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문제 정의
- 그런데 동결 보존된 배아의 생존율과 발달율에 영향을 미치는 이들 요인들의 상관관계에 대한 연구는 아직 미약한 실정이며, 또한 동결 보존법에 대한 견해도 실험실마다 달라, 이에 대한 체계적 연구가 필요하다. 따라서 본 연구는 생쥐 초기 배아를 이용하여 동결 보존된 배아의 생존율과 발달율에 영향을 미치는 요인들의 상관관계를 알아보고, 동결 보존법을 체계화 하고자 배아의 발달단계, 동결 및 해빙 속도, 동결 보호제의 종류에 따라 동결 보존한 후 해동하고, 초기 배아의 생존율 및 발달율을 조사하여 동결 보존법에 대한 최적 조건들을 살펴봄으로써 임상적 적용에 대한 유용성을 검토하고자 시도하였다.
제안 방법
- 1 M sucrose가 첨가된 용액에서 각각 15분 간 노출시켜 탈수를 유도하였다. 1.5 M EG에 0.1 M sucrose가 첨가된 용액 또는 1.5 M DMSO에 0.1 M sucrose가 첨가된 용액에서 15분 간 탈수가 진행되는 동안 0.25 ml 플라스틱 스트로우(IMV, France)에 mouth piece를 이용하여 장전하였다.
- 과배란 유도를 위하여 5 IU의 pregnant mare’s serum gonadotropin(PMSG, Sigma)을 생쥐 암컷에 복강 주사하고, 48시간후 5 IU의 human chorionic gonadotropin(hCG, Sigma)을 복강주사하였다. hCG 주사 후 즉시 암컷과 수컷을 1:1로 합사하여 교배를 유도하였다. 2세포기 배아는 hCG 주사 48시간 후에, 4∼8세포기 배아는 hCG 주사 60∼62시간 후에 암컷의 수란관에서 회수하였다.
- 과배란 유도를 위하여 5 IU의 pregnant mare’s serum gonadotropin(PMSG, Sigma)을 생쥐 암컷에 복강 주사하고, 48시간후 5 IU의 human chorionic gonadotropin(hCG, Sigma)을 복강주사하였다.
- 그러나 상실배 또는 배포기의 동결 보존은 먼저 수정된 배아를 상실배 이상까지 배양해야 하는 배양 조건과 기술의 향상이 선행되어야 하는 문제점과 PROH과 glycerol이 다른 동결 보호제보다 독성이 심한 걸로 알려져 있어(Lassalle et al., 1985; Trounson et al., 1983), 본 연구에서는 배아의 초기 배 발달 단계인 2, 4∼8세포기 배아를 EG, DMSO를 사용하여 동결 - 해동하고, 생존율과 배아 발달율을 비교 조사해 보았다.
- 동결 보호제와 해동액을 제조하기 위한 기본 용액은 인산완충액에 20% 소태아 혈청(fetal bovine serum, Gibco)을 첨가하여 사용하였다. 동결 보호제는 기본 용액에 ethylene glycol(EG, Sigma) 첨가한 1.
- 배아를 동결하지 않으며, 배양한 군을 대조군으로 하고, 배아의 동결 후 생존율 및 초기 배아 발달율을 조사한 군을 실험군으로 디자인하였다. 실험군은 초기 배아의 발달 단계, 동결 보호제, 초기 배아의 동결 속도에 따라 각각 2세포와 4~8세포 배아, EG과 DMSO, 그리고 완만 동결 - 급속 해동과 급속 동결 - 급속 해동군으로 분류하였다.
- 배아의 세포질 내에 존재하는 물을 제거하고, 제거된 양만큼 동결 보호제를 세포질 내로 유입시키는 탈수 과정은 2단계 방법을 사용하였다. 정상적으로 발달한 초기 배아를 1단계 1.
- 배아를 동결하지 않으며, 배양한 군을 대조군으로 하고, 배아의 동결 후 생존율 및 초기 배아 발달율을 조사한 군을 실험군으로 디자인하였다. 실험군은 초기 배아의 발달 단계, 동결 보호제, 초기 배아의 동결 속도에 따라 각각 2세포와 4~8세포 배아, EG과 DMSO, 그리고 완만 동결 - 급속 해동과 급속 동결 - 급속 해동군으로 분류하였다.
