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문제 정의
- 그 결과 석곡은 농도 의존적으로 procollagen 합성을 유도하는 것으로 나타났다. 또한 각질형성세포와 섬유 아세포에 의해 분비되어 피부주름 생성에 관여하는 MMPs에 관하여 조사하였다. MMPs는 촉매부분에 금속을 포함하는 효소로 현재까지 약 25개 이상이 밝혀졌고, 자외선, 산화스트레스, TNF-α 등과 같은 다양한 자극에 의해 활성이 나타나게 된다 (Steenprot et al.
- 본 실험에서 자생 석곡추출물이 α-MSH의해 증가된 tyrosinase 활성에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 세포내 tyrosinase 활성도를 확인하여 보았다.
- 하지만 우리나라에서는 자생 석곡은 대부분 관상용으로 판매 유통되고 있으며, 산업화와 관련된 기능성 연구가 미흡한 실정이다. 이에 본 연구에서는 자생 석곡 (Dendrobium moniliforme)의 추출물을 활용하여 미백 및 주름개선 효능을 평가하여 향후에 향장제품 소재로 이용하고자 하였다.
제안 방법
- 수확한 세포는 Tripure Isolation Reagent (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 5㎍의 mRNA를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)를 이용하여 cDNA로 합성을 하였다. 실험은 제조사 매뉴얼에 따라 수행하였다.
- B16F10 세포를 6 well에 5 × 104씩 세포를 분주하여 24시간동안 세포를 안정화 시킨 뒤에 자생 석곡시료를 농도별로 10, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 처리를 하였고 1시간 뒤에 α-MSH를 100 nM이 되게 처리를 한 뒤에 72시간 동안 배양을 하였다.
- B16F10 세포를 96 well에 5 × 103씩 세포를 분주하여 24시간동안 세포를 안정화 시킨 뒤에 자생 석곡 시료를 농도별로 처리를 하였다.
- B16F10 세포에 60 ㎜ dish에 5 × 104 씩 세포를 분주하여 자생 석곡추출물을 a-MSH (100 nM)보다 1시간이전에 처리를 하고 72시간동안 배양을 하였다.
- B16F10 세포주에서 자생 석곡 메탄올 추출물의 독성을 조사하기 위해, MTS 실험을 수행하였다. 각각 B16F10 세포에 농도별 (10, 50, 100, 200, 500 ㎍/㎖)로 자생 석곡 추출물을 처리하고 24시간 후에 MTS를 처리한 결과 (Fig.
- Collagen 생합성량 측정은 procollagen type I C-peptide EIA kit (Takara Bio, Inc., Otsu, Shiga, Japan))를 이용하여 kit 매뉴얼에 따라 실험하였다. Human Dermal Fibroblasts, neonatal (HDFn) 세포를 Medium 106 배지에 LSGS를 넣고 배양한뒤, 24 well plate에 2 × 105개로 분주하여 24시간 후에 배양액을 교환하여 석곡 시료 용액을 농도 별로 처리한 뒤 24시간 뒤에 세포배양액을 채취하여 procollagen type I Cprtide EIA kit를 이용하여 collagen 생합성량을 측정하였다.
- Human Dermal Fibroblasts, neonatal (HDFn) 세포를 Medium 106 배지에 LSGS를 넣고 배양한뒤, 24 well plate에 2 × 105개로 분주하여 24시간 후에 배양액을 교환하여 석곡 시료 용액을 농도 별로 처리한 뒤 24시간 뒤에 세포배양액을 채취하여 procollagen type I Cprtide EIA kit를 이용하여 collagen 생합성량을 측정하였다.
- PAD 시료를 농도별로 처리한 실험군과 대조군을 24시간 배양 후 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 5% β-mercaptoethanol, 2 mM phenyl-methylsulfonyl fluoride, protease inhibitors (completeTM, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF과 10 mM EDTA을 함유하는 완충제를 사용하여 세포를 용해시켰다.
- 그 후에 PBS로 2회 세척하고 Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 수확한 뒤 3000 rpm에 5분동안 세포를 모으고 상층액을 제거한 후 10% dimethylsulfoxide (DMSO)가 첨가된 1N NaOH용액을 처리하여 80℃에서 1시간 동안 반응시켰다. melanin 정량은 합성melanin을 이용하여 ELISA microplate reader로 410 ㎚에서 각각의 흡광도를 측정 하였다.
- PBS로 2회 세척을 하고 RIPA protein lysis buffer을 처리를 한 후에 4℃에서 30분 동안 incubation을 하였다. 그 후에 4℃ 13000 rpm 30분동안 원심분리를 통해 단백질이 든 상층액만을 가지고 tyrosinase activity를 측정하였다. 단백질 양을 Bradford 정량법 (Bradford, 1976)을 통해 595 ㎚로 ELISA를 측정을 하고 동일한 단백질을 이용해서 L-DOPA를 처리를 하여 540 ㎚ 흡광도로 세포내 tyrosinase activity를 측정하였다.
