 방법
- In vitro 상처 회복 효과를 측정하기 위하여 작잠 실크피브로인을 1 ~ 100 μL 농도별로 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 DAPI 염색을 하여 형광현미경으로 세포의 이동을 촬영하여 매뉴얼에 따라 상처회복율과 세포이동 속도를 계산하였다.
- 2012). 간단하게 기술하면, 정련 욕 비 1 : 50 의 조건에서 Na2CO3 2.5 g/l 용액으로 95 ~ 100oC 에서 30분간 처리한 후 40oC의 물로 세척하는 과정을 3회 반복 수행하였다. 실험에 사용한 작잠 누에고치의 연감율은 15.
- 작잠 실크피브로인의 상등액은 동결건조하였다. 동결건조하여 얻은 작잠 실크 스펀지는 에탄올 처리는 농도를 50, 70, 80, 100%(v/v) 수용액에 일정 시간동안 침지 후 건조하여 보관하였다.
- 본 연구에서는 작잠 실크피브로인을 이용한 기초적인 연구를 기반으로 작잠 실크피브로인을 이용한 응용 소재 개발을 위하여 재생 작잠 실크피브로인 스펀지를 제조하고, 작잠 실크피브로인의 구조 전이에 미치는 에탄올의 효과를 살펴보았다. 또한 재생 작잠 실크피브로인의 in vitro 상처회복 효과에 대하여 살펴보았다.
- 작잠 누에고치를 정련한 후 질산칼슘4수화물의 용융액을 사용하여 재생 작잠 실크피브로인 스펀지를 제조하였다. 작잠 실크피브로인은 280 nm에서 tyrosine 잔기 등에 기인한 흡광대를 나타내었다.
- 용해된 작잠 실크단백질로부터 질산칼슘을 제거하기 위하여 3일간 투석한 후 염도와 이온전도도를 측정하여 탈염이 완료되었음을 확인하였다. 작잠 실크단백질의 용해도 측정은 용해 처리 전 작잠 누에고치의 무게(Wi)와 처리 후 작잠 누에고치의 무게(W2)를 측정하여 다음 식에 의하여 작잠 누에고치의 용해도를 계산하였다.
- 작잠 실크피브로인 질산칼슘 용액으로부터 작잠 실크피브로인 분자간의 결합력을 약화시키는 데 사용된 질산칼슘을 제거하기 위하여 투석을 실시하였다. 작잠 실크피브로인은 투석을 하는 동안 침전이 발생하였다(그림 1).
대상 데이터
- 5 g/l 용액으로 95 ~ 100oC 에서 30분간 처리한 후 40oC의 물로 세척하는 과정을 3회 반복 수행하였다. 실험에 사용한 작잠 누에고치의 연감율은 15.9%였다.
- 작잠 누에고치는 수원 소재 농촌진흥청 국립농업과학원에서 사육한 작잠(Antheraea pernyi) 누에고치를 수확하여 사용하였다. 누에고치의 정련은 알칼리 정련법에 의하여 수행하였다(Shin et al.
- , USA)를 활용하였다. 젊은 여성(28세)으로부터 분리한 구강 피부 조직에서 분리한 잇몸섬유아세포(gingival fibroblast primary cell)를 분리하여 DMEM 배지(Gibco BRL, USA)를 이용하여 100 U/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin을 포함한 배지에서 37oC, 5% CO2 환경조건으로 배양한 6번째로 계대배양한 세포를 사용하였다. In vitro 상처 회복 효과를 측정하기 위하여 작잠 실크피브로인을 1 ~ 100 μL 농도별로 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 DAPI 염색을 하여 형광현미경으로 세포의 이동을 촬영하여 매뉴얼에 따라 상처회복율과 세포이동 속도를 계산하였다.
이론/모형
- 작잠 누에고치는 수원 소재 농촌진흥청 국립농업과학원에서 사육한 작잠(Antheraea pernyi) 누에고치를 수확하여 사용하였다. 누에고치의 정련은 알칼리 정련법에 의하여 수행하였다(Shin et al. 2012). 간단하게 기술하면, 정련 욕 비 1 : 50 의 조건에서 Na2CO3 2.
- 작잠 실크 피브로인에 의한 상처회복 효과를 관찰하기 위하여 CytoSelect 24-well Wound Healing Assay(CBA-120, Cell Biolabs Inc., USA)를 활용하였다. 젊은 여성(28세)으로부터 분리한 구강 피부 조직에서 분리한 잇몸섬유아세포(gingival fibroblast primary cell)를 분리하여 DMEM 배지(Gibco BRL, USA)를 이용하여 100 U/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin을 포함한 배지에서 37oC, 5% CO2 환경조건으로 배양한 6번째로 계대배양한 세포를 사용하였다.