- 배아의 세포질 내에 존재하는 물을 제거하고, 제거된 양만큼 동결 보호제를 세포질 내로 유입시키는 탈수 과정은 2단계 방법을 사용하였다. 정상적으로 발달한 초기 배아를 1단계 1.5 M EG 또는 1.5 M DMSO, 2단계 1.5 M EG에 0.1 M sucrose 가 첨가된 용액 또는 1.5 M DMSO에 0.1 M sucrose가 첨가된 용액에서 각각 15분 간 노출시켜 탈수를 유도하였다. 1.
- 제조한 동결 보호제와 해동액은 각각 0.22 μ millipore filter(Acrodisc, German)로 여과하여 멸균을 실시하였고, 동결 보호제와 해동액은 동결 또는 해동 1∼2시간 전에 제조하여 사용하였다.
- 제조한 동결 보호제와 해동액은 각각 0.22μ millipore filter(Acrodisc, German)로 여과하여 멸균을 실시하였다.
- 2 M sucrose 만 포함된 해빙액에서 다시 5분간 처리하고, 마지막으로 20%소태아 혈청이 포함된 인산 완충액에서 5분간 처리하여 재수화 과정을 마쳤다. 초기 배아의 생존성 판정은 재수화 과정이 완료된 초기 배아를 기본 용액에서 3회 세척한 후, 상온에서 5분이 경과했을 때 형태적인 양상으로 확인하였다.
- model 3037)에서 배양하였다. 한편, 해동된 배아는 1.0 M DMSO에 0.2 M sucrose 가 첨가된 용액과 0.5 M DMSO에 0.2 M sucrose가 포함된 기본 용액에서 각각 5분씩 처리한 후, 기본 용액에 0.2 M sucrose 만 포함된 해빙액에서 다시 5분간 처리하고, 마지막으로 20%소태아 혈청이 포함된 인산 완충액에서 5분간 처리하여 재수화 과정을 마쳤다. 초기 배아의 생존성 판정은 재수화 과정이 완료된 초기 배아를 기본 용액에서 3회 세척한 후, 상온에서 5분이 경과했을 때 형태적인 양상으로 확인하였다.
- 회수한 초기 배아는 재수화 용액에서 3단계로 옮겨가면서 탈수의 역과정을 수행하였다. 해동 회수된 초기 배아는 1.0 M EG에 0.2 M sucrose가 첨가된 용액과 0.5 M EG에 0.2 M sucrose가 첨가된 용액를 포함한 기본 용액에서 각각 5분간 처리한 후, 0.2 M sucrose만 포함된 해동액에서 5분간 처리하였다. 마지막으로 배아는 20% 소태아 혈청이 포함된 인산 완충 액에서 5분간 처리하고, 배양액에 옮겨 5% CO2, 100% 습도를 유지하는 배양기(F orma Scientific Co.
- 해동된 초기 배아를 상온에서 기본 배양액에 20분간 노출시킨 후, 배양액으로 옮겨 세포 발달 단계에 따라 이산화탄소 배양기에서 2세포기는 96시간, 4∼8세포기는 72시간 배양 후, hatching까지 진행된 비율을 구하였다.
- 1 M sucrose를 첨가한 용액을 사용하였다. 해동액은 기본 용액에 DMSO를 첨가하여 각각 0.5 M, 1.0 M의 용액에 0.1 M sucrose를 혼합하여 제조하였다. 제조한 동결 보호제와 해동액은 각각 0.
- 1 M sucrose를 첨가한 용액을 사용하였다. 해동액은 기본 용액에 EG를 첨가하여 각각 0.5 M, 1.0 M 용액을 만든 후 0.1 M sucrose를 혼합하여 제조하였다. 제조한 동결 보호제와 해동액은 각각 0.
- 해부현미경을 이용해 회수 용기는 1회용 배양 접시(35 × 10 mm, Falcon)을 이용해, 30G 주사침이 부착된 1회용 투버클린 주사기로 난관을 관류하여 회수하였다.
대상 데이터
- 동결 보호제는 기본 용액에 dimethyl sulfoxide(DMSO, Merk)를 첨가한 1.5 M DMSO와 1.5 M DMSO에 0.1 M sucrose를 첨가한 용액을 사용하였다. 해동액은 기본 용액에 DMSO를 첨가하여 각각 0.
