본 연구에서는 상대적으로 우수한 총 페놀화합물 함량(84.25, 318.25 mg GAE/g)을 나타낸 사과 과육 및 과피의 EtOAc 분획물의 in vitro 항산화 효과, 미백 및 주름개선 효과를 알아보기 위해 다양한 연구를 진행하였다. 사과 과육 및 과피의 EtOAc 분획물의 ABTS radical 소거활성과 FRAP assay결과 농도 의존적인 경향이 나타났으며, 과피에서 높은 in vitro 항산화 활성을 보여주었다. 미백 효능을 알아보기 위한 자외선 흡수도 측정 결과 역시 두 시료 모두 UV-B (270-290 nm) 영역을 효과적으로 흡수하였으며, 특히 과피의 경우 UV-A (350-370 nm) 영역에서도 높은 흡수도를 보여주었다. 또한 멜라닌 함량 저해 효과를 분석한 결과 두 시료에서 모두 농도 의존적인 멜라닌 함량의 감소를 나타냈으나 특히 과피의 경우 positive control로서의 arbutin보다도 높은 저해 효과를 보여주었다. 더불어 사과 과피의 EtOAc 분획물은 500 ${\mu}g$/mL의 농도에서 46.40%의 elastase 저해활성 역시 보여주었다. 본 연구결과를 종합해 볼 때 다량의 페놀성 화합물을 함유한 사과 과피의 EtOAc 분획물은 항산화, 미백 및 주름개선 기능성화장품 소재로서의 활용 가치가 높다고 판단된다.
본 연구에서는 상대적으로 우수한 총 페놀화합물 함량(84.25, 318.25 mg GAE/g)을 나타낸 사과 과육 및 과피의 EtOAc 분획물의 in vitro 항산화 효과, 미백 및 주름개선 효과를 알아보기 위해 다양한 연구를 진행하였다. 사과 과육 및 과피의 EtOAc 분획물의 ABTS radical 소거활성과 FRAP assay결과 농도 의존적인 경향이 나타났으며, 과피에서 높은 in vitro 항산화 활성을 보여주었다. 미백 효능을 알아보기 위한 자외선 흡수도 측정 결과 역시 두 시료 모두 UV-B (270-290 nm) 영역을 효과적으로 흡수하였으며, 특히 과피의 경우 UV-A (350-370 nm) 영역에서도 높은 흡수도를 보여주었다. 또한 멜라닌 함량 저해 효과를 분석한 결과 두 시료에서 모두 농도 의존적인 멜라닌 함량의 감소를 나타냈으나 특히 과피의 경우 positive control로서의 arbutin보다도 높은 저해 효과를 보여주었다. 더불어 사과 과피의 EtOAc 분획물은 500 ${\mu}g$/mL의 농도에서 46.40%의 elastase 저해활성 역시 보여주었다. 본 연구결과를 종합해 볼 때 다량의 페놀성 화합물을 함유한 사과 과피의 EtOAc 분획물은 항산화, 미백 및 주름개선 기능성화장품 소재로서의 활용 가치가 높다고 판단된다.
The in-vitro whitening and anti-wrinkle effect of ethanol extracts from apple flesh and peel were investigated. The EtOAc fractions from the ethanol extracts of apple flesh and peel showed in-vitro antioxidant activities in a dose-dependent manner on ABTS radical-scavenging activity and ferric-reduc...
The in-vitro whitening and anti-wrinkle effect of ethanol extracts from apple flesh and peel were investigated. The EtOAc fractions from the ethanol extracts of apple flesh and peel showed in-vitro antioxidant activities in a dose-dependent manner on ABTS radical-scavenging activity and ferric-reducing/antioxidant power, and had the highest total phenolic contents (84.25 and 318.25 mg GAE/g). In addition, the EtOAc fractions generally showed strong UV absorption within the UV-B range. In the cellular system, the melanin synthesis of the B16/F10 melanoma cells was decreased by the EtOAc fractions of apple peel in a concentration-dependent manner. The EtOAc fractions of apple peel also showed a great elastase inhibition of 46.40% at 100 ${\mu}g$/mL, thus showing good in-vitro anti-wrinkle characteristics. These results suggest that the EtOAc fractions from the ethanol extract of apple peel can be used as whitening and anti-wrinkle agents as well as antioxidant resources.
