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문제 정의
- 2005년부터 2006년까지 전국 16개 시도에서 PRDC로 진단된 461개 시료에 대해 원인체, 발생연령, 혼합감염 형태를 분석하고, 원인 체의 진단 방법의 비교, PRDC의 높은 발생 빈도를 나타내는 2종 또는 3종 혼합 감염된 시료를 대상으로 cytokine 발현의 변화에 대해 조사하여 국내에서 발생하는 PRDC의 발생양상과 발병기전을 이해하고자 하였다. 이유돈(3주령~10주령)에서 질병은 특히 증체율이 낮아져 양돈농가의 수익성 감소를 초래한다.
제안 방법
- Cytokine에 대한 Quantitative real-time PCR의 primer [3, 11, 14]는 design TIB MOLBIOL (Germany)사에 의뢰하여 합성하였다. Real-time PCR 반응은 cDNA 2 μl, 각각의 cytokine primer (20 pmol) set 1 μl, probe (40 pmol), Premix Ex Taq (Takara, Japan) 12.
- PRDC의 발생 양상 중에서 가장 높은 빈도로 나타나는 2종과 3종의 감염원에 의해 혼합 감염된 시료를 대상으로 cytokine 유전자의 발현을 비교하였다. 각각의 실험결과는 no template control (NTC), RT- control을 사용하여 각각의 실험마다 사용하였고 PCR반응의 결과에서 NTC와 RT-control은 형광반응을 보이지 않았다.
- PRDC의 예방과 치료를 위해서는 정확한 원인균의 검출이 요구된다. PRDC의 확진을 위해서 사용하고 있는 조직항원염색방법(IHC)은 균들간의 항원교차반응에 의해 정확성이 떨어지는 경향이 있어 정확한 원인균의 검출을 위해서 PCR 방법을 이용하여 두 진단 방법간의 정확도를 비교하였다. PRRSV, PCV-2에 대한 면역조직화학염색과 PCR 방법과의 원인균의 검출율을 비교한 결과 PCR 방법이 IHC보다 원인균인 PRRSV, PCV-2의 검출에 효과적인 것으로 나타났다.
- Real-time PCR 반응은 cDNA 2 μl, 각각의 cytokine primer (20 pmol) set 1 μl, probe (40 pmol), Premix Ex Taq (Takara, Japan) 12.5 μl, DNA-RNA free water 10.5 μl를 첨가하여 총 25 μl를 맞추어 사용하였고 반응액은 Smart cyclerⅡ (Cepheid, USA)를 이용하여 95℃에 5초 반응, 95℃ 10초, 60℃ 30초 50회 반복하여 CT값을 측정하였다.
- 균의 동정을 위한 RNA sample은 One-step RT PCR kit (Qiagen, USA)를, DNA는 Premix Taq (Bioneer, Korea)를 이용하여 균 종의 특이 DNA fragment를 확인하였다[13, 21].
- 2005년부터 2006년까지 전국 16개 시도에서 호흡기증상으로 PRDC로 진단된 461개의 시료를 사용하였다. 수집된 시료로부터 DNA와 RNA를 추출하여 항원검사와 유전자검사 통하여 감염된 바이러스와 세균을 동정하였다. 항원검사는 IHC (DiscoveryTM, Ventana Medical Systems, USA)를 이용하여 제조사가 제공한 manual에 따라 실시하였다.
- 바이러스 및 세균의 유전자 검사를 위하여 채취한 폐, 림프절은 실험에 사용할 때까지 -20℃의 냉동상태로 보관하였다. 시료로부터 DNA와 RNA는 각각 QIAmp DNA mini kit (Qiagen, USA)와 RNeasy mini kit (Qiagen, USA)를 이용하여 추출하였다. 추출한 RNA는 spectrophotometer (Nanodrop ND-1000, Nanodrop technologies, USA)를 이용하여 정량하였다.
- 흉선에서는 IL-10의 발현을 증가시켜 thymocyte의 성숙을 방해함으로써 면역억제를 일으키는 것으로 보고되었다[8]. 아직까지 PRDC에 대해서는 다른 돼지 호흡기 질병에 비해 면역학적 연구가 미흡하여, PRDC에 대한 면역생화학적 연구가 PMWS의 예와 같이 혼합감염에 의한 질병유발 기전을 이해하는데 중요한 요소가 될 것으로 판단되어 국내에서 발생한 PRDC를 대상으로 발생상황, 원인균의 종류와 감염형태를 조사하고 혼합 감염된 경우에 대해서 cytokine의 발현의 변화를 조사하였다.
