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문제 정의
- 본 연구는 도체중과 등심단면적과 연관되었다고 보고된 HGD 유전자를 한우에 적용하여 염기서열을 결정하고, SNP를 발굴하여 각 SNP와 경제형질과의 연관성을 구명하고자 수행하였다.
제안 방법
- PCR 증폭을 위한 반응 조건은 genomic DNA 50 ng, Primer 0.5 μM, dNTP 각 2.5 mM 10X Buffer (10 mM Tris-CL, 50 mM KCL, 1.5 mM MgCl2, pH 8.3), Taq polymerase 0.2 μl (10 unit/μl)를 넣고 최종 반응량이 20 μl가 되게 조정한 후 94℃에서 pre denaturation 5분, 94℃에서 denaturation 30초, primer에 적당한 annealing온도에서 30초, Pre Extension 72℃에서 30초로 총 35 cycle로 실행 후 final Extension을 72℃에서 5분 동안 GeneAmp PCR system 9700 Aplied Biosystems, USA)로 수행하여 증폭된 산물은 EtBr이 포함된 2% agarose gel을 이용하여 증폭여부를 확인하였다.
- HGD 유전자내 SNP를 탐색하기 위하여 증폭된 PCR product를 purification 과정을 거친 후, BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Aplied Biosystems, USA)를 활용하여 각각의 염기에 형광 dye를 부착한 후, ABI 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 통하여 개체별 염기서열을 결정하였다.
- 본 연구를 위해 사용된 sample은 쇠고기이력제를 위해 축산물 품질평가원에서 2010년도에 도축된 한우를 사용하였다. 한우의 HGD 유전자내 SNP탐색을 위해 아비가 서로 다른 24두에서 근육조직을 채취하여 사용하였으며, 경제형질과의 연관성 분석을 위해 도체 및 성장관련 성적(도체중, 등심 단면적, 등지방 두께, 근내 지방도)을 가진 한우 90두의 근육 조직을 QuickGene DNA tissue Kit S (KURABO, Japan)를 이용하여 지침서에 따라 수행하였다(한경대학교 동물실험윤리위원회 2014-6). 추출된 DNA는 ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer(NanoDrop Technologies, USA)로 순도 및 농도를 측정한 후 본 연구에 이용하였다.
- 한우의 HGD 유전자내 SNP탐색을 위해 아비가 서로 다른 24두에서 근육조직을 채취하여 사용하였으며, 경제형질과의 연관성 분석을 위해 도체 및 성장관련 성적(도체중, 등심 단면적, 등지방 두께, 근내 지방도)을 가진 한우 90두의 근육 조직을 QuickGene DNA tissue Kit S (KURABO, Japan)를 이용하여 지침서에 따라 수행하였다(한경대학교 동물실험윤리위원회 2014-6). 추출된 DNA는 ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer(NanoDrop Technologies, USA)로 순도 및 농도를 측정한 후 본 연구에 이용하였다.
- HGD 유전자(Accession No. NC_007299)를 구성하고 있는 모든 Exon 영역을 포함할 수 있도록 7개의 primer를 제작하여 각 primer별로 증폭을 위한 조건을 설정하였다(Table 1).
- 1 Cycle Sequencing Kits (Aplied Biosystems, USA)를 활용하여 각각의 염기에 형광 dye를 부착한 후, ABI 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 통하여 개체별 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 seqMAN II (DNA STAR Inc. USA)프로그램을 이용하여 SNP를 탐색하였다.
- NCBI에 등록된 염기서열(Accession No. NC_007299)의 Exon지역을 바탕으로 7개의 Primer를 제작하여 혈연관계가 없는 한우 24두를 대상으로 염기서열 분석을 통해 SNP지역을 확인하였다. 분석한 결과 총 10개의 SNPs (T11187C, T11301A, T11398G, G29833A, G34256T, G34257C, T34284C, T42333G, T42348C, T42468C)가 확인되었다(Fig.