- 정량한 단백질 20 μg을 10% SDS-PAGE에 전기 영동시킨 후 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)으로 옮겼다. 그리고 membrane의 blocking은 5% bovine serum albumin (BSA)이 함유된 TTBS (0.1% Tween 20 + TBS) 용액을 상온에서 2시간 동안 실시한 다음 Tyrosinase, Gapdh에 대한 1차 항체와 반응시킨 후 2차 항체인 horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit 또는 anti-mouse IgG를 반응시키고 ECL detection reagents (Millipore, Billerico, MA, USA)를 사용하여 단백질의 발현정도를 확인하였다.
- html에서 검색하여 주문 후 사용하였고 분석하고자 하는 유전자 특이적 gene 의 정보는 Table 1에서 나타내었다. 또한 Real-time PCR 반응 조건은 50℃에서 2분 95℃에서 10분 동안 1회 수행하고, 변성 온도 95℃에서 15초 어닐링 온도 60℃에서 15초인 사이클을 40회 반복 수행하였다.
- 또한 주름 관련 유전자 발현을 확인하기 위해서 HDFn 세포를 60 ㎜ dish에 2 × 105 개씩 분주한 후 24시간 동안 배양하고 자생 석곡추출물을 다양한 농도로 1시간 처리 한 뒤 TNF-α (10 ㎍/㎖)농도로 처리하여 주름 형성 관련 유전자 발현을 유도하여 6시간 동안 배양하고 PBS로 2회 세척 후 세포를 수확하였다.
- 먼저 1차 collagen 항체가 균일하게 도포된 96 well plate에 채취한 세포 배양액 20 ㎕과 2'항체 100 ㎕를 섞어 넣고, 37℃ 항온조에서 3시간 반응 시킨 뒤 PBS로 4회 세척한 다음 발색시켜 ELISA reader (Infinite 200 pro, TECAN Ltd., Mannedorf, Switzerland)로 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 미백관련 유전자 발현을 확인하기 위해서 B16F10 세포를 60 ㎜ dish에 1 × 105개씩 분주한 후 24시간 배양한다.
- 5㎍의 mRNA를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)를 이용하여 cDNA로 합성을 하였다. 실험은 제조사 매뉴얼에 따라 수행하였다. 합성된 cDNA 1 ㎕, taqman primer 1 ㎕, Taqman Universal Master Mix II (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) 10 ㎕, 3차 증류수 8 ㎕를 넣고 Real-time PCR기기 (ABI7500, Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
- 이에 MMP-1, −3의 유전자 발현을 조사하기 위하여 자생 석곡 추출물을 1시간 동안 전처리한 뒤 TNF-α로 MMP-1, −3 유전자 발현을 유도하고 유전자 발현을 Taqman gene expression 방식을 사용한 Real-Time PCR로 확인하였다.
- 이에 자생 석곡시료가 인체 진피 섬유아세포의 collagen 분해에 관련된 MMP 합성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 자생 석곡시료를 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 1시간 뒤에 TNF-α 를 처리한 뒤 6시간 배양한 후에 MMP들의 유전자 발현을 확인하였다.
- 자생 석곡 추출물에서 tyrosinase 활성 기전을 알아보기 위하여 MITF 및 TRP-1, −2 유전자 발현을 확인하였다.
- 자생 석곡 추출물이 B16F10 세포주에서 melanin 생합성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 자생 석곡 추출물 (10, 50, 100, 200 ㎍/㎖)과 대조군인 Arbutin 100 ㎍/㎖을 처리한 후 1시간 뒤에 α-MSH를 처리하여 melanin 생성을 유도한 후 72시간 배양하여 전체 melanin 함량을 비교하였다.
- 자생 석곡시료가 이러한 유전자의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 B16F10 세포주에 α-MSH와 자생 석곡 시료를 처리하여 24시간 후에 Reatime-PCR로 유전자발현을 확인하였다.
- 자생 석곡시료가 인체 진피 섬유아 세포의 procollagen 합성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 자생 석곡시료를 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 24시간 배양 후 procollagen 양을 조사하였다.
- , 2009). 자생 석곡의 주름 개선 효과를 확인하기 위하여 인체 섬유아세포주를 이용하여 석곡을 농도별로 처리한 뒤 24시간 배양하여 kit를 이용하여 procollagen 합성에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 석곡은 농도 의존적으로 procollagen 합성을 유도하는 것으로 나타났다.