- 정량한 RNA 1 μg을 reverse transcription을 위해 PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time, Takara, Japan)을 이용하여 37℃에서 15분 동안 반응한 다음 85℃에서 5초간 불활화한 후에 PCR에 사용하였다.
- 시료로부터 DNA와 RNA는 각각 QIAmp DNA mini kit (Qiagen, USA)와 RNeasy mini kit (Qiagen, USA)를 이용하여 추출하였다. 추출한 RNA는 spectrophotometer (Nanodrop ND-1000, Nanodrop technologies, USA)를 이용하여 정량하였다. 정량한 RNA 1 μg을 reverse transcription을 위해 PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time, Takara, Japan)을 이용하여 37℃에서 15분 동안 반응한 다음 85℃에서 5초간 불활화한 후에 PCR에 사용하였다.
대상 데이터
- 2005년부터 2006년까지 전국 16개 시도에서 호흡기증상으로 PRDC로 진단된 461개의 시료를 사용하였다. 수집된 시료로부터 DNA와 RNA를 추출하여 항원검사와 유전자검사 통하여 감염된 바이러스와 세균을 동정하였다.
- PRDC에서 cytokine 발현의 변화를 조사하기 위해서 본 연구의 결과에서 PRDC 발생의 발생이 가장 높은 빈도로 나타나는 2종과 3종 혼합감염(82.5%)을 대상으로 조사하였다. Cytokine의 발현을 분석한 결과 2종 및 3 종 혼합 감염군에서 IL-6를 제외한 조사한 모든 cytokine에서 동일한 양상을 보였다.
데이터처리
- 상대정량 값은 cytokine gene의 threshold cycle (Ct)값에 세가지 housekeeping gene의 threshold cycle (CT) 평균값을 나눈 값을 하였으며, 본 실험에서 얻어진 자료는 ANOVA test의 분석방법을 이용하여 분석하였고 대조군과의 유의성은 95% 수준에서 실시하였다.
이론/모형
- 수집된 시료로부터 DNA와 RNA를 추출하여 항원검사와 유전자검사 통하여 감염된 바이러스와 세균을 동정하였다. 항원검사는 IHC (DiscoveryTM, Ventana Medical Systems, USA)를 이용하여 제조사가 제공한 manual에 따라 실시하였다.
성능/효과
- 4%로 가장 많은 것으로 나타났다. 113건의 단독감염인 대하여 원인체를 조사한 결과, PCV-2가 76건(67.3%)으로 가장 많이 나타났으며, 그 다음은 PRRSV로 21건(18.6%)였다. 세균 원인체는 H.
- 2005년부터 2006년까지 전국 16개 시·도에서 수집된 PRDC로 진단된 시료에 대해 발생상황을 조사한 결과, 총 461건 중 113건(24.6%)이 단독감염이었으며, 348건(75.5%)이 2종 이상의 원인체에 의한 혼합감염이었다(Table 1).
- 5%)을 대상으로 조사하였다. Cytokine의 발현을 분석한 결과 2종 및 3 종 혼합 감염군에서 IL-6를 제외한 조사한 모든 cytokine에서 동일한 양상을 보였다. 이러한 현상은 PRDC의 주 원인균으로 알려진 PRRSV 또는 PCV-2의 일차감염으로 대식구의 융해가 일어나며 [18, 24] 또한 PRDC에서 PCV2 감염에 의한 B 및 T 림프구의 현저한 감소와 상대적으로 단핵세포 및 과립구의 증가가 보고되어 있어[13], proinflammatory cytokine인 IL-6를 제외한 cytokine이 감소가 나타날 수 있다는 예상과 본 결과가 일치하였다.
- IL-6는 주로 IL-1과 TNF-α를 억제하고, IL-1 수용체 antagonist와 TNF-α 수용체의 작용을 억제하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다[4]. IL-6가 IL-1등이 발현한 뒤에 나타나는 2차 cytokine인 것임을 고려할 때 mRNA 발현이 IL-1과는 상반되게 나타나 본 연구의 실험결과와도 일치함이 확인되었다. 반면 PRDC와 유사한 형태의 혼합감염에 의해서 발병되는 PMWS의 경우 B 세포와 T 세포의 손실이 보고되어 있으며[2], 특히 기억 T 세포의 손실이 보고되었다[18].
- IL-6는 2종 및 3종 혼합감염 군에서 모두 증가하였고, 그 이외의 IL-1α, IL-2, IL-4, IL-10, IFN-α의 발현은 감소하였다.
