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문제 정의
- 본 연구에서는 구척의 품질을 객관적이고 과학적으로 평가할수 있도록 활성분획의 항산화 화합물3종의 지표성분을 제시하였으며, 이를 통해 골 관련 질환을 비롯한 천연물 신약, 기능성 화장품 등의 원료로써 구척을 사용할 경우 구척에 대한 품질관리를 위한 자료가 될 것으로 사료된다.
제안 방법
- 14개의 구척 추출물의 UPLC 크로마토그램을 바탕으로 함량 분석을 실시하였다(Fig. 2). 3가지 주요 페놀성분에 대하여 onitin4-O-β-D-glucopyranoside은 2~125 μg/ml, irisdichototins E & F mixture는 12.
- 9) 이러한 점에 착안하여 본 연구에서는 항산화에 대한 activity-guided fractionation 을 통하여 구척의 활성성분이며 주성분인 성분을 분리, 구조 동정하였으며 유통되는 구척을 산지별로 수집하여 UPLC를 이용하여 성분패턴 및 함량분석을 실시하였다.
- 그 후 상온에서 2분 간 방치하여 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. Xanthine oxidase 억제제로 알려진 allopurinol을 양성 대조 약물로 하여 효소반응 여부를 확인하였고, superoxide 소거능은 IC50로 나타내었다.
- 각각의 standard stock solution은 모두 에탄올로 희석하여 onitin-4-O-β-D-glucopyranoside는 125, 62.5, 12.5, 2 μg/ml, irisdichototins E & F는 500, 250, 125, 62.5, 12.5 μg/ml, protocatechuic acid는 125, 62.5, 12.5, 6.25 μg/ml의 농도가 되도록 조제하였다.
- 검액 및 표준액 조제 − 산지별로 수집한 총 14개 구척 시료를 분쇄기를 이용하여 세절한 후 50호(300 μm)체로 균질화하고, 이를 2g씩 정밀하게 취한 후 메탄올 50 ml를 가하였다(Table I).
- 용리 조건은 이동상 조성을 시간에 따라 변화시켜가는 기울기 용리를 사용하였다(Table II). 검출파장은 260 nm을 구척 추출물 및 표준품을 분석하기 위한 분석 파장으로 선택하여 각 시료의 패턴 및 함량 분석을 실시하였다.
- 구척의 주성분이며 항산화 활성 성분의 구조를 밝히기 위하여 methanol로 추출하고 chloroform 분획과 water 분획으로 각각 나누어 chloroform 분획층을 얻었고, water 분획을 diaion HP-20을 이용하여 water, 30% methanol, 60% methanol, 100% methanol로 각각 분획하였다. 분획물의 항산화 효능을 스크리닝하여 높은 활성을 나타낸 30% methanol과 60% methanol 분획 층을 대상으로 Sephadex LH-20와 ODS-B gel column chromatography를 통하여 3종의 페놀성 화합물을 분리하였다.
- 그 중 60% methanol층을 silica gel(이동상 chloroform : methanol : water=90 : 20 : 2), sephadex LH-20(이동상 40% methanol), MCI(50% methanol)를 이용해 onitin-4- O-β-D-glucopyranoside(17.7 mg)을 분리하였다.
- 또한 구척의 합리적인 유통체계와 품질관리를 위하여 UPLCUV system을 이용해 15분 내에 구척의 성분패턴 분석이 가능한 분석법을 개발하였으며 그 결과 함량 및 구척의 대표적인 fingerprint를 제시하였다. 대체로 베트남산 구척에 3종의 주성분이 많이 함유된 것을 확인하였지만 베트남산과 중국산 구척 유통품의 차이점을 구분하기에는 어려웠다.
- 또한, 30% methanol층에 대해서는 sephadex LH-20(이동상 30% methanol), ODS(이동상 30% methanol), MCI(이동상 10% methanol)를 이용하여 irisdichototins E & F(34.4 mg)와 protocatechuic acid (17 mg)를 분리하였다.