- 90두를 대상으로 6개의 변이지역에 대한 개체별 유전자형 분석결과를 바탕으로 유전자형과 경제형질간의 연관성 분석을 실시하였다. G34256T지역과 경제형질간의 연관성 분석 결과 근내지방도에서 유의적인 연관성이 검출되었다.
대상 데이터
- 본 연구를 위해 사용된 sample은 쇠고기이력제를 위해 축산물 품질평가원에서 2010년도에 도축된 한우를 사용하였다. 한우의 HGD 유전자내 SNP탐색을 위해 아비가 서로 다른 24두에서 근육조직을 채취하여 사용하였으며, 경제형질과의 연관성 분석을 위해 도체 및 성장관련 성적(도체중, 등심 단면적, 등지방 두께, 근내 지방도)을 가진 한우 90두의 근육 조직을 QuickGene DNA tissue Kit S (KURABO, Japan)를 이용하여 지침서에 따라 수행하였다(한경대학교 동물실험윤리위원회 2014-6).
- 발굴된 10개의 SNP 중 genotype의 Frequency (MAF > 0.1)를 고려하여 6개 지역(G34256T, G34257C, T34284C, T42333G, T42348C, T42468C)을 선별하여 90두의 개체별 유전자형을 확인하였다.
데이터처리
- HGD유전자의 변이간의 연관불균형(Linkage disequilibrium) 정도를 추정하기 위해 HaploView software package [1]를 활용하여 분석을 수행하여 D’과 r2값을 추정하였다.
이론/모형
- 조사된 형질은 축산물 등급판정 세부기준 제 2004-66호의 측정방법을 이용하여 등지방두께, 등심단면적, 근내지방도 및 도체중 항목을 측정하였다(Table 2).
성능/효과
- 1). 발견된 10개의 SNPs 중 T11187C (rs43239703), G29833A (rs109637397), T42348C (rs137531856), T42468C (rs133513769)은 NCBI SNP DB (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?locusId=507496 )에 등록되어 있었으며 6개는 신규 SNPs 지역으로 확인되었다(Table 3). Zhou 등(2010)[20]에 의해 보고된 9개의 변이지역 중 A219G, A282C, A11206G, A29614G, G29859A, C34233, A42460G은 한우에서는 발견되지 않았다.
- Zhou 등(2010)[20]에 의해 보고된 9개의 변이지역 중 A219G, A282C, A11206G, A29614G, G29859A, C34233, A42460G은 한우에서는 발견되지 않았다. 그리고 Exon 10번의 SNP (G29833A)는 Arginine이 Histidine으로 바뀌는 non- synonymous mutation으로 확인되었다.
- 1)를 고려하여 6개 지역(G34256T, G34257C, T34284C, T42333G, T42348C, T42468C)을 선별하여 90두의 개체별 유전자형을 확인하였다. 유전자형의 빈도는 G34256T는 GG유전자형(0.5843), GT유전자형(0.3708) 그리고 TT유전자형(0.0449)이 확인되었다. G34257C는 GG유전자형(0.
- 0449)이 확인되었다. G34257C는 GG유전자형(0.3596), GC유전자형(0.3708) 그리고 CC유전자형(0.2697)으로 확인되었다. T34284C는 TT유전자형(0.
- 2697)으로 확인되었다. T34284C는 TT유전자형(0.1011), TC유전자형(0.5056) 그리고 CC유전자형(0.3933)으로 확인되었다. T42333G는 TT유전자형(0.
- 3933)으로 확인되었다. T42333G는 TT유전자형(0.3708), TG유전자형(0.5281) 그리고 GG유전자형(0.1011)으로 확인되었다. T42348C는 TT유전자형(0.
- 1011)으로 확인되었다. T42348C는 TT유전자형(0.1000), TC유전자형(0.5444) 그리고 CC유전자형(0.3556)으로 확인되었다. T42468C는 TT유전자형(0.