- 5%)이 2종 이상의 원인체에 의한 혼합감염이었다(Table 1). PRDC 발생상황을 주령 별로 분석한 결과, 3주령에서 10주령 미만의 돼지에서 338건(73.4%)으로 가장 많이 나타났으며, 10주에서 20주 미만의 돼지에서 86건(18.7%)으로 나타나, 전체 3주령에서 20주령의 이유돈에서 높은 빈도로 나타났다. 혼합감염 유형은, 2종 혼합감염이 175건(38.
- 7%)였다. PRDC 혼합감염의 주요 원인체로 PRRSV/PCV-2의 2종 혼합감염의 예가 전체 혼합감염 중에서 22.4%로 가장 높은 빈도로 검출되었으며. PPRSV/PCV-2/H.
- PRDC의 확진을 위해서 사용하고 있는 조직항원염색방법(IHC)은 균들간의 항원교차반응에 의해 정확성이 떨어지는 경향이 있어 정확한 원인균의 검출을 위해서 PCR 방법을 이용하여 두 진단 방법간의 정확도를 비교하였다. PRRSV, PCV-2에 대한 면역조직화학염색과 PCR 방법과의 원인균의 검출율을 비교한 결과 PCR 방법이 IHC보다 원인균인 PRRSV, PCV-2의 검출에 효과적인 것으로 나타났다. 이러한 결과를 근거로 PRDC를 유발하는 원인체에 대해서는 항원검사의 결과에서 PCV-2의 감염이 많이 나타났으나 임상적으로는 PCV2는 감염되더라도 병리소견을 발현하지 않는 경우가 있어 임상증상을 나타내는 PRDC의 주요 원인체는 PRRSV로 판단된다.
- 6%), 3종 혼합감염에서는 PPRSV/PCV-2/H. parasuis (34.8%)의 혼합감염균에 대한 cytokine의 발현을 비교한 결과, 2종 및 3종 혼합 감염군에서 IL-6를 제외한 조사한 모든 cytokine에서 동일한 양상을 보였다(Fig. 1). cytokine 발현의 비교는 대조군을 기준으로 시험군에서의 발현의 비로 표시하였다.
- multocida/H. parasuis 혼합감염예가 3.7%로 확인되었으며, 5종 또는 6종 혼합감염도 나타나는 것으로 확인되었다. 국외에서도 PRRSV/PCV-2의 혼합감염이 가장 높게 나타나는 것으로 보고되었으며[22], 그 외 PRRSV/PCV2/P.
- PRRSV/H. parasuis 혼합감염일 경우 일치율이 60%로 나타났으며, PRRSV/PCV2로 진단된 경우 43.9%의 일치율을 보였다. 3종 복합감염된 예를 비교하여 보았을때, PRRSV/PCV2/H.
- PRDC의 발생 양상 중에서 가장 높은 빈도로 나타나는 2종과 3종의 감염원에 의해 혼합 감염된 시료를 대상으로 cytokine 유전자의 발현을 비교하였다. 각각의 실험결과는 no template control (NTC), RT- control을 사용하여 각각의 실험마다 사용하였고 PCR반응의 결과에서 NTC와 RT-control은 형광반응을 보이지 않았다. 2종 혼합 감염에 의한 시료 중에서 가장 높은 빈도로 나타난 PRRSV/PCV-2 (44.
- 이러한 결과는 PRDC와 유사한 증상을 보이는 PMWS와 같은 호흡기 질병과의 감별진단에 있어서 본 연구의(Table 3)에서 나타났듯이 진단의 방법에 따라 감염형태가 많은 차이가 나기 때문에 진단의 방법 및 정확도 등의 차이에 의한 결과일 것으로 추측된다. 국내에서 발생하는 PRDC는 단독감염보다 혼합감염이 높은 빈도로 발생하는 것이 확인되었으며, 단독감염을 포함하여 2종 혼합감염이 38.0%, 3종 혼합감염도 24.4%를 차지하고 있어 국내 PRDC는 2종 또는 3종의 혼합감염이 62.4%로 가장 많이 나타났다. 외국의 경우, 2종이상의 혼합감염만을 대상으로 실시한 조사에서 PRDC로 진단된 2,872건중 338건(88.
- 또한 2종 혼합 감염 군과 3종 혼합 감염 군에서 cytokine의 발현 비율을 비교하면, IL-1α가 2종 혼합 감염 군보다 3종 혼합 감염 군에서 발현이 가장 감소하였으며, IL-4의 변화가 가장 적게 나타났다.
