갯벌은 영양염 순환과 오염물질 제거 등 환경적으로 가지는 의미가 크다. 이에 갯벌에서 아밀라아제, 셀룰라아제, 프로테아제, 리파아제를 생성하여 유기물을 분해하는 190균주를 순수분리하고 효소 활성 실험을 통해 그 중 활성이 좋은 균주를 선택하였으며 16S rRNA유전자 분석을 통해 Pseudoalteromonas sp. IC35 (KE804087)로 동정하였다. 또 무기황(S0)을 에너지원으로 하여 최소배지에서 생존 가능한 황산화 세균을 31균주를 순수 분리하고 sulfate ion을 측정하여 황산화능력이 뛰어난 세균을 16S rRNA 분석하여 Halothiobacillus neapolitanus IC_S22 (KE804088)로 동정하였다. 이렇게 분리한 균주들이 환경에서 활성을 가지는 지를 측정하기 위해 유기물 분해에 대해(대조군 M1, 접종군 M2)와 황산화능력에 대해(대조군 M3, 접종군 M4)의 microcosam 반응기를 각각 구축하였다. Pseudoalteromonas sp. IC35를 접종한 M1에서 비접종군인 M2에 비해 유기물 분해 효율이 증가되었으며 microcosm 반응기 내의 생물량도 증가됨을 확인하였다. H. neapolitanus IC_S22을 접종한 M3에서 비접종군인 M4에 비해 환원성 황($S_0$)을 산화하는 능력이 상승되었으며 real time PCR을 이용하여 pilot 내에서 세균의 생물량이 증가함에 따라 초기 sulfate ion의 양도 증가함을 확인하였다. 이번 연구를 통해 대사활성이 우수한 균주를 부가적으로 환경에 접종함으로써 기존 세균 군집에 의한 환경정화 능력을 증가 시키는 것으로 사료된다.
갯벌은 영양염 순환과 오염물질 제거 등 환경적으로 가지는 의미가 크다. 이에 갯벌에서 아밀라아제, 셀룰라아제, 프로테아제, 리파아제를 생성하여 유기물을 분해하는 190균주를 순수분리하고 효소 활성 실험을 통해 그 중 활성이 좋은 균주를 선택하였으며 16S rRNA유전자 분석을 통해 Pseudoalteromonas sp. IC35 (KE804087)로 동정하였다. 또 무기황(S0)을 에너지원으로 하여 최소배지에서 생존 가능한 황산화 세균을 31균주를 순수 분리하고 sulfate ion을 측정하여 황산화능력이 뛰어난 세균을 16S rRNA 분석하여 Halothiobacillus neapolitanus IC_S22 (KE804088)로 동정하였다. 이렇게 분리한 균주들이 환경에서 활성을 가지는 지를 측정하기 위해 유기물 분해에 대해(대조군 M1, 접종군 M2)와 황산화능력에 대해(대조군 M3, 접종군 M4)의 microcosam 반응기를 각각 구축하였다. Pseudoalteromonas sp. IC35를 접종한 M1에서 비접종군인 M2에 비해 유기물 분해 효율이 증가되었으며 microcosm 반응기 내의 생물량도 증가됨을 확인하였다. H. neapolitanus IC_S22을 접종한 M3에서 비접종군인 M4에 비해 환원성 황($S_0$)을 산화하는 능력이 상승되었으며 real time PCR을 이용하여 pilot 내에서 세균의 생물량이 증가함에 따라 초기 sulfate ion의 양도 증가함을 확인하였다. 이번 연구를 통해 대사활성이 우수한 균주를 부가적으로 환경에 접종함으로써 기존 세균 군집에 의한 환경정화 능력을 증가 시키는 것으로 사료된다.
Tidal flats are continuously contaminated by human activities. This study assessed the bioremediation efficiency of tidal flat soil using microcosm reactors and microorganisms originating from the tidal area. We screened 135 bacterial strains that produce extracellular enzymes from the tidal area lo...