The in-vitro whitening and anti-wrinkle effect of ethanol extracts from apple flesh and peel were investigated. The EtOAc fractions from the ethanol extracts of apple flesh and peel showed in-vitro antioxidant activities in a dose-dependent manner on ABTS radical-scavenging activity and ferric-reducing/antioxidant power, and had the highest total phenolic contents (84.25 and 318.25 mg GAE/g). In addition, the EtOAc fractions generally showed strong UV absorption within the UV-B range. In the cellular system, the melanin synthesis of the B16/F10 melanoma cells was decreased by the EtOAc fractions of apple peel in a concentration-dependent manner. The EtOAc fractions of apple peel also showed a great elastase inhibition of 46.40% at 100 ${\mu}g$/mL, thus showing good in-vitro anti-wrinkle characteristics. These results suggest that the EtOAc fractions from the ethanol extract of apple peel can be used as whitening and anti-wrinkle agents as well as antioxidant resources.
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문제 정의
그러나 지금까지 사과를 소재로 한 국내 많은 연구가 진행되었다고 보고되고 있지만 국내산 사과 과육 및 과피를 활용한 기능성 화장품 소재 개발 연구는 아직 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 국내산 사과 과육 및 과피를 통해 용매 분획을 실시하여, 총 페놀성 화합물 함량이 가장 높았던 EtOAc 분획물을 가지고 ABTS, FRAP과 같은 in vitro 항산화 활성과UV 흡수도 조사, melanogenesis inhibitory assay 와 같은 미 백효과 및 elastase inhibitory assay와 같은 주름개선 효능시험을 실시하여 사과 과육 및 과피의 화장품 소재로서의 응용 가능성을 살펴보고자 하였다.
제안 방법
Methanol 에 검색시료를 녹여 UV-spctrophotometer를 이용하여 200 〜500 nm에서의 흡수도를 측정하였다(20).
동안 배양하였다. 그리고 125, 250, 500 ug/mL의 사과과육 및 과피의 EtOAc 분획물과 1 μM의 ct-MSH를 처리하여 37℃에서 48시간 동안 배양 하였다. 배양이 끝나고 난후 1% (w/v) phosphate buffered saline (PBS) 로 3 회 반복하여 수세하였다.
멜라닌은 자외선 등으로부터 피부를 보호하는 역할을 하지만 이의 과다 생성은 기미, 주근깨, 검버섯, 피부암 등의 질환을 유발한다. 본 연구에서는 멜라닌 생성세포인 B16/F10 melanoma cell line을 이용하여 사과 과육 및 과피의 EtOAc 분획물이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 즉정하였다. B16/F10 melanoma 세포 배양에서 기본배지만을 사용한 것을 control로 하고 1 ]jM의 a -MSH (melanocyte stimulating homione) 만을 첨가한 것, 그리고 q-MSH를 첨가한 배지에 positive control로서의 arbutin, 사과 과육 및 과피의 EtOAc 분획물을 농도별로 첨가하였을 때 멜라닌 합성 저해 정도를 측정한 결과는 Fig.
배양이 끝나고 난후 1% (w/v) phosphate buffered saline (PBS) 로 3 회 반복하여 수세하였다. 수세가 끝난 배 양액은 2, 000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상징 액을 제거하고, 물에 불용성을 나타내는 멜라닌의 액화를 일으키기 위하여 1 N NaOH 200 μL를 가하고 80℃에서 1시간 끓여 멜라닌을 완전히 녹인 후 96 well plate에 100 μL를 옮기고 405 nm에서 흡광도를 측정하여 a-MSH만을 첨가하였을 때와 저해제인 arbutin과 사과과육 및 과피의 EtOAc 분획물을 동시에 첨가하였을 때 나타내는 melanin 합성의 상대적 변화량을 조사하였다<21).
사과용매 분획물의 조제는 음건 후, 세절한 분말시료에 ethanol 을 시료 대비 l:10(w/v)의 비율로 혼합하여 2시간 동안 환류냉각 주줄하였다. 이 주줄액을 No. 2 여과지 (Whatman pic., Kent, UK)로 여과하여 진공회전농축기(EYLYA Co, Tokyo, Japan)로 45℃에서 농축하고, 이 추출물을 극성 차를 이용해서로 다른 용매를 첨가하여 단계적으로 분획하였다. 사과에탄올 추출물에 chlorofcrm과 물을 1:1 비율로 분획 깔대기에 넣고 chloroform층과 물층을 분획하였고, 물층을 다시 ethyl acetate와 1:1비율로 분획 깔대기에 넣고 ethyl acetate 와 물층을 분획 한 후 농축하여 -20℃ 냉동고에 보관하면서각 실험에 사용하였다.
이 혼합 용액을 23℃에서 2시간 동안 정치한 후 760 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 gallic acid를 이용하여 작성된 검 량선으로 총 페놀화합물함량을 계산하였다(17).
