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문제 정의
- , 2014). 이러한 단백질들을 단백질 분해효소 저항성 단백질이라 보고 팥 또한 이러한 콩 단백질처럼 완전히 분해되지 않고 소장 점막과 어떠한 상호작용을 하는 팥 단백질이 있을 가능성이 있으므로 팥 단백질 중의 소화효소 저항성 단백질에 대한 연구를 중점으로 실험을 진행하였다.
가설 설정
- 팥 단백질들이 단백질 분해효소에 대한 저항성을 보이기 때문에 이들 저항성 단백질들이 소장에 머무는 동안 장점막과 상호작용을 통해 일련의 생리적 작용을 할 수 있다는 가설을 세우소 소장조직과 팥 단백질의 상호결합을 분석하였다. Paraffin 에 고정되어 박피층을 만든 후 paraffin을 제거하고 단백질의 folding을 회복시키는 방법으로 장점막 조직을 원상복구 한 뒤 이 조직절편에 biotinylation한 팥 단백질들을 가하여 반응을 시킨 후 avidin-FITC로 표지한 결과 장점막 상에 팥 단백질이 신호는 약했지만 BSA(bovine serum albumin) 처리구에 비해 선택적으로 결합함을 보였다(Figure 5).
제안 방법
- 0 구간의 IPG-strip(Biorad, Herculus, CA, USA)을 이용하여 36000 V-h로 isoelectric focusing하였다. 1차원 전기영동이 이루어진 strip을 equilibration buffer에서 30분간 처리 후 2차원 전기영동을 12% SDS-PAGE로 실시하였다. 전기영동이 끝난 후 gel을 Coomassie Brilliant Blue G-250으로 staining(overnight)한 후 10% ethanol로 destaining하고 증류수로 세척한 후 gel 싱에 분리된 단백질 image를 scan하였다.
- 대조구로 단백질 분해효소 처리를 하지 않은 팥 단백질을 같은 방법과 조건으로 2D gel 상에서 분리하여 2D gel image들을 얻고 두 image를 PDQUEST 분석 software로(Biorad, Herculus, CA, USA) 분석하여 농도의 차이를 보이는 단백질을 선발하였다(Figure 4). Gel 단편에 들어있는 단백질들을 trypsin으로 처리한 후 얻어진 peptide를 MALDITOF로 분석하여 mass spectrum을 얻고 이들 mass 값을 이용하여 NCBI-database를 검색하여 단백질들을 동정하였다. 이러한 peptide mass fingerprinting 분석의 문제점으로는 아직 팥의 genome 염기서열이 완성되지 않아 팥 단백질에 대한 정보를 얻을 수 없기 때문에 콩, Arabidopsis, 감자와 같이 지금까지 genome 염기서열이 밝혀진 식물 유전자 database로부터 유사한 단백질들의 정보를 구하는 미완성적인 분석을 할 수 밖에 없었다.
- Trypsin을 처리한 tube에서 15 µL 용액을 취하여 새 tube에 담고 얼린 후에 동결 건조하여 MALDI-TOF를 위한 샘플을 만든다. MALDI-TOF 분석에서 얻어진 mass spectra를 M-over-Z 프로그램으로 calibration하고 그 값들을 가지고 NCBI-database를 검색하여 단백질을 동정하였다(Webster, 2012). MASCOT을 검색엔진으로 사용하여 얻은 score로부터 가장 신뢰도가 높은 것들을 동정된 단백질로 결정하였다.
- MALDI-TOF 분석에서 얻어진 mass spectra를 M-over-Z 프로그램으로 calibration하고 그 값들을 가지고 NCBI-database를 검색하여 단백질을 동정하였다(Webster, 2012). MASCOT을 검색엔진으로 사용하여 얻은 score로부터 가장 신뢰도가 높은 것들을 동정된 단백질로 결정하였다.
- SDS-PAGE 상에서 주를 이루는 단백질을 분리하여 상대적으로 미량으로 존재하는 단백질을 분석하고 동시에 major 단백질들을 분석하기 위해 주요 팥 단백질들을 추출, 제거하기 위해 Omana and Wul의 방법을 참고하여 CaCl2 처리를 실시하였다(Omana and Wu1, 2009). 수용성 팥 단백질 용액에 10 mM CaCl2처리 실험 결과, CaCl2처리 상층액에는 major 단백질이 제거되고 남은 단백질들이 상대적으로 더 잘 확인 될 수 있었으며 침전물 중에는 major 단백질의 band가 대부분을 차지함을 나타내었다(Figure 2).
- 1 × PBS로 3번 세척 후 mounting 용액을 떨어뜨리고 coverslip으로 덮어 mounting한다. 그 뒤 노출을 Light 10 ms, FITC 4 s, DAPI 600 ms로 현미경 관찰하였다.