Tidal flats are continuously contaminated by human activities. This study assessed the bioremediation efficiency of tidal flat soil using microcosm reactors and microorganisms originating from the tidal area. We screened 135 bacterial strains that produce extracellular enzymes from the tidal area located in the North port of Incheon bay. Two bacterial strains (Pseudoalteromonas sp. and IC35 Halothiobacillus neapolitanus IC_S22) were selected and used in the microcosm reactors, which were specially designed to functionally mimic the ecological conditions of the tidal flats. Pseudoalteromonas sp. IC35 was selected based on its relatively high activity of the enzymes amylase, cellulose, lipase, and protease. Halothiobacillus neapolitanus IC_S22 was selected for oxidation of sulfur. The M1 and M2 microcosm reactors were operated by continuous feeding of seawater under the same conditions, but M2 was first inoculated with Pseudoalteromonas sp. IC35 before the seawater feeding. The initial COD in both the M1 and M2 microcosm reactors was 320 mg/l. The final COD was 21 mg/l (M1) and 7 mg/l (M2). The M3 and M4 microcosm reactors were operated by continuous feeding of seawater under the same conditions, but M4 was first inoculated with H. neapolitanus IC_S22. The initial sulfate concentration in both the M3 and M4 microcosm reactors was 660 mg/l, and the maximum sulfate concentration was 1,360 mg/l (M3) and 1,600 mg/l (M4).
Tidal flats are continuously contaminated by human activities. This study assessed the bioremediation efficiency of tidal flat soil using microcosm reactors and microorganisms originating from the tidal area. We screened 135 bacterial strains that produce extracellular enzymes from the tidal area located in the North port of Incheon bay. Two bacterial strains (Pseudoalteromonas sp. and IC35 Halothiobacillus neapolitanus IC_S22) were selected and used in the microcosm reactors, which were specially designed to functionally mimic the ecological conditions of the tidal flats. Pseudoalteromonas sp. IC35 was selected based on its relatively high activity of the enzymes amylase, cellulose, lipase, and protease. Halothiobacillus neapolitanus IC_S22 was selected for oxidation of sulfur. The M1 and M2 microcosm reactors were operated by continuous feeding of seawater under the same conditions, but M2 was first inoculated with Pseudoalteromonas sp. IC35 before the seawater feeding. The initial COD in both the M1 and M2 microcosm reactors was 320 mg/l. The final COD was 21 mg/l (M1) and 7 mg/l (M2). The M3 and M4 microcosm reactors were operated by continuous feeding of seawater under the same conditions, but M4 was first inoculated with H. neapolitanus IC_S22. The initial sulfate concentration in both the M3 and M4 microcosm reactors was 660 mg/l, and the maximum sulfate concentration was 1,360 mg/l (M3) and 1,600 mg/l (M4).
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문제 정의
본 연구에서는 북항 갯벌에서 세포 외 효소를 생성하여 유기물을 분해하는 세균과 유황계 악취의 원인이 되는 황(S0)을 산화하는 세균을 분리하여 오염된 갯벌 정화를 위한 생물학적 제재로서의 가능성을 평가하였다.
제안 방법
Genome DNA를 추출(DNA extraction, Cosmo_geneteck, Korea)하여 16S rRNA 염기서열의 분석으로 세균 동정을 위해 27 (F), 518 (R) 프라이머(10 pmol)를 각각 5 μl, 주형 DNA 5 μl, PCR premix 10 μl을 혼합물로 하여 총 20 μl를 핵산증폭기(2720 thermal cycle, Applied Biosystems, USA)를 이용하여 증폭하였다(Table 1). 조건은 94℃에서 10분간 반응 후, 94℃에서 1분, 54℃에서 45초, 72℃에서 45초로 35회 반복 반응하고 72℃에서 10분간 추가 반응시켰다.
이에 북항 갯벌을 이용하여 pilot scale의 갯벌 모형을 구축 하여 북항에서 분리한 세균을 대량 배양 후 다시 microcosm 반응기에서 재현한 갯벌환경에 적용하여 세균의 생리적 생태적 기능이 실제 환경에 적용할 수 있는 수준으로 나타나는지 평가하였다. 또 real time PCR을 이용하여 주입한 세균의 생존력과 화학적 산소요구량(chemical oxygen demand, COD), sulfate이온을 측정하여 접종한 세균의 생리적인 기능과 생태적인 자정능력의 상관성을 분석하였다.
