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문제 정의
- 본 연구에서는 중금속(Zn, Pb) 및 유류(디젤)가 생태계에 미치는 단일 및 복합 독성영향을 발광박테리아인 Vibrio fischeri 를 사용하여 평가하였다. 실험에 사용된 유류는 디젤의 WSF를 분리하여 실험하였으며, 디젤의 실험농도는 분석된 TPH 농도를 바탕으로 희석하여 사용하였다.
가설 설정
- 준비된 혼합물질의 독성평가 방법은 Microtox 45% basic test 방법과 동일하게 수행하였다. 통계적 분석은 SPSS(Statistical Package for the Social Science for windows Version 20.0, Inc)프로그램을 이용하였고 p-value 가 0.05 미만인 경우를 통계학적 유의성이 있다고정하였다.
제안 방법
- 2종류 물질의 혼합 (Zn+Pb, Zn+TPH, Pb+TPH)에 의한 독성영향을 평가하기 위하여 발광박테리아의 발광저해도를 단일물질의 결과와 함께 용량 반응 곡선으로 나타내었다(Fig. 2-4). Fig.
- 5 mL씩 넣고 5분과 15분 후에 농도별 발광량(It)을 측정하여 발광 저해 영향(%)을 산출하였다. Microtox 실험 전 Zinc sulfate 표준용액을 사용하여 Vibrio fischeri의 활성이 적정 범위에 있는지 확인하였다. 실험 결과 분석은 CETIS 프로그램(Version 1.
- 1(석유계총탄화수소 용매추출/기체크로마토그래피방법)의 기준에 따랐다. WSF에 존재하는 TPH의 분석 결과는 7.29 mg/L였으며 디젤의 실험농도는 분석된 TPH 농도를 바탕으로 희석하여 사용하였다.
- 단일 물질(Zn, Pb, TPH)의 Microtox 발광저해도 영향은 제조사 매뉴얼인 Microtox 45% basic test 방법에 따라 분석하였다. 단일 물질 독성평가 농도는 예비실험을 통하여 최적의 농도를 설정하였으며, Zn의 경우 1.28, 2.56, 5.12, 10.23 mg/L, Pb의 경우 0.10, 0.21, 0.42, 0.84 mg/L, TPH 농도가 0.21, 0.41, 0.82, 1.64, 3.28 mg/L로 실험하였다. 모든 실험은 세 번 반복하여 수행하였다.
- 단일 물질 독성평가에서 사용한 물질들로 각각 두 종류 씩의 물질을 혼합하여 Microtox 발광저해도 영향 평가를 실시하였다. 혼합 물질 독성평가에서의 Zn와 Pb의 농도를 단일 물질 독성평가와 동일한 농도를 사용하였으며, TPH 농도는 0.
- 단일 물질(Zn, Pb, TPH)의 Microtox 발광저해도 영향은 제조사 매뉴얼인 Microtox 45% basic test 방법에 따라 분석하였다. 단일 물질 독성평가 농도는 예비실험을 통하여 최적의 농도를 설정하였으며, Zn의 경우 1.
- 독성평가 방법은 Microtox용 cuvette에 희석액 0.5 mL 넣고 발광박테리아 배양액 10 μL를 넣어 초기 발광량(I0)을 측정 후, 희석한 실험용액을 0.5 mL씩 넣고 5분과 15분 후에 농도별 발광량(It)을 측정하여 발광 저해 영향(%)을 산출하였다.
- 혼합 물질의 독성평가에 의하여 실제 관찰된 P(O)값과 수학적 모델에 의해 예측된 P(E)값을 비교하여, P(O)>P(E)는 혼합 물질 독성 영향이 상승효과(synergistic effect)를 나타내며, P(O)<P(E)는 혼합물질 독성 영향이 길항효과(antagonistic effect)를 보이는 것으로 분석하였다. 또한, P(O)와 P(E)값의 차이가 유의하지 않으면 첨가효과(additive effect)로 보았다.
- 이 연구에서는 중금속 2종(Zn, Pb)과 유류(디젤)의 단일 및 혼합 독성 영향에 대하여 Microtox 생물검정법을 이용하여 평가하였다. 특히, 혼합 독성 영향은 확률 이론에 근거한 수학적 모델을 사용하여 두 물질의 혼합에 따른 상승작용, 길항작용, 첨가작용에 대한 연구를 수행하였다.
- 이 연구에서는 중금속 2종(Zn, Pb)과 유류(디젤)의 단일 및 혼합 독성 영향에 대하여 Microtox 생물검정법을 이용하여 평가하였다. 특히, 혼합 독성 영향은 확률 이론에 근거한 수학적 모델을 사용하여 두 물질의 혼합에 따른 상승작용, 길항작용, 첨가작용에 대한 연구를 수행하였다.