대상 데이터
제공받아 사용하였다. 본 실험에 사용된 시약으로 Folin & Ciocalteau's phenol reagent, 2, 2, -azobis-(2- amidinopropane) dihydrochloride (AAPH), 2, 2, -azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid) diammonium salt (ABTS), 2, 4, 6-trip-yridyl-S-triazine (TPTZ) solution, arbutin, a-melanocyte stimulating hormone (cl-MSH), N-succinyl- (Ala)3-p-nitroanilide, 및 1 unit elastase (porcine pancreas solution) 는 Sigma Chemical Co(St Louis, MO, USA) 제품을 구입하여 사용하였고, 그 외 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 GR (Guaranteed pure) 등급을 사용하였다. 사과용매 분획물의 조제는 음건 후, 세절한 분말시료에 ethanol 을 시료 대비 l:10(w/v)의 비율로 혼합하여 2시간 동안 환류냉각 주줄하였다.
본 실험에서 시용한 B16/F10 melanoma 세포(CRL- 6475M, ATCC, USA)는 25 mM HEPES, 25 mM sodium bicarbonate, 10% fetal bovine serum (Gibco BRL Co, Grand Island, NY, USA), 50 units/mL penicillin 및 100 pg/mL streptomycin이 포한된 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) 배지를 배양액으로 하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
본 연구에 사용된 사과는 경상남도 거창군 월천면 소재에서 2010년 9월경 에 수확한 품종인 부사(Malus pumila MILL)를 제공받아 사용하였다. 본 실험에 사용된 시약으로 Folin & Ciocalteau's phenol reagent, 2, 2, -azobis-(2- amidinopropane) dihydrochloride (AAPH), 2, 2, -azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid) diammonium salt (ABTS), 2, 4, 6-trip-yridyl-S-triazine (TPTZ) solution, arbutin, a-melanocyte stimulating hormone (cl-MSH), N-succinyl- (Ala)3-p-nitroanilide, 및 1 unit elastase (porcine pancreas solution) 는 Sigma Chemical Co(St Louis, MO, USA) 제품을 구입하여 사용하였고, 그 외 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 GR (Guaranteed pure) 등급을 사용하였다.
데이터처리
모든 실험은 3회 반복 실시하여 mean土SD로 나타내었으며, 각 평균값에 대한 검증은 SAS version 6.12(SAS Institute, Cary, NC, USA)를 이용하여 평균과 표준오차를 나타내었다.
성능/효과
ABTS radical 소거활성 (Fig. 1(A))은 추출물의 농도가 증가함에 따라 소거활성이 크게 증가하는 경향이 나타났고, 특히 과피의 경우 농도 500 U g/mL에서는 98.71%로 가장 높은 ABTS radical 소거 활성을 나타내었으며, positive control로 사용된 vitamin C (500 μg/mL)에 가까운 in vitro 항산화 활성을 나타내었다. Park 등(25)은 효소를 이용한 사과 껍질 추출물로부터 ABTS radical 소거 활성을 측정한 결과 4 n@mL에서 100%에 가까운 radical 소거효과가 나타난다고 보고하였다.
1(B)에서 보는 바와 같다. ABTS radical 소거 활성 측정과 비교하여 큰 활성이 나타나지는 않았지만 역시농도가 62 ug/mL에서 500 ng/mL로 증가함에 따라 흡광도가 농도의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 특히 농도 500 ㎍/mL에서는 과육에 비해 과피에서 4배 이상의 활성을 나타냈다.
Melanogenesis stimulating agent 인 a-MSH를 처 리 한 경 우 B16/F10 melanoma 세포에 의해 생성된 멜라닌 함량은 control에 비해서 약 20% 증가하였으며, 사과 과육 및 과피의 EtOAc 분획물을 125, 250, 500 u^mL 농도별로 처리하여 멜라닌 합성 억제를 확인한 결과 농도의존적인 멜라닌 색소생성 저해가 나타났다. 특히 농도 500 iig/mL에서의 과피의 경우 positive control로 사용된 arbutin (500 pg/mL) 에 비해 40% 이상의 높은 저해 효과를 보여주었다.
본 연구에서 사용하고자 하는 국내산 사과는 식이섬유, vitamin C 및 phenolics 등 다양한 기능성 성분을 함유하고 있으며 심혈관 질환 및 암 등 성인병 예방에 효과가 있는 것으로 알려지고 있다(8, 9). 폴리페놀은 사과의 주된 항산화 활성 성분(10, 11)으로 특히 과피에 함유량이 높아 과육과 비교하여 품종에 따라 약 2-9배 정도 많은 것으로 알려졌다 (12, 13).
4와 같다. 사과과육 EtOAc 분획물에서는 저해 활성 이 나타나지 않았으나, 과피의 경우 농도가 증가함에 따라 점차적으로 증가하는경 향을 보였다. 특히 농도 500 ug/mL의 경우 46.