- 2%)로 우리나라와 비슷한 양상을 보임을 확인하였다. 또한 PRDC의 원인균을 분석한 결과, 113건의 단독감염의 원인체는, PCV-2가 총 76건(67.3%)으로 나타났으며, 그 다음은 PRRSV로 21건(18.6%)으로 나타났다. 세균원인체중 가장 많이 확인된 것은 H.
- 바이러스 및 세균의 유전자 검사를 위하여 채취한 폐, 림프절은 실험에 사용할 때까지 -20℃의 냉동상태로 보관하였다. 시료로부터 DNA와 RNA는 각각 QIAmp DNA mini kit (Qiagen, USA)와 RNeasy mini kit (Qiagen, USA)를 이용하여 추출하였다.
- 이유돈(3주령~10주령)에서 질병은 특히 증체율이 낮아져 양돈농가의 수익성 감소를 초래한다. 본 연구의 결과, 국내에서 발생하고 있는 혼합감염에 의한 PRDC의 발생연령은 주로 3주령에서 10주령 사이에서 가장 많이 발생하는 것으로 나타났으며, 외국의 경우에서 8-12주령의 돼지에서 발생빈도가 높은 것으로 보고되어 국내의 PRDC 발생이 외국보다 더욱 빨리 나타나는 것으로 확인되었다[22]. 이러한 결과는 외국의 경우 양돈농가에서 동물복지의 기준에 맞춘 사육이 정착되어 질병과 관련된 환경 문제의 개선뿐만 아니라 질병감염의 주요 원인인 밀식사육 등으로 인한 사육 스트레스가 감소된 반면[26], 국내에서는 밀식사육이 가장 널리 사용되는 사육방법이며, 특히 밀식사육의 경우에 사육돈의 스트레스가 증가하고, 환기시설의 규모가 소형일수록 호흡기 질병의 발생에 차이가 나타나는 점[15]을 고려하면 면역력이 낮은 어린 자돈일수록 높은 빈도로 발생할 수 있다.
- 6%)였다. 세균 원인체는 H. parasuis가 11건(9.7%)으로 가장 많이 나타났다(Table 2). 혼합감염의 주요 원인체로는 PRRSV/PCV-2의 2종 혼합 감염이 44.
- 6%)으로 나타났다. 세균원인체중 가장 많이 확인된 것은 H. parasuis로 11건(9.7%)였다. PRDC 혼합감염의 주요 원인체로 PRRSV/PCV-2의 2종 혼합감염의 예가 전체 혼합감염 중에서 22.
- 항원 검사에서 PCV-2로 진단된 경우 PCR 방법과의 일치율이 72.7%로 나타났으며, PRRSV의 경우 일치율이 50%로 나타났다. 기타 PCV2/H.
- 7%)으로 나타나, 전체 3주령에서 20주령의 이유돈에서 높은 빈도로 나타났다. 혼합감염 유형은, 2종 혼합감염이 175건(38.0%), 3종 혼합감염이 112건(24.4%)을 차지하고 있어, 국내에서 발생하는 PRDC는 2종 또는 3종의 혼합감염이 62.4%로 가장 많은 것으로 나타났다. 113건의 단독감염인 대하여 원인체를 조사한 결과, PCV-2가 76건(67.
- 7%)으로 가장 많이 나타났다(Table 2). 혼합감염의 주요 원인체로는 PRRSV/PCV-2의 2종 혼합 감염이 44.6%로 가장 높은 빈도로 나타났다. 3종 혼합감염 예에서는 PPRSV/PCV-2/H.
후속연구
- 반면 PRDC와 유사한 형태의 혼합감염에 의해서 발병되는 PMWS의 경우 B 세포와 T 세포의 손실이 보고되어 있으며[2], 특히 기억 T 세포의 손실이 보고되었다[18]. 또한 PMWS에 감염된 cytokine을 분석해보면, 흉선에서 T 세포 면역 억압의 지표로 생각되는 IL-10 mRNA 발현이 증가됨이 확인되었으나[10], 자연감염에 의한 PMWS에 감염된 돼지에서의 본 연구에서 조사한 그 외의 cytokine의 변화는 mRNA와 단백질 수준에서 모두 유의성 있는 변화를 보이지 않는[19] 것에 의해 판단하면 PRDC나 PMWS가 감염형태나 원인균 등에서 유사성을 보이고 있으나 감염후의 발병기전은 다를 것으로 추측되어 앞으로 PRDC와 PMWS에 대한 면역학적 연구는 두 질병에 대한 예방 및 감별진단과 치료에 공헌을 할 수 있을 것으로 기대된다.
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