- 단일 물질 독성평가에서 사용한 물질들로 각각 두 종류 씩의 물질을 혼합하여 Microtox 발광저해도 영향 평가를 실시하였다. 혼합 물질 독성평가에서의 Zn와 Pb의 농도를 단일 물질 독성평가와 동일한 농도를 사용하였으며, TPH 농도는 0.21, 0.82, 3.28 mg/L를 사용하였다. 혼합 조건으로는 중금속 간의 혼합과 중금속과 유류의 혼합으로 2가지 조건으로 나눌 수 있으며, (1) Zn/Pb, (2) Zn/TPH, Pb/TPH의 조합으로 혼합 독성 영향을 관찰하였다.
- 28 mg/L를 사용하였다. 혼합 조건으로는 중금속 간의 혼합과 중금속과 유류의 혼합으로 2가지 조건으로 나눌 수 있으며, (1) Zn/Pb, (2) Zn/TPH, Pb/TPH의 조합으로 혼합 독성 영향을 관찰하였다. 각각의 실험은 모두 세 번 반복하여 수행하였다.
대상 데이터
- 중금속 간의 혼합 독성 및 유류와 중금속 독성 평가는 Microtox M500(Azur Environmental, USA)를 사용하였다. Microtox 독성 평가에 사용된 발광박테리아(Vibrio fischeri), 재활성화 용액(reconstitution solution), 희석액(diluent)은 Azur사로부터 구입하였다. 재활성화 용액 1 mL을 발광박테리아 1병에 넣어 발광박테리아를 재활성화 시켰다.
- 본 연구에서는 중금속(Zn, Pb) 및 유류(디젤)가 생태계에 미치는 단일 및 복합 독성영향을 발광박테리아인 Vibrio fischeri 를 사용하여 평가하였다. 실험에 사용된 유류는 디젤의 WSF를 분리하여 실험하였으며, 디젤의 실험농도는 분석된 TPH 농도를 바탕으로 희석하여 사용하였다. 단일 물질 독성평가에서 50% 발광 저해율을 보여주는 EC50 값은 각각 Zn 1.
- 재활성화 용액 1 mL을 발광박테리아 1병에 넣어 발광박테리아를 재활성화 시켰다. 실험에 사용된 중금속은 Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4 7H2O, Sigma), Lead(II) chloride(PbCl2, Sigma)를 사용하였다. 유류는 주유소(H사)에서 디젤을 구입하여 사용하였으며, Dede and Kaglo (2001)의 방법을 참고하여 디젤의 WSF(water soluble fraction)을 분리하였다.
- 실험에 사용된 중금속은 Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4 7H2O, Sigma), Lead(II) chloride(PbCl2, Sigma)를 사용하였다. 유류는 주유소(H사)에서 디젤을 구입하여 사용하였으며, Dede and Kaglo (2001)의 방법을 참고하여 디젤의 WSF(water soluble fraction)을 분리하였다. 디젤의 WSF분리는 디젤:증류수=1:4 비율로 혼합하여 24시간 교반하고 이를 분액깔때기에서 24시간 방치 후 분리된 유막층 아래의 수용액을 분리하여 실험하였다.
- 중금속 간의 혼합 독성 및 유류와 중금속 독성 평가는 Microtox M500(Azur Environmental, USA)를 사용하였다. Microtox 독성 평가에 사용된 발광박테리아(Vibrio fischeri), 재활성화 용액(reconstitution solution), 희석액(diluent)은 Azur사로부터 구입하였다.
데이터처리
- 실험 결과 분석은 CETIS 프로그램(Version 1.8.7.15, Tidepool Scientific Software)의 Spearman-Käber method를 사용하여 EC50 값과 95% 신뢰한계를 계산하였다.
이론/모형
- 디젤의 WSF분리는 디젤:증류수=1:4 비율로 혼합하여 24시간 교반하고 이를 분액깔때기에서 24시간 방치 후 분리된 유막층 아래의 수용액을 분리하여 실험하였다. 분리한 실험용액의 TPH(total petroleum hydrocarbons)농도는 경상대학교 농업생명과학연구원에 분석 의뢰하였으며, 시험방법은 수질오염공정시험기준 ES04502.1(석유계총탄화수소 용매추출/기체크로마토그래피방법)의 기준에 따랐다. WSF에 존재하는 TPH의 분석 결과는 7.
- 혼합 물질 독성평가는 Microtox 45% screening test 방법에 따라 각각의 물질을 혼합하여 준비하였다. 준비된 혼합물질의 독성평가 방법은 Microtox 45% basic test 방법과 동일하게 수행하였다. 통계적 분석은 SPSS(Statistical Package for the Social Science for windows Version 20.