- 베트남산 금모구척 뿌리 3 kg를 분쇄기를 이용하여 세절한 후 시료에 methanol 10 l를 넣고 3일 동안 추출 후 여과하였으며 이 과정을 3회 반복 후 감압 농축하여 추출물 452 g을 증류수 2 l에 현탁한 후 분액 깔때기에서 chloroform을 가하여 진탕 반복추출하고 수층을 분취하여 chloroform 분획과 water 분획으로 각각 나누어 chloroform 분획 55 g을 얻었으며 water 분획을 diaion HP-20을 이용하여 water, 30% methanol, 60% methanol, 100% methanol로 각각 용출시켜 각각 water 분획 159 g, 30% methanol 분획 27 g, 60% methanol 분획 45 g, 100% methanol 분획 15 g을 얻었다. 그 중 60% methanol층을 silica gel(이동상 chloroform : methanol : water=90 : 20 : 2), sephadex LH-20(이동상 40% methanol), MCI(50% methanol)를 이용해 onitin-4- O-β-D-glucopyranoside(17.
- 본 연구에서는 국내에 가장 많이 유통되는 베트남산 금모구척을 대상으로 활성분획에 대한 성분분리를 실시하여 3종의 화합물을 분리하였으며 각종구조분석을 통하여 onitin-4-O-β-Dglucopyranoside (1), irisdichototins E & F mixture (2), protocatechuic acid (3)으로 동정하였다.
- 구척의 주성분이며 항산화 활성 성분의 구조를 밝히기 위하여 methanol로 추출하고 chloroform 분획과 water 분획으로 각각 나누어 chloroform 분획층을 얻었고, water 분획을 diaion HP-20을 이용하여 water, 30% methanol, 60% methanol, 100% methanol로 각각 분획하였다. 분획물의 항산화 효능을 스크리닝하여 높은 활성을 나타낸 30% methanol과 60% methanol 분획 층을 대상으로 Sephadex LH-20와 ODS-B gel column chromatography를 통하여 3종의 페놀성 화합물을 분리하였다. 이화학적 성상 및 1H, 13C-NMR, MS spectrum data를 기존 문헌과 비교하여 구조를 규명하였다.
- 시료를 각 농도별로 조제한 용액 100 μl(control: 99.5% ethanol)에 0.1 mM DPPH 용액(99.5% ethanol) 1.9 ml을 가하였고, 각 시료는 5가지 농도로 조제하였다.
- + 양이온 radical solution 950 μl을 혼합하여 실온(24℃)에서 5분 차광 방치 한 후, 최종적으로 UV/Vis spectrophotometer를 이용하여 732 nm에서 시료의 흡광도를 측정하였다. 양성 대조 약물로는 trolox를 이용하였고, 5가지 농도로 조제하여 측정하였다. 각 시료의 항산화작용은 IC50로 나타내었다.
- 이후 spectrophotometer를 이용하여 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조약물로는 L-ascorbic acid를 5가지 농도로 조제하여 측정하였으며, 각 시료의 항산화능은 IC50로 나타내었다.
- 2 μm membrane filter로 여과한 후 UPLC 분석에 사용하였다. 이를 이용하여 검량선을 작성하였으며, 검량선의 직선성은 상관계수(R2)를 구하여 확인하였다.
- 분획물의 항산화 효능을 스크리닝하여 높은 활성을 나타낸 30% methanol과 60% methanol 분획 층을 대상으로 Sephadex LH-20와 ODS-B gel column chromatography를 통하여 3종의 페놀성 화합물을 분리하였다. 이화학적 성상 및 1H, 13C-NMR, MS spectrum data를 기존 문헌과 비교하여 구조를 규명하였다. 분리된 성분은 onitin-4-O-βD-glucopyranoside, irisdichototins E & F와 protocatechuic acid로 최종 구조 동정하였다(Fig.
- 특히 irisdichototins E & F는 구척에서는 처음으로 분리보고된 물질이며 여러 기기분석을 통하여 전형적인 phenolic 성분으로 2가지 형태(α, β form)의 당이 결합된 화합물로 α-glucose가 결합되었을 때와 β-glucose가 결합되었을 때 성분의 구조적 차이가 미세하여 본 연구에서는 두 물질이 완전히 분리가 되지 않은 혼재된 형태로 함량 분석을 실시하였다.