- 팥 단백질 중 단백질분해효소 저항성 단백질들을 분리 동정하기 위해 무열처리 팥 단백질을 2 h 동안 pepsin처리 후 4h 동안 pancreatin 처리하고 분해되지 않고 남은 단백질들을 2D gel 상에서 분리하였다. 대조구로 단백질 분해효소 처리를 하지 않은 팥 단백질을 같은 방법과 조건으로 2D gel 상에서 분리하여 2D gel image들을 얻고 두 image를 PDQUEST 분석 software로(Biorad, Herculus, CA, USA) 분석하여 농도의 차이를 보이는 단백질을 선발하였다(Figure 4). Gel 단편에 들어있는 단백질들을 trypsin으로 처리한 후 얻어진 peptide를 MALDITOF로 분석하여 mass spectrum을 얻고 이들 mass 값을 이용하여 NCBI-database를 검색하여 단백질들을 동정하였다.
- 열처리와 무열처리 팥에서 분리한 수용성 단백질을 분리하여 Bradford 방법(Bradford, 1976)으로 단백질 정량을 한 결과 무열처리 팥에서는 60 mg/mL의 농도로 단백질이 측정되었으나 열처리구에서는 6 mg/mL 이하로 단백질이 측정되어 열처리에 의해 대부분의 팥 단백질이 불용화되는 것으로 추정되었다(Figure 1B). 따라서 이 후의 실험에서는 무열처리 팥 단백질을 이용한 실험을 진행하였다. 무열처리와 열처리된 팥 단백질의 단백질 분해효소 저항성을 알아보기 위해 우선 팥 단백질들을 pepsin으로 2 h 그리고 pancreatin으로 18 h동안 반응시킨 후 분해되지 않고 남은 단백질을 12% SDS-PAGE 상에서 분리해서 염색을 한 결과 무열처리한 팥 단백질은 pepsin에 대해 대부분 저항성을 보였고 pancreatin에 대해서는 4 h 반응시킬 경우 대부분 저항성을 보였으며 18 h 반응에는 대부분의 major 단백질들이 분해되었을 뿐 나머지 단백질들은 저항성을 보였다.
- 따라서, 팥 단백질의 기능에 관해 알아보기 위해 팥 단백질을 추출하여 실험을 실시하였으며 특히 콩의 단백질분해효소 저항성 단백질의 특성과 연관시켜 팥 단백질에 관한 실험을 설계하였다. 소장은 융모와 미세융모를 가지고 많은 소화효소를 분비하여 영양소 흡수에 효과적이다.
- 세척된 단백질 시료를 동결건조하고 그 단백질 시료 450 µg을 사용하여 pH 4.0-7.0 구간의 IPG-strip(Biorad, Herculus, CA, USA)을 이용하여 36000 V-h로 isoelectric focusing하였다.
- 열처리구와 무열처리구 팥 단백질을 pepsin 및 pancreatin으로 소화시킨 후 소화효소에 저항성을 보이는 단백질분석을 위해 12% Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 100 V에서 전기영동 후 gel을 Coomassie Brilliant Blue G-250으로 overnight staining, 10% ethanol 용액으로 destaining하고 증류수로 세척한 후 scan 하였다(Epson Perfection V700 Photo, Nagoya, Japan).
- 1차원 전기영동이 이루어진 strip을 equilibration buffer에서 30분간 처리 후 2차원 전기영동을 12% SDS-PAGE로 실시하였다. 전기영동이 끝난 후 gel을 Coomassie Brilliant Blue G-250으로 staining(overnight)한 후 10% ethanol로 destaining하고 증류수로 세척한 후 gel 싱에 분리된 단백질 image를 scan하였다.
- 쥐의 소장을 paraffin으로 고정하여 4 µm 절편으로 lateral 하게 자른 slide를 이용하여 tissue binding을 실행하였다.
- , 1998) 37℃ water bath에서 반응시키며 0, 1, 2 h에 각각의 반응물을 채취하고 1 M NaOH을 가하여 pH 7로 맞추어 반응을 종료 시킨 후 0℃에서 보관하였다. 채취하고 남은 팥 단백질 반응물에 1 M NaOH 용액을 가하여 pH 6.8로 맞춘 후 pancreatin의 최종 농도가 10 mg/mL 되도록 첨가하고(Galia et al., 1998; Stippler et al., 2004) water bath incubator(37℃)에서 반응시키며 1, 2, 3, 4, 18 h에서 각각 반응물을 채취하고 5분간 100℃ 물에서 중탕 열처리하여 반응을 종결 시킨 후 0℃에서 보관하였다.
성능/효과
- 1. Pepsin과 pancreatin 소화물들을 비교한 결과, 순수한 팥 단백질 중에서 소화효소 저항성을 가지는 단백질이 존재하는 것으로 확인되었다.