- 작잠 피브로인 침전물과 상등액 동결건조물의 구조를 확인하기 위하여 적외선분광분석기(FT-IR spectrometer spectrum 100, Perkin Elmer, USA)를 이용하여 KBr법에 의하여 적외선 분광분석을 행하였다.
- 정련한 작잠 누에고치는 Kweon and Park(2001)의 방법에 따라 질산칼슘 용융액을 사용하여 용해하였다. 간단하게 기술하면, 작잠 누에고치 3 g을 Ca2(NO3)2• 4H2O 172 g의 용융액에 넣어 3시간 동안 정해진 온도에서 용해하였다.
성능/효과
- 작잠 실크피브로인 스펀지를 에탄올 농도별로 처리한 후 구조 전이를 관찰한 결과 80% 에탄올 처리시에는 β-sheet 구조(700 cm-1), α-helix 구조 (625 cm-1), 그리고 random coil (660 cm-1) 구조가 공존하는 것으로 나타났다. 또한 작잠 실크피브로인을 이용한 in vitro 상처회복실험 결과 실크피브로인의 첨가에 의하여 상처회복 효과가 인정되었다.
- 세포의 이동 속도를 작잠 실크피브로인의 처리 농도별로 계산한 결과 작잠 실크피브로인에 의한 세포이동속도는 3.68 μm/hr(1 μl 처리군), 12.5 μm/hr(10 μl 처리군), 12.5 μm/hr(100 μl 처리군)로 나타났다.
- 알코올 처리에 의하여 작잠 실크 스펀지의 구조 전이가 발생하여 저농도(50 ~ 70%) 알코올 처리군은 β-sheet 구조(1240, 965, 700 cm-1)와 α-helix 구조(625 cm-1)의 특성을 나타낸 반면, 고농도(80%) 에탄올 처리군은 β-sheet 구조(700 cm-1), α-helix 구조(625 cm-1), 그리고 random coil (660 cm-1) 구조가 공존하는 것으로 나타났다.
- 간단하게 기술하면, 작잠 누에고치 3 g을 Ca2(NO3)2• 4H2O 172 g의 용융액에 넣어 3시간 동안 정해진 온도에서 용해하였다. 용해된 작잠 실크단백질로부터 질산칼슘을 제거하기 위하여 3일간 투석한 후 염도와 이온전도도를 측정하여 탈염이 완료되었음을 확인하였다. 작잠 실크단백질의 용해도 측정은 용해 처리 전 작잠 누에고치의 무게(Wi)와 처리 후 작잠 누에고치의 무게(W2)를 측정하여 다음 식에 의하여 작잠 누에고치의 용해도를 계산하였다.
- 작잠 실크피브로인의 자외선 분광곡선을 그림 2에 나타내었다. 자외선 분광 분석 결과 280 nm 부근에서 최대 흡수 피크를 보였다. 이 흡수대는 작잠 실크피브로인에 포함되어 있는 tyrosine 잔기와 tryptophan 잔기 등에 기인된 것으로 판단된다.
- 질산칼슘 • 4수화물 용융액의 온도에 따른 용해도를 측정하여 표 1에 나타내었다. 작잠 누에고치는 용해온도 90oC에서는 90%의 용해도를 나타내었으나 100oC 이상에서는 99% 이상 용해되는 것으로 관찰되었다. 작잠 피브로인의 용해는 질산수화물으로부터 방출된 질산에 의한 가수분해 가능성도 있다고 생각된다(Małecka et al.
- 작잠 실크피브로인 스펀지를 에탄올 농도별로 처리한 후 구조 전이를 관찰한 결과 80% 에탄올 처리시에는 β-sheet 구조(700 cm-1), α-helix 구조 (625 cm-1), 그리고 random coil (660 cm-1) 구조가 공존하는 것으로 나타났다.
- 저농도 (1 μl)의 작잠 실크피브로인보다는 고농도(100 μl)의 작잠실크피브로인 처리에 따라 상처회복률이 높게 나타남을 확인할 수 있었다.
- 저농도(50 ~ 70%)알코올 처리에 의하여 작잠 실크 단백질이 β-sheet 구조와 α-helix 구조의 특성을 나타낸 반면 고농도 에탄올 처리군에서는 β-sheet, α-helix 및 random coil 구조가 공존하는 것으로 나타난 이번 결과는 문헌에서 고찰한 결과와 일치하는 것으로 나타났다.
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