- Tyrosinase는 melanin 생합성에 결정적인 효소로 알려져 있다. 자생 석곡추출물에 의해 tyrosinase 단백질 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해, B16F10 세포주에 농도별 (10, 50, 100, 200 ㎍/㎖)처리를 한 후 72시간 배양을 하였다. 그 결과 tyrosinase 단백질의 양이 두드러지게 자생 석곡추출물시료를 처리하였을 때 농도의존적으로 감소되는 것을 확인 할 수 있었다 (Fig.
- 실험은 제조사 매뉴얼에 따라 수행하였다. 합성된 cDNA 1 ㎕, taqman primer 1 ㎕, Taqman Universal Master Mix II (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) 10 ㎕, 3차 증류수 8 ㎕를 넣고 Real-time PCR기기 (ABI7500, Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 정량 중합 효소 반응에 쓰인 TaqMan gene은 http://www.
대상 데이터
- α-MSH와 L-DOPA는 Sigma Chemical Co. (St. Lousi, MO, USA)에서 구입하였고, Tyrosinase antibody는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA), Gapdh antibody 는 Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.
- B16F10 melanin 세포주는 한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 분양 받아 10% fetal bovine serum (FBS)이 첨가된 Dulbecco’s modified eagle's medium (DMEM)을 사용하였고, Human Dermal Fibroblasts, neonatal (HDFn) 세포는 Gibco에서 구입하여 Medium 106 배지에 Low Serum Growth Supplement (LSGS)를 넣고 CO2배양기 (MCO-17A1, Sanyo, Japan)에서 온도 37℃, 5% CO2조건에서 배양 하였다.
- Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM)과 fetal bovine serum (FBS), penicillin, streptomycin, Medium 106, Low Serum Growth Supplement는 Gibco/BRL (Eggenstein, Germany)에서 구입하였고, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium(MTS, CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay)는 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입하였다.
- (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. Procollagen type I C-prtide EIA kit는 Takara Bio, Inc. (Otsu, Shiga, Japan)에서 protein 정량에 사용하는 Bradford 시약은 Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA)에서 구입을 하였다.
- 정량 중합 효소 반응에 쓰인 TaqMan gene은 http://www. lifetechnologies.com/kr/ko/home/ life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays.html에서 검색하여 주문 후 사용하였고 분석하고자 하는 유전자 특이적 gene 의 정보는 Table 1에서 나타내었다. 또한 Real-time PCR 반응 조건은 50℃에서 2분 95℃에서 10분 동안 1회 수행하고, 변성 온도 95℃에서 15초 어닐링 온도 60℃에서 15초인 사이클을 40회 반복 수행하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 평균 ± 표준편차 (Mean ± SD)로 나타내었으며, 실험군 간의 유의성을 검정하기 위하여 SPSS (18.0, Statistical Package for Social Science, Inc., Chicago, IL, USA) 통계 패키지 프로그램을 활용하여 일원변량분석 (One way ANOVA)을 실시하였다.
- 유의성이 있는 경우, p < 0.05 수준에서 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)를 실시하였다.
이론/모형
- Effect of DM on cell viability in melanoma (B16F10) cells. Cell viability was evaluated with the MTS assay. Data represent the mean ± SD of triplicate determinations from three separate experiments.
- Western blot을 이용하여 tyrosinase 단백질의 발현 정도를 분석하였다. PAD 시료를 농도별로 처리한 실험군과 대조군을 24시간 배양 후 62.
- 그 후에 4℃ 13000 rpm 30분동안 원심분리를 통해 단백질이 든 상층액만을 가지고 tyrosinase activity를 측정하였다. 단백질 양을 Bradford 정량법 (Bradford, 1976)을 통해 595 ㎚로 ELISA를 측정을 하고 동일한 단백질을 이용해서 L-DOPA를 처리를 하여 540 ㎚ 흡광도로 세포내 tyrosinase activity를 측정하였다.
성능/효과
- B16F10 세포주에서 자생 석곡 메탄올 추출물의 독성을 조사하기 위해, MTS 실험을 수행하였다. 각각 B16F10 세포에 농도별 (10, 50, 100, 200, 500 ㎍/㎖)로 자생 석곡 추출물을 처리하고 24시간 후에 MTS를 처리한 결과 (Fig. 1) 가장 고농도인 500 ㎍/㎖ 은 약 80 %의 세포생존율을 나타내 약 20% 세포독성이 나타났지만 나머지 10, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 처리한 농도에서는 독성이 없는 것으로 나타났다.
- 자생 석곡 추출물에서 tyrosinase 활성 기전을 알아보기 위하여 MITF 및 TRP-1, −2 유전자 발현을 확인하였다. 그 결과 MITF 전사인자의 유전자 발현을 억제하였고, 그에 따라 TRP-1, TRP-2 유전자 발현량 또한 억제함을 확인하였다.