- 본 연구에 사용된 실험 동물은 일본 도쿄대학교 수의과학 대학 동물실험 윤리위원회A-10-1211의 승인 하에 진행하였으며, 항온 및 항습이 유지되면서 낮 12시간, 밤 12시간이 조절되는 실험 동물 사육실에서 생쥐 제 1 세대 잡종(C57BL ♀× CBA ♂)으로 생후 4∼5주된 암컷과 6∼8주된 생식력이 확인된 수컷에게 충분한 사료와 물, 공간을 제공하면서 사육하였다.
- 지금까지 세포 및 초기 배아의 동결 보존에 주로 사용되어 온 동결 보호제로는 독성이 강하고, 점성이 높은 침투성의 동해 방지제인 DMSO, propandiol(1.2-PROH), glycerol을 사용하였다. 그러나 최근에는 Martino 등(1996)은 소 성숙난자를 ethylene glycol(이하: EG)을 사용하여 높은 배반포율을 보고한 것과 같이 EG을 사용하는 빈도가 점차 높아지고 있으며, 비침투성 동해 방지제로는 dextran, raffinose, 난황, 혈청 그리고 알부민이 있으나, glucose와 sucrose를 가장 많이 사용하고 있다(Kasai et al.
데이터처리
- 실험을 통하여 얻은 모든 결과들은 χ2-test와 Student t-test 를 시행하여 통계적 유의성을 조사하였고, p값이 0.05 미만일 때를 유의하다고 판정하였다.
성능/효과
- 2세포기 배아를 EG과 DMSO를 사용하여 동결 후 해동해 본 결과, 생존율에 있어서는 EG에서 64.4%, DMSO에서 77.0%로 DMSO에서 유의하게 높았으며(p<0.01), 해동 후 24, 48, 72, 96시간 배양에 따른 초기 배아 발달률에 있어서는 EG에서 83.3%, 58.7%, 58.3%, 52.0%이었고, DMSO에서는 79.0%, 34.4%, 33.8%, 29.2%로 EG에서의 초기 배아 발달율이 48시간 이후부터 유의하게 높았다(Table 3)(p<0.01).
- 2세포기에서는 EG 사용 시 해빙 후 배양 48시간째 배 발달율이 유의하게 감소하여(p<0.01) 동해로의 배 발달율 감소를 나타냈으나, 그 이후 배양 기간 동안에는 유사한 배 발달율을 나타내어 동결 보호제의 독성에서 벗어나 동해에 대한 영향을 받지 않음을 알 수 있었다.
- 4∼8세포기 배아를 EG와 DMSO를 사용하여 동결 후 해동해 본 결과, 생존율에 있어서는 EG에서 62.5%, DMSO에서 73.3%로 DMSO에서 유의하게 높았으며(p<0.01), 해동 후 24, 48, 72시간 배양에 따른 배아 발달율에 있어서는 EG에서 84.2%, 87.9%, 75.8%이었고, DMSO에서는 66.4%, 47.3%, 31.9%로 EG에서의 배아 발달율이 지속적으로 유의하게 높았다(Table 4)(p<0.01, p<0.05).
- 4∼8세포기 배아에서는 동결 보호제로 EG 사용 시 해동 후 배 발달율에는 변화가 없어서 동해로 인한 상해를 입지 않음을 알 수 있었으나, DMSO에서는 배양 48시간째 배 발달이 유의하게 감소하여 동해에 대한 상해를 입음을 알 수 있었다.
- 그렇지만 본 실험에 사용한 EG는 2, 4∼8세포기 배아의 동결 후 DMSO 사용 시보다 배 발달율에 있어서 더 유의하게 증가된 성적을 나타내어 생쥐 2세포를 이용하여 DMSO에서 보다 PROH 사용 시 배포까지의 발달에 좋은 성적을 얻었던 Macas 등(Macas et al., 1991)과 생쥐 전핵 배아를 이용하여 EG에서 더 효율적인 결과를 얻었던 Van-den-Abbeel 등(Vanden-Abbeel et al., 1994)의 보고와 거의 유사한 결과를 확인할 수가 있었다.
- 또한, 동결 보호제에 따른 배아의 생존율에 있어서는 2, 4∼8세포기 배아 모두 DMSO에서 유의하게 높았으나(p<0.01), 배 발달율에 있어서는 EG가 DMSO에 비해 더 유의하게 높은 성적을 나타내어(p<0.01, p<0.05) 동해로 인한 상해가 적은 것으로 생각되어 2, 4∼8세포기 배아에서 EG 가 더 효과적인 동결 보호제로 사료되며, 동결 프로그램으로는 완만 동결 - 급속 해동법이 더 우수한 프로그램으로 보인다.