- 각각의 실험은 모두 세 번 반복하여 수행하였다. 혼합 물질 독성평가는 Microtox 45% screening test 방법에 따라 각각의 물질을 혼합하여 준비하였다. 준비된 혼합물질의 독성평가 방법은 Microtox 45% basic test 방법과 동일하게 수행하였다.
- 혼합 물질의 독성평가는 이론적으로 예상되는 복합 독성 영향은 확률 이론에 근거한 간단한 수학적 모델을 사용하여 예측하였다(Kungolos et al., 1999; Tsiridis et al., 2006). 이 모델에 따르면, P1과 P2는 단일 물질 A1과 A2의 특정 농도에 따른 개별 독성 영향을 나타내며, P(E)는 이 두 물질이 혼합하였을 때 예상되는 독성 영향을 나타내는 것으로 다음의 계산식에 의해 정의된다.
성능/효과
- 중금속의 경우에는 노출시간 5분과 15분에서 시간에 따라 독성 영향이 높아지는 결과를 보였다. 15분 노출시간에서 발광저해율의 EC50은 각각 Zn 1.90 mg/L (1.67~2.14 mg/L)와 Pb 0.31 mg/L(0.30~0.31 mg/L)로 Pb가 더 높은 독성을 보였다. Mowat and bundy (2002)의 연구결과에서 Zn와 Pb에 15분 노출된 발광박테리아의 발광저해도가 각각 2.
- 혼합 물질 독성평가에서는 첨가되는 물질의 농도에 따라 독성 영향이 증가하는 것을 볼 수 있었다. Zn 과 Pb의 혼합물의 경우에는 상승효과를 보였으나, 중금속 (Zn, Pb)과 TPH 혼합물의 경우에는 모두 길항 또는 첨가 효과가 나타났다. 또한, 단일 및 복합에서 중금속과 TPH가 시간에 따른 독성반응이 상당히 차이가 나는 것으로 밝혀졌다.
- 3, 4는 중금속(Zn, Pb)과 디젤(TPH)의 혼합에 의한 독성 영향을 관찰하였다. Zn과 TPH의 혼합과 Pb와 TPH의 혼합 독성 영향에서 모두 노출시간 5분에서는 TPH의 첨가 농도에 따라 독성 영향이 증가하는 것을 볼 수있었으며, 특히 TPH를 3.28 mg/L 농도로 첨가한 실험군에서는 TPH를 첨가하지 않은 것과 비교하여 유의성 있게 독성이 증가하는 것을 관찰하였다. 그리고 15분 노출되었을 때에는 TPH의 농도에 따른 독성 영향 증가 경향은 보이나 통계적으로 유의성이 없는 것으로 나타났다(P<0.
- 노출시간 5분의 결과에서는 Zn이 단일 노출되었을 때보다 Pb의 농도 증가에 따라 독성 영향이 유의성 있게(P<0.05) 높아지는 경향을 보였으며, 노출시간 15분에서는 혼합 독성의 Pb 최소 농도인 0.10 mg/L에서도 80% 이상의 발광저해도가 나타나는 높은 독성 영향이 관찰되었다.
- 43 mg/L로 본 연구에서 측정한 독성 값과 비슷한 결과를 보이고 있다. 유류오염에 대한 발광박테리아에 대한 독성 영향을 평가하기 위하여 TPH에 농도에 따른 발광저해도를 분석한 결과, TPH에 5분 노출되었을 경우 EC50 값은 1.81 mg/L였으며, 노출시간이 15분으로 늘어날 경우 EC50 값이 2.09로 독성이 조금 낮아 졌으나 큰 차이를 보이지 않았으며, Vibrio fischeri 에 대한 TPH의 독성 영향은 중금속에 비해서는 상당히 빠르게 나타나는 것으로 보여진다. 이는 TPH에 다량으로 포함되어 있는 화학물질들이 높은 소수성과 친유성을 가지고 있어 생물체를 구성하고 있는 지질에 높은 친화도를 가지는 것으로 알려져 있으므로 생물체 내에 흡수가 잘 되는 것에 의하여 독성영향이 빨리 일어나는 것으로 판단되어 질 수 있다(Kelly et al.
- 혼합 물질의 독성평가에 의하여 실제 관찰된 P(O)값과 수학적 모델에 의해 예측된 P(E)값을 비교하여, P(O)>P(E)는 혼합 물질 독성 영향이 상승효과(synergistic effect)를 나타내며, P(O)<P(E)는 혼합물질 독성 영향이 길항효과(antagonistic effect)를 보이는 것으로 분석하였다.
후속연구
- 또한, 단일 및 복합에서 중금속과 TPH가 시간에 따른 독성반응이 상당히 차이가 나는 것으로 밝혀졌다. 이러한 복합오염 물질들의 상호작용으로 인한 복합 독성영향을 정확하게 예측하기 위해서는 추가 메커니즘 연구가 필요할 것이다.
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