북항 갯벌에서 순수 분리한 190균주 중 각각의 기질이 포함된 평판배지를 이용하여 아밀라아제, 셀룰라아제, 리파아제, 프로테아제를 생성하는 135균주를 선별하였으며 이들 중 2가지 이상 기질에 교차로 활성이 좋은 균주 30균주를 분리하였다. 이들 균주 중 가장 활성이 좋았던 strain IC35는 기질이 포함된 평판 배지에서 기질을 분해하여 아밀라아제 48 mm, 셀룰라아제 36 mm, 리파아제 22 mm, 프로테아제 28 mm의 환을 생성하였다.
분리한 균주를 직접 갯벌 토양에 적용하였을 때 정화능력을 측정하기 위해 실제 북항 갯벌을 이용한 microcosm 반응기(M1, M2, M3, M4)를 구축하였으며 이 중 유기물 분해 미생물에 의한 환경적 변화를 측정하기 위한 대조군 M1과 접종군 M2를 이용하였다. M1와 M2 반응기의 최초 COD값은 320 mg/l이였으며 접종 직후(initial inoculation)부터 3차 접종(21일째)까지는 COD값이 급감하였으며 최종적으로 대조군인 M1의 COD는 21 mg/l, 접종군인 M2의 COD는 7 mg/l로 모두 감소하여 생태계에 존재하는 기존의 세균 군집에 의해서도 유기물의 분해가 활발하게 이루어짐을 확인할 수 있었다(Fig.
이에 북항 갯벌을 이용하여 pilot scale의 갯벌 모형을 구축 하여 북항에서 분리한 세균을 대량 배양 후 다시 microcosm 반응기에서 재현한 갯벌환경에 적용하여 세균의 생리적 생태적 기능이 실제 환경에 적용할 수 있는 수준으로 나타나는지 평가하였다. 또 real time PCR을 이용하여 주입한 세균의 생존력과 화학적 산소요구량(chemical oxygen demand, COD), sulfate이온을 측정하여 접종한 세균의 생리적인 기능과 생태적인 자정능력의 상관성을 분석하였다.
대상 데이터
인천 연안의 항구 근처에 있는 갯벌인 북항 갯벌(latitude:37°29'28.07", 37°29'29.40", 37°29'44.40", longitude: 126°37'10.58", 126°37'10.10", 126°38'18.30")의 3지점에서 멸균 도구를 이용하여 표면으로부터 10 cm의 갯벌을 채취하고 아이스 팩에 담아 이동 후 실험실에서 균일하게 혼합하여 시료로 사용하였다.
이때 standard는 tyrosine을 이용하였다[15, 20]. 효소 활성에 대한 비교 균주로 아밀라아제는 Bacillus amyloliquefaciens KACC10110, 셀룰라아제는 Pseudomonas fluorescens KACC10093, 리파아제는 Pseudomonas aeruginosa KACC10259, 프로테아제는 Bacillus thuringiensis KACC10184를 사용하였으며 농촌진흥청의 농업 유전자자원센터에서 분양받아 실험하였다.
이론/모형
증폭된 유전자 산물을 pGEM T-vector (Promega, USA)에 ligation시킨 후 one-shot Top chemically compotent cell (Invitrogen, USA)에 형질전환 시켜 X-gal과 IPTG가 첨가된 Luria-Bertani 배지(Difco, USA) 에서 colony를 선택하여 정제(Plasmid purification kit, Cosmo_ geneteck, Korea)하고 Cosmo_geneteck (Korea)에 의뢰하여 유전자 분석을 하였다. 염기서열간의 유사도를 확인하기 위해 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) search를 이용하여 NCBI (National Center for Biotechnology Information) genbank의 유전자 데이타와 비교 분석하였으며 유사한 종(spcies)들과 염기서열 유사도를 확인하기 위해 Bio-Edit (ver, 7.2.3.)과 Phylogenetic tree version mega (ver, 5.2)를 이용하였다[12].
5%소금물을 교환하고(1회/주), 교환 후 7일 동안 반응한 소금물에 대해 정화정도를 측정하였다. 유기물 분해 정도를 측정하기 위한 COD는 해양환경공정시험법의 과망간산알칼리법으로 1시간 동안 유기물을 분해시켜 소모된 KMnO4의 양으로부터 유기물량을 계산하였고 환원성 황의 산화정도는 소금물내 sulfate ion (Hach, USA)의 변화를 측정하였다.