- 동결 보존의 기본 원리는 세포의 고유한 형태를 유지하면서 내부의 수분을 고농도의 동결 보호제(cryoprotectant)의 삼투압 원리를 이용하여 점진적으로 제거하고, 이로 인해 얼음 결정을 최소화하여 세포를 보호하는 것이다. 또한, 동결을 통해 세포 내 모든 생리 및 생화학적 반응의 속도를 느리게 하거나 차단함으로써 장기간의 보존이 가능하다. 이를 위해서는 세포 내 결빙 형성(ice crystal)의 최소화라는 가장 단순하면서도 중요한 원칙이 지켜져야 한다.
- 본 연구에서 생쥐 초기 배아를 이용하여 동결 보존된 배아의 생존율 또는 발달율에 영향을 미치는 요인들의 상관관계를 알아본 결과, 배아의 발달 단계에 따른 동결 - 해동 후 생존율에 있어서는 2세포기 배아가 4∼8세포기 배아보다 유의하게 높았으나(p<0.01), 배 발달율에 있어서는 4∼8세포기 배아가 유의하게(p<0.01), 높아 생존율과 배 발달율과는 상관관계가 없는 것으로 사료된다.
- 생쥐 2세포기와 4∼8세포기 초기 배아를 EG와 DMSO 동결 보호제를 사용하여 동결 보존 후 세포 생존율을 조사해 본 결과, 2세포기 배아의 생존율이 EG에서 65.4% DMSO에서 81.1%, 4∼8세포 배아의 생존율이 각각 61.2%, 72.5%로 EG와 DMSO 두 동결 보호제에서 모두 2세포기 배아의 생존율이 유의하게 높았으며(p<0.01), 해빙 후 2세포기와 4∼8세포기를 24, 48, 72, 96시간 배양해 본 결과, 배 발달율에 있어서는 EG를 사용한 2세포기 배아에서 82.6%, 56.1%, 32.3%, 28.4%, 4∼8세포기에서는 87.6%, 87.5%, 77.6%이었고, DMSO를 사용한 2세포기 배아에서는 79.3%, 31.0%, 27.6%, 19.0%, 4∼8세포기에서는 63.9%, 50.0%, 35.2%로 해빙 후, 초기 배아 발달율에 있어서는 EG와 DMSO에서 모두 4∼8세포기 배아가 2세포기 배아보다 유의하게 높은 배아 발달율을 나타내었다 (Table 1, 2)(p<0.01).
- 생쥐 초기 배아의 발달 단계에 따른 동결 보존 효과에서 더 높은 생존율을 나타내었던 2세포기 배아를 동결 방법을 달리하여 생존율 및 발달율을 비교 조사해 본 결과, 완만 동결 - 급속 해동 방법에 따른 배아의 생존율이 75.4%, 급속 동결 - 급속 해동 방법은 3.9%로 완만 동결 - 급속 해동 방법에서 유의하게 더 높은 생존율을 보였으며(p<0.001), 또한 배아 발달율에 있어서도 완만 동결 - 급속 해동 방법은 41.4%가 부화 배포까지 발달한 반면, 급속 동결 - 급속 해동 방법은 해동 후 4세포기까지만 11.1%의 배아 발달이 진행되고, 그 이후로는 발달이 정지되었다(Table 5).
- , 1978). 완만 동결법은 보다 많은 세포를 탈수시킬 수 있고, 해동 후에도 세포의 생존성을 증가시킨다고 하는데, 본 연구 결과에서도 완만 동결 - 급속 해동 방법에서 좋은 결과를 얻었다. 그렇지만 모든 세포에 있어 완만 동결이 좋은건 아니며, 각각의 세포에 적합한 최적의 동결 속도가 있다고 한다(Mazur et al.
후속연구
- 또한, 해동 시 동결 보호제의 제거가 부적절하게 이뤄질 때도 동결 보호제의 독성으로 인해 세포는 손상을 입을 수 있다. 그래서 세포의 동결 과정 동안에 만들어질 수 있는 결빙 현상과 해동 시 동결 보호제로 인한 독성 효과를 최소화하기 위해 보다 더 완벽한 동결 보존법의 개발이 필요하다.
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