특히 농도 500 iig/mL에서의 과피의 경우 positive control로 사용된 arbutin (500 pg/mL) 에 비해 40% 이상의 높은 저해 효과를 보여주었다. 이러한 결과를 종합해 볼 때 총 페놀성 화합물 함량 및 항산화 활성은 멜라닌 생성 억제와 높은 연관성이 있는 것으로 유추되며, 이는 과육 보다는 과피에 다량 존재하고 있는 페놀성 생리활성 물질들로부터 기인한 것으로 판단된다.
2(B)의 사과과피에서는 UV-A 와 UV-B 영 역 모두 흡수도가 높았다. 이상의 결과로 미루어 사과 과피의 EtOAc 분획물은 피부에 도포 시 UV-A 와 UV-B의 넓은 영역에서의 자외선 차단효과를 기대할 수 있는 것으로 판단된다. Hwang(28)은 백삼에 함유된 활성 성분 중에서 cinnamic acid가 UV-B 영역에서 가장 특징적인 흡수를 나타내고, 홍삼의 특이성분인 maltol 역시 UV-B 영역의 자외선을 흡수하였다고 보고하였는데 본 연구에 사용된 사과의 성분 중에서 자외선 차단에 주된 역할을 하는 활성성분에 관한 연구가 향후 필요하다고 판단된다.
사과 과육 및 과피의 용매 분획물의 총 페놀성 화합물 함량은 Table 1에서 나타낸 바와 같다. 특히 ethyl acetate (EtOAc) 분획물의 사과 과육 및 과피의총 페놀성 화합물 함량 측정 결과 각각 84.25 mg/g과 318.25 mg/g으로 가장 높게 나타났으며, 과육보다 과피에서 약 4배 정도 높은 함량을 보여 주었다. Schieber & Tsao(12, 13) 등은 대부분의 사과는 품종에 따라 과육보다 과피에서 2-9 배 정도 높은 총 페놀성 화합물 함량이 나타난다고 보고하여 본 실험과 유사한 결과를 보여주었다.
후속연구
이상의 결과로 미루어 사과 과피의 EtOAc 분획물은 피부에 도포 시 UV-A 와 UV-B의 넓은 영역에서의 자외선 차단효과를 기대할 수 있는 것으로 판단된다. Hwang(28)은 백삼에 함유된 활성 성분 중에서 cinnamic acid가 UV-B 영역에서 가장 특징적인 흡수를 나타내고, 홍삼의 특이성분인 maltol 역시 UV-B 영역의 자외선을 흡수하였다고 보고하였는데 본 연구에 사용된 사과의 성분 중에서 자외선 차단에 주된 역할을 하는 활성성분에 관한 연구가 향후 필요하다고 판단된다.
28 mg GAE/g(24)보다 높은 결과를 나타내어 향장 및 관련 산업소재로서의 활용 가능성이 클 것으로 기대된다. 다만 기능성 미백소재로서의 가능성을 보다 구체화하기 위해서는 사과에 포함된 main phenolics에 대한 chemical analysis 등이 보완되어야 할 것으로 사료된다.
또한 Kelly(14)등은 미국에서 주로 즐겨먹는 사과의 품종에 따른 과육 및과피의 총 페놀성 화합물 함량을 조사한 결과 과육보다 과피에서 2-6배 정도 높게 나타나는 것으로 확인하였다. 또한 본 연구 결과는 열대 과일 중 하나인 리치 과피의 50% 메탄올 추출물의 총 페놀성 화합물 함량인 12.28 mg GAE/g(24)보다 높은 결과를 나타내어 향장 및 관련 산업소재로서의 활용 가능성이 클 것으로 기대된다. 다만 기능성 미백소재로서의 가능성을 보다 구체화하기 위해서는 사과에 포함된 main phenolics에 대한 chemical analysis 등이 보완되어야 할 것으로 사료된다.
Han 등(27)은 다양한 생리활성을 나타내는 항산화 물질은 연속적인 산화과정에 의해 생성되는 멜라닌 색소형성을 막을 수 있을 뿐만 아니라 활성산소 소거를 통해서도 멜라닌 색소 형성을 막을 수 있는 미백 물질임을 보고하였다. 이와 관련하여 사과 과피로부터 다양한 생리활성 물질들을 좀 더 효율적으로 추출함으로써 향후 기능성 식품 및 미백 관련 산업 소재화 등으로의 활용가능성이 높아질것으로 판단된다.
9%의 높은 효과가 나타났다고 보고하였다. 이와 비교하였을 때, 사과 과피의 EtOAc 분획물의 elastase 저해활성이 상대적으로 우수한 것으로 나타났으며, 이로써 향후 사과 과피 EtOAc 추출물이 주름 개선 관련 기능성 화장품 소재로서 활용 가치가 높다고 판단된다.
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