- 3). 획득한 크로마토그램들로부터 각 성분들의 피크 면적을 구하고, 이를 미리 작성한 검량선에 대입하여 각 성분의 함량을 구하였다(Table IX). 산지에 따라 주요 페놀성분의 함량이 조금씩 다르게 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 대체로 베트남산 구척에서 주요 페놀성분 함량이 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다.
대상 데이터
- UPLC 분석에 사용한 기기로는 Acquity UPLC BEH C18 column(2.1×50 mm, 1.7 μm), quaternary solvent manager(pump), sample manager(auto sampler), photodiode array(PDA) detector, Waters Acquity UPLC system(Milford, MA, USA), Empower 2 software(Waters, Milford, MA, U.S.A.)를 사용하였고 항산화활성 측정용 시약인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), L-ascorbic acid, Xanthine oxidase Grade IV : From milk, Hypoxanthine, Ethylenediaminetetra acetic acid2Na(EDTA), ABTS(2, 2'-Azinobis-3-ethylbenzothizoline-6-sulfate acid ammonium salt), Potassuim persulfate, Trolox(6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid, 97%), Allopurinol는 Sigma Aldrich(Milw., WI, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- UPLC 분석조건 − 고정상은 Acquity UPLC BEH C18(2.1×50 mm, 1.7 μm) 칼럼을 사용하였으며, 이동상은 Acetonitrile과 0.1% formic acid를 사용하였다.
- 본 연구의 실험에 사용한 금모구척 시료는 2013년 2월 경동시장에서 구입하여 중앙대학교 약품자원식물학실에서 기원 및 형태학적 감정을 거친 후 연구의 재료로 사용하였다. 또한 패턴 및 함량 분석을 실시하기 위해 시중에 유통되는 베트남, 중국산 금모구척을 중국 약재시장 및 국내 약재시장, 온라인 한약재 시장 등에서 구입하여 감정을 거친 후 분석에 사용하였다.
- 본 연구의 실험에 사용한 금모구척 시료는 2013년 2월 경동시장에서 구입하여 중앙대학교 약품자원식물학실에서 기원 및 형태학적 감정을 거친 후 연구의 재료로 사용하였다. 또한 패턴 및 함량 분석을 실시하기 위해 시중에 유통되는 베트남, 중국산 금모구척을 중국 약재시장 및 국내 약재시장, 온라인 한약재 시장 등에서 구입하여 감정을 거친 후 분석에 사용하였다.
- 본 연구의 실험에 사용한 기기로는 UV/VIS spectrophotometer(Human TU-1800PC, Korea, Optizen 2120 UV, Korea), FABMS spectrometer(JMS-600W/JMS-700, JEOL, Tokyo, Japan), 1H-NMR spectrometer(Varian Gemini 2000, 600 MHz, Varian, Palo Alto, U.S.A.), 13C-NMR spectrometer(Varian Gemini 2000, 125 MHz, Varian, Palo Alto, U.S.A.) 등이 있으며, Column chromatography 충진제로는 Diaion HP-20(Nippon Rensui Co., Japan), Sephadex LH-20(25~100 μm, Pharmacia, Sweden), ODS gel(400~500 mesh, Waters, U.S.A.), Silica gel(70~230 mesh, Merck, Germany), MCI gel CHP20P(75~150 μm, Mitsubishi, Japan)를 사용하였다.
- ), Silica gel(70~230 mesh, Merck, Germany), MCI gel CHP20P(75~150 μm, Mitsubishi, Japan)를 사용하였다. 추출 및 분획과정에서는 Methanol, Ethanol, Acetonitrile, Chloroform, Water, Formic acid, Acetic acid(J.T. Baker, HPLC grade, U.S.A.) 등을 사용하였다. UPLC 분석에 사용한 기기로는 Acquity UPLC BEH C18 column(2.