- 2. 팥의 주요 단백질을 제거하고 pepsin과 pancreatin으로 소화시켰을 때 더 많은 분해가 일어나는 것으로 보아 팥의 주요 단백질들 중에 소화효소 저항성을 가지는 것이 많을 것이라 추측된다.
- 3. 팥의 주요 단백질들은 장 점막세포와는 크게 작용하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
- 팥 단백질들이 단백질 분해효소에 대한 저항성을 보이기 때문에 이들 저항성 단백질들이 소장에 머무는 동안 장점막과 상호작용을 통해 일련의 생리적 작용을 할 수 있다는 가설을 세우소 소장조직과 팥 단백질의 상호결합을 분석하였다. Paraffin 에 고정되어 박피층을 만든 후 paraffin을 제거하고 단백질의 folding을 회복시키는 방법으로 장점막 조직을 원상복구 한 뒤 이 조직절편에 biotinylation한 팥 단백질들을 가하여 반응을 시킨 후 avidin-FITC로 표지한 결과 장점막 상에 팥 단백질이 신호는 약했지만 BSA(bovine serum albumin) 처리구에 비해 선택적으로 결합함을 보였다(Figure 5). 이 결과는 콩 단백질이 장점막과 특이적으로 결합하는 것과 비교하면 매우 약한 결합이기는 하지만(unpublished data) 특정 단백질이 장점막과 상호작용을 통하여 일련의 생리작용을 유발 할 수 있는 가능성을 보여주었다.
- 하지만 팥 단백질의 정확한 데이터베이스가 아직 정리되어 있지 않아 이 단백질들을 명확히 규명하기 위해서는 MS/MS방법으로 de novo sequencing을 하여 아미노산 서열을 구한 후 아미노산 서열 유사도가 높은 단백질을 선발하는 방법으로 단백질 성질을 규명하는 방법을 시도할 필요가 있다. 단백질 분해효소 저항성 팥 단백질들이 장 점막세포에서 어떤 작용을 할 수 있지 않을까도 예상하였으나 예상과 달리 장 점막세포와는 강하게 결합하지 않는 결과를 얻었다. 이는 팥 주요 단백질들이 제한된 수의 장 점막세포 상의 단백질과 작용하여 생리작용을 나타내거나 물리적인 흡착과 같은 과정을 통해 소장 내에서 생리적 기능을 나타낼 수 있음을 시사한다.
- 단백질처럼 팥에도 소화효소 저항성을 지닌 단백질이 있을 것으로 예상한 것과 같이 팥 단백질 중 에서도 소화효소 저항성을 지닌 단백질이 있는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 팥 단백질에 열을 가하면 단백질 대부분이 불용화되어 수용성 단백질의 회수가 어려웠다.
- 수용성 팥 단백질 용액에 10 mM CaCl2처리 실험 결과, CaCl2처리 상층액에는 major 단백질이 제거되고 남은 단백질들이 상대적으로 더 잘 확인 될 수 있었으며 침전물 중에는 major 단백질의 band가 대부분을 차지함을 나타내었다(Figure 2). 또한 주요 단백질을 제거한 CaCl2처리 상층액을 pepsin 및 pancreatin으로 분해한 결과, CaCl2 처리하기 전과 비교하여 상층액 단백질들이 단백질 분해효소에 의해 더 많이 분해됨을 보였다(Figure 3). 이는 팥 단백질은 pepsin에 의해 분해가 일어나나 팥의 major protein들은 다른 팥 단백질들에 비해 pepsin 저항성을 갖고 있음을 보여서 팥의 major protein들이 단백질 분해효소 저항성 단백질임을 알 수 있다.
- 이 결과는 팥 단백질에도 콩 단백질에서와 같이 단백질분해효소 저해요소가 들어 있음을 알 수 있고 열처리에 의해 이들 저해요소들이 제거 되었음에도 pepsin에 대해서는 여전히 단백질 분해효소에 저항성을 보임을 알 수 있다. 또한 팥의 major 단백질들은 오히려 pancreatin에 의해 더 선별적으로 분해될 수 있음을 보였다.
- 따라서 이 후의 실험에서는 무열처리 팥 단백질을 이용한 실험을 진행하였다. 무열처리와 열처리된 팥 단백질의 단백질 분해효소 저항성을 알아보기 위해 우선 팥 단백질들을 pepsin으로 2 h 그리고 pancreatin으로 18 h동안 반응시킨 후 분해되지 않고 남은 단백질을 12% SDS-PAGE 상에서 분리해서 염색을 한 결과 무열처리한 팥 단백질은 pepsin에 대해 대부분 저항성을 보였고 pancreatin에 대해서는 4 h 반응시킬 경우 대부분 저항성을 보였으며 18 h 반응에는 대부분의 major 단백질들이 분해되었을 뿐 나머지 단백질들은 저항성을 보였다. 그러나, 열처리한 팥 단백질은 수용성으로 추출된 단백질의 농도가 낮아 gel 상에서 희미한 단백질 band를 보였는데 pepsin 반응에서는 저항성을 보였으나 pancreatin 반응에서는 대부분의 단백질이 분해되는 경향을 보였다.