성능/효과
IC35와 황산화능력이 뛰어난 Halothiobacillus neapolitanus IC_S22를 분리하고 갯벌과 유사한 모형인 microcosm 반응기를 구축하여 COD와 sulfate ion의 변화를 측정하였다. 그 결과 갯벌에서는 기존의 세균 군집의 생태적인 기능에 의해 유기물이 분해되며 황산화 작용도 일어나고 있지만 대사활성이 우수한 균주를 추가적으로 접종하여 그 활성이 증가한 것으로 사료된다. 그러나 microcosm 반응기에서 실험적으로 얻은 결과를 자연 생태계에서 재현하는 것은 복잡한 생지화학적 parameter를 lab scale과 pilot scale에서 정량적으로 산출, 적용해야 하기 때문에 이와 관련된 정보의 수집, 분석, 응용 및 관련 실험을 통한 지속적인 연구가 필요하겠다.
네 종류의 세포 외 효소의 활성이 우수했던 strain IC35의 16S rRNA의 염기서열 분석결과 Pseudoalteromonas sp (JQ082185)와 유전적 유사도가 가장 높았다(Fig. 2, A)
이 균주의 16S rRNA의 염기서열은 Fig. 2와 같이 Halothiobacillus neapolitanus strain C2 (NR074679)와 유전적 유사도가 가장 높았다(Fig. 2, B)
후속연구
그 결과 갯벌에서는 기존의 세균 군집의 생태적인 기능에 의해 유기물이 분해되며 황산화 작용도 일어나고 있지만 대사활성이 우수한 균주를 추가적으로 접종하여 그 활성이 증가한 것으로 사료된다. 그러나 microcosm 반응기에서 실험적으로 얻은 결과를 자연 생태계에서 재현하는 것은 복잡한 생지화학적 parameter를 lab scale과 pilot scale에서 정량적으로 산출, 적용해야 하기 때문에 이와 관련된 정보의 수집, 분석, 응용 및 관련 실험을 통한 지속적인 연구가 필요하겠다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
생물정화기법(bioremediation)은 어떤 특징을 갖고 있어, 선호되고 있는가?
최근 진환경적으로 환경을 정화하고자 하는 노력으로 미생물을 이용한 생물정화기법(bioremediation)이 선호되고 있다. 이는 미생물의 세포 외 효소로 고분자 물질을 분해하고 세포내 대사를 통해 저분자 물질로 이화할 수 있는 특정한 세균의 개체군 밀도를 증가시키고 이러한 미생물의 대사활성의 증가를 유도하여 생태계의 자정능력을 높이는 것이다[19].
갯벌은 어떤 곳에서 형성되는가?
갯벌은 육상과 해안의 중간지점으로 지형이 완만하고 조석간만의 차이가 큰 곳에 형성된다. 이 지역은 수생생물의 산란 및 성장 장소가 되고 홍수예방, 해안선 침식방지 등 지리적으로 중요할 뿐만 아니라 육상의 하천과 담수로부터 유입되는 각종 유기물과 무기염류 등의 오염물질이 바닷물에 유입되기전에 정화하기 때문에 생태기반의 물질순환을 위해 유용하다[4, 14].
인천 연안의 갯벌이 생태계가 훼손되면 복구되기 어려운 입지조건인 이유는?
인천 연안의 갯벌은 한강, 임진강, 예성강에 의해 육지에서 공급되는 담수와 바다에서 유입되는 해수가 혼합되는 반폐쇄형 지역으로 환경오염에 노출되어 있으며 생태계가 훼손되게되면 복구되기 어려운 입지조건이다[14]. 특히 북항은 중국과 근접한 지리적 이점을 이용하여 갯벌 일부를 매립하여 만든 항만으로 원유, 공산품 등 수도권의 물류량의 이동통로이고 석탄 부두, 시멘트 공장 등에서 발생하는 폐기물질에 의한 오염이 가중되어 갯벌 토양의 물질순환을 저해하여 악취가 증가하고 있다[4, 13].
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