이론/모형
- ABTS assay는 Arnao MB의 방법(Arnao et al., 2001)11)을 참고하여 실시하였다. 4 mM ABTS와 2.
- DPPH assay는 Hatano의 방법(Hatano et al., 1989)10)을 참고 하여 실시하였다. 시료를 각 농도별로 조제한 용액 100 μl(control: 99.
- Hypoxanthine/xanthine oxidase system은 (McCune et al., 2002)12)의 방법에 따라 xanthine oxidase 활성을 측정하였다. 먼저 50 mM potassium phosphate buffer(pH 7.
- 각 표준물질 혼합용액은 연속희석법을 이용하여 희석하였으며, 준비된 각 표준액을 0.2 μm membrane filter로 여과한 후 UPLC 분석에 사용하였다.
성능/효과
- 3가지 주요 페놀성분에 대하여 onitin4-O-β-D-glucopyranoside은 2~125 μg/ml, irisdichototins E & F mixture는 12.5~500 μg/ml, protocatechuic acid는 6.25~125 μg/ml의 농도 범위에서 검량선을 작성한 결과, 모든 성분에 대하여 검량선의 상관계수(R2)가 0.999 이상의 양호한 직선성을 나타내었다(Fig. 3).
- 각 화합물의 효능은 Irisdichototins E & F>protocatechuic acid>onitin-4-O-β-Dglucopyranoside 순으로 확인하였고 특히 Irisdichototins E & F와 protocatechuic acid 의 경우 양성 대조군인 ascorbic acid, trolox와 비슷하거나 더 우수한 경향을 보여 강력한 radical scavenging activity을 확인할 수 있었다(Table IV).
- 각 화합물의 효능은 Irisdichototins E & F>protocatechuic acid>onitin-4-O-β-Dglucopyranoside 순으로 확인하였고 특히 Irisdichototins E & F와 protocatechuic acid의 경우 양성 대조군인 trolox와 비슷하거나 더 우수한 경향을 보여 강력한 radical scavenging activity를 갖고 있음을 알 수 있었다(Table VI).
- 각 화합물의 효능은 Irisdichototins E & F≒Protocatechuic acid>Onitin-4-O-β-Dglucopyranoside 순으로 확인하였고 특히 Irisdichototins E & F와 Protocatechuic acid의 경우 각각 IC50=29.7±3.1과 34.6±1.8 μM로 양성 대조군인 allopurinol(IC50=0.52±0.02 μM)과 비교적 비슷한 superoxide 소거능을 보여 우수한 항산화능을 갖고 있음을 재확인 할 수 있었다(Table VIII).
- 구척의 methanol 추출물을 chloroform으로 탈지한 뒤 diaion HP-20을 이용하여 water, 30% methanol, 60% methanol, 100% methanol로 각각 용출시켜 얻은 water, 30% methanol, 60% methanol, 100% methanol 분획 별로 5가지의 농도(6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/ml)로 조제하여 실험한 결과 60% methanol 분획층의 radical scavenging activity가 가장 우수하였으며, 60% methanol>30% methanol>100% methanol>CHCl3>water 분획 순으로 효능을 확인하였다.
- 구척의 methanol 추출물을 chloroform으로 탈지한 뒤 diaion HP-20을 이용하여 water, 30% methanol, 60% methanol, 100% methanol로 각각 용출시켜 얻은 water, 30% methanol, 60% methanol, 100% methanol 분획을 농도 별(6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/ml)로 조제하여 실험한 결과 60% methanol 분획 층의 radical scavenging activity가 가장 우수하였으며, 60% methanol>100% methanol≒30% methanol>CHCl3>water 분획 순으로 효능을 확인하였다.
- 구척의 methanol 추출물을 chloroform으로 탈지한 뒤 diaion HP-20을 이용하여 water, 30% methanol, 60% methanol, 100% methanol로 각각 용출시켜 얻은 water, 30% methanol, 60% methanol, 100% methanol 분획을 농도 별(6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/ml)로 조제하여 실험한 결과 60% methanol 분획의 radical scavenging activity가 우수하였으며, 60% methanol ≒30% methanol>100% methanol>CHCl3>water 분획순으로 항산화 효능을 확인하였다.