- 그 결과 TNF-α 처리 그룹에서는 MMP-1, −3 유전자 발현이 높게 나타남을 확인하였고, 그와 대조적으로 자생 석곡 추출물 처리군 중 가장 고농도인 200 ㎍/㎖ 그룹에서는 유의성 있게 유전자 발현이 억제함을 확인하였다.
- 자생 석곡추출물에 의해 tyrosinase 단백질 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해, B16F10 세포주에 농도별 (10, 50, 100, 200 ㎍/㎖)처리를 한 후 72시간 배양을 하였다. 그 결과 tyrosinase 단백질의 양이 두드러지게 자생 석곡추출물시료를 처리하였을 때 농도의존적으로 감소되는 것을 확인 할 수 있었다 (Fig. 4).
- 자생 석곡의 주름 개선 효과를 확인하기 위하여 인체 섬유아세포주를 이용하여 석곡을 농도별로 처리한 뒤 24시간 배양하여 kit를 이용하여 procollagen 합성에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 석곡은 농도 의존적으로 procollagen 합성을 유도하는 것으로 나타났다. 또한 각질형성세포와 섬유 아세포에 의해 분비되어 피부주름 생성에 관여하는 MMPs에 관하여 조사하였다.
- 그 결과 자생 석곡 추출물은 TNF-α를 처리한 대조군에 비하여 MMP-1, −3 유전자 발현을 농도 의존적으로 억제시키는 경향을 나타냈으나, 가장 고농도인 200 ㎍/㎖ 농도에서만 TNF-α 처리 대조군에 비하여 유의성을 나타냈다 (Fig. 7).
- 자생 석곡시료가 인체 진피 섬유아 세포의 procollagen 합성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 자생 석곡시료를 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 24시간 배양 후 procollagen 양을 조사하였다. 그 결과 자생 석곡 추출물은 처리하지 않은 대조군에 비하여 procollagen 합성을 농도 의존적으로 증대시켰으며, 처리한 가장 고농도인 200 ㎍/㎖ 농도에서 무처리군에 비해 procollagen 합성이 약 49% 증가 하였다 (Fig. 6).
- 그 결과 자생 석곡시료는 α-MSH에 의해 증가된 MITF, TRP1, TRP2의 mRNA level을 농도의존적으로 감소시켰다 (Fig. 5).
- 그 결과, α-MSH를 단독으로 처리한 세포군에 비해 자생 석곡추출물시료를 처리한 군에서 농도 의존적으로 melanin 함량이 감소되는 것을 알 수 있었다 (Fig. 2).
- 그 결과, α-MSH에 의해 tyrosinase 활성도가 증가한 것을 확인할 수 있었고 이를 자생 석곡추출물에 의해 α-MSH에 의해 증가된 tyrosinase 활성을 낮출 수 있는 것을 확인하였다 (Fig. 3).
- 2). 또한 자생 석곡추출물 시료 100, 200 ㎍/㎖ 처리한 그룹에서는 유의성 있게 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
- 이에 따라 자생 석곡 추출물이 melanin 형성세포주에서 melanin 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 α-MSH를 처리하여 멜라닌 생성을 유도한 결과 자생 석곡 추출물에서 농도 의존적으로 melanin 형성을 억제하였고 200 ㎍/㎖ 농도에서는 양성대조군으로 사용한 arbutin 100 ㎍/㎖ 처리한 것과 유사한 멜라닌 형성 억제 효과를 나타내었다. 이에 따라 멜라닌 형성에 관여하는 tyrosinase 활성을 조사한 결과 자생 석곡 추출물에서는 멜라닌 형성과 마찬가지로 농도의존적인 tyrosinase 활성의 억제와 단백질 발현 억제효과를 나타냈으며 이 또한 가장 고농도인 200 ㎍/㎖ 농도에서는 양성대조군인 arbutin과 유사한 활성을 나타내었다.
- 이에 따라 자생 석곡 추출물이 melanin 형성세포주에서 melanin 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 α-MSH를 처리하여 멜라닌 생성을 유도한 결과 자생 석곡 추출물에서 농도 의존적으로 melanin 형성을 억제하였고 200 ㎍/㎖ 농도에서는 양성대조군으로 사용한 arbutin 100 ㎍/㎖ 처리한 것과 유사한 멜라닌 형성 억제 효과를 나타내었다.
후속연구
- 위 연구결과들을 종합해 보면 자생 석곡 메탄올 추출물은 미백 및 주름개선 기능성이 있어 향후 피부자극, 피부감작성 등 식약처 기능성 화장품 인증 규정에 따른 안전성 실험으로 안전성이 확보된다면 기능성 화장품으로 개발 가능할 것으로 보인다.
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