- 처리를 실시하였다(Omana and Wu1, 2009). 수용성 팥 단백질 용액에 10 mM CaCl2처리 실험 결과, CaCl2처리 상층액에는 major 단백질이 제거되고 남은 단백질들이 상대적으로 더 잘 확인 될 수 있었으며 침전물 중에는 major 단백질의 band가 대부분을 차지함을 나타내었다(Figure 2). 또한 주요 단백질을 제거한 CaCl2처리 상층액을 pepsin 및 pancreatin으로 분해한 결과, CaCl2 처리하기 전과 비교하여 상층액 단백질들이 단백질 분해효소에 의해 더 많이 분해됨을 보였다(Figure 3).
- Paraffin 에 고정되어 박피층을 만든 후 paraffin을 제거하고 단백질의 folding을 회복시키는 방법으로 장점막 조직을 원상복구 한 뒤 이 조직절편에 biotinylation한 팥 단백질들을 가하여 반응을 시킨 후 avidin-FITC로 표지한 결과 장점막 상에 팥 단백질이 신호는 약했지만 BSA(bovine serum albumin) 처리구에 비해 선택적으로 결합함을 보였다(Figure 5). 이 결과는 콩 단백질이 장점막과 특이적으로 결합하는 것과 비교하면 매우 약한 결합이기는 하지만(unpublished data) 특정 단백질이 장점막과 상호작용을 통하여 일련의 생리작용을 유발 할 수 있는 가능성을 보여주었다. 또한 팥 단백질들이 단백질 분해효소 저항성을 보이며 소장에 머무는 동안 물리적으로 cholesterol이나 중성지방 등 다른 대사물질들과 흡착 또는 결합할 수 있는 가능성도 배제할 수 없다(Nakamura et al.
- 그러나, 열처리한 팥 단백질은 수용성으로 추출된 단백질의 농도가 낮아 gel 상에서 희미한 단백질 band를 보였는데 pepsin 반응에서는 저항성을 보였으나 pancreatin 반응에서는 대부분의 단백질이 분해되는 경향을 보였다. 이 결과는 팥 단백질에도 콩 단백질에서와 같이 단백질분해효소 저해요소가 들어 있음을 알 수 있고 열처리에 의해 이들 저해요소들이 제거 되었음에도 pepsin에 대해서는 여전히 단백질 분해효소에 저항성을 보임을 알 수 있다. 또한 팥의 major 단백질들은 오히려 pancreatin에 의해 더 선별적으로 분해될 수 있음을 보였다.
후속연구
- 4. 팥 단백질의 데이터베이스 구축과 팥 단백질이 다른 영양소들과의 상호작용을 하는 지에 대한 연구가 진행되어야 할 것이다.
- 따라서 팥 단백질의 작용에 대한 연구를 위해 단백질분해효소 저항성 단백질들과 lipid와의 상호작용, 단백질 분해산물인 peptide 들의 장점막결합 등도 앞으로 분석을 기다리는 분야이다. 더 정확한 팥 단백체의 분석을 위해서는 genome 염기서열의 구축 이전에라도 팥의 cDNA 염기서열 분석을 통한 발현 단백질의 정보를 구축하면(Huang et al., 2013) 어느 정도 발현량을 보이는 단백질들은 MS 분석과 peptide mass fingerprinting에 의해서도 동정이 가능할 것으로 예상된다.
- 팥의 주요 단백질들을 제거한 뒤에 소화효소로 분해한 결과, 대부분 단백질들이 분해되었으므로 팥의 주요 단백질 들(lactotransferrin)이 단백질 분해효소 저항성을 가지는 단백질들임을 의미한다. 하지만 팥 단백질의 정확한 데이터베이스가 아직 정리되어 있지 않아 이 단백질들을 명확히 규명하기 위해서는 MS/MS방법으로 de novo sequencing을 하여 아미노산 서열을 구한 후 아미노산 서열 유사도가 높은 단백질을 선발하는 방법으로 단백질 성질을 규명하는 방법을 시도할 필요가 있다. 단백질 분해효소 저항성 팥 단백질들이 장 점막세포에서 어떤 작용을 할 수 있지 않을까도 예상하였으나 예상과 달리 장 점막세포와는 강하게 결합하지 않는 결과를 얻었다.
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