- 구척의 활성 분획인 60% methanol, 30% methanol층으로부터 분리된 성분 3종을 대상으로 농도 별(6.25, 12.5, 25, 50, 100μM)로 조제하여 실험한 결과 3종의 모든 화합물에서 superoxide scavenging activity을 확인하였다.
- 구척의 활성 분획인 60% methanol, 30% methanol층으로부터 분리된 성분 3종을 대상으로 농도 별로(6.25, 12.5, 25, 50, 100 μM) 조제하여 실험한 결과 3종의 모든 화합물에서 radical scavenging activity을 확인하였다.
- 구척의 활성 분획인 60% methanol, 30% methanol층으로부터 분리된 성분 3종을 대상으로 농도 별로(6.25, 12.5, 25, 50, 100 μM) 조제하여 실험한 결과 모든 3종의 화합물에서 radical scavenging activity을 확인하였다.
- 그 중에서 60%, 30% methanol 분획은 각각 IC50=0.7±0.3와 3.7±0.4 μg/ml로서 양성 대조군인 allopurinol(IC50=13.3±0.0 μg/ml)보다 우수한 항산화 활성을 보였다(Table VII).
- 그 중에서도 60% methanol 분획은 IC50 23.3 μg/ml로 구척의 분획층 중 가장 우수한 항산화 활성을 나타내었으며 양성 대조 약물인 ascorbic acid의 IC50 6.2 μg/ml와 비교하였을 때 우수한 항산화능을 가진 것으로 나타났다(Table III).
- 그 중에서도 60% methanol 분획은 IC5020.0 μg/ml로 구척의 분획층 중 가장 우수한 항산화 활성을 나타내었으며 양성 대조 약물인 trolox 의 IC50 값 14.1 μg/ml와 비교하였을 때 비교적 우수한 항산화능을 가진 것으로 나타났다(Table V).
- 분리된 3종의 성분을 대상으로 DPPH, ABTS, Hypoxanthine/xanthine oxidase system의 세 가지 antioxidant assay를 실시한 결과, irisdichototins E & F와 protocatechuic acid는 양성 대조약물과 비교하였을 때 세 가지 기전의 antioxidant assay 모두에서 우수한 항산화능을 보였다.
- 획득한 크로마토그램들로부터 각 성분들의 피크 면적을 구하고, 이를 미리 작성한 검량선에 대입하여 각 성분의 함량을 구하였다(Table IX). 산지에 따라 주요 페놀성분의 함량이 조금씩 다르게 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 대체로 베트남산 구척에서 주요 페놀성분 함량이 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 전체적인 성분 패턴은 대체로 유사하게 나타났으나 몇 가지 피크의 함량차이가 나타났다.
- 특히 구척에서 분리된 3가지 성분 irisdichototins E & F mixture, protocatechuic acid, onitin-4-O-β-D-glucopyranoside의 피크 면적 및 함량이 산지별로 큰 차이로 확인되었다.
후속연구
- 이는 주로 야생에서 자라는 금모구척은 일정한 온도, 습도 등의 환경조절이 어렵다는 사실을 고려하였을 때, 이러한 일정하지 않은 재배 환경 등이 다양한 성분 패턴과 함량결과에 반영된 것으로 사료된다. 따라서 추후 연구에서는 더욱 다양한 산지와 많은 시료를 수집하여 추가적인 함량 및 패턴분석이 필요한 것으로 사료된다.
- 이는 국내에 수입되어 유통되는 구척의 산지별 유통경로를 이화학적으로 구분할 수 있는 기준점이 될 수 있을 것으로 생각되지만 (b) irisdichototins E와 F의 mixture 피크는 glucose α form과 β form이 함께 검출이 되어 두 개의 피크로서 검출되었으며, 두 성분의 함량 차이가 있는 것으로 관찰되었으므로 epimeric 구조에 대한 정확한 규명과 함량 검토가 필요한 것으로 사료된다.
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