- 3556)으로 확인되었다. T42468C는 TT유전자형(0.1222), TC유전자형(0.5556), CC유전자형(0.3222)으로 확인되었다(Table 4).
- 또한 각각의 haplotype과 경제형질간의 연관성 분석한 결과 통계적으로 유의적이지 못한 것(p>0.05)으로 확인되었다.
- GG(79.96±1.59)유전자형이 CC(75.83±1.83), GC(74.54±1.56) 유전자형에 비해 우수한 등심단면적을 가지는 것으로 확인되었으며, GC(5.09± 0.34), GG(4.03±0.48)유전자형이 CC(3.45±0.40)유전자형 보다우수한 근내지방도를 가지는 것으로 확인되었다(p<0.05).
- GG(3.82± 0.27), TT(3.25±0.98) 유전자형에 비해 GT(5.09±0.344)유전자형이 우수한 근내지방도를 가지고 있는 것으로 확인되었다(p<0.05).
- NC_007299)의 Exon지역을 바탕으로 7개의 Primer를 제작하여 혈연관계가 없는 한우 24두를 대상으로 염기서열 분석을 통해 SNP지역을 확인하였다. 분석한 결과 총 10개의 SNPs (T11187C, T11301A, T11398G, G29833A, G34256T, G34257C, T34284C, T42333G, T42348C, T42468C)가 확인되었다(Fig. 1). 발견된 10개의 SNPs 중 T11187C (rs43239703), G29833A (rs109637397), T42348C (rs137531856), T42468C (rs133513769)은 NCBI SNP DB (http: //www.
- 90두를 대상으로 6개의 변이지역에 대한 개체별 유전자형 분석결과를 바탕으로 유전자형과 경제형질간의 연관성 분석을 실시하였다. G34256T지역과 경제형질간의 연관성 분석 결과 근내지방도에서 유의적인 연관성이 검출되었다. GG(3.
- 05). 또한 G34257C에서는 등심단면적과 근내지방도에서 유의적인 연관성이 검출되었다(Table 6). GG(79.
- 본 연구 결과 한우에서HGD유전자는 총 6개의 변이지역이 확인되었으며. 9개의 SNPs가 확인된 Chinese red cattle 종과는 1개의 SNP (T42333G)가 공통적으로 나타나는 것을 확인하였다.
- 본 연구 결과 한우에서HGD유전자는 총 6개의 변이지역이 확인되었으며. 9개의 SNPs가 확인된 Chinese red cattle 종과는 1개의 SNP (T42333G)가 공통적으로 나타나는 것을 확인하였다. 또한 Ponsuksili 등(2005)[14]과 Zhou 등(2010)[20]에 따르면 Chinese red cattle과 돼지에서 도체중과 관련된 후보 유전자로 보고되었으나 본 연구 결과 한우에서는 등심단면적과 근내지방도 형질과의 연관성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
- 따라서 본 연구 결과에서 확인된 근내지방도와 등심단면적과 연관된 한우의 HGD 유전자 내 변이지역인 G34256T, G34257C는 한우의 육질과 관련된 주요 형질에 영향을 미칠 것으로 사료된다. 또한 추후 HGD유전자를 포함하고 있는 QTL 영역 내의 변이지역을 확인한다면 한우에서 성장과 지방대사 작용에 관련된 후보유전자 연구에 활용 가능할 것으로 사료된다.
- T42333G, T42348C 그리고 T42468C 변이들 간의 D’값의 경우 0.784에서 1로 나타났으며, rsquare 값은 0.819에서 0.952로 확인되어 강한 LD가 형성되어 있음이 확인되었다(Table 5-a; Fig. 2).
후속연구
- 따라서 본 연구 결과에서 확인된 근내지방도와 등심단면적과 연관된 한우의 HGD 유전자 내 변이지역인 G34256T, G34257C는 한우의 육질과 관련된 주요 형질에 영향을 미칠 것으로 사료된다. 또한 추후 HGD유전자를 포함하고 있는 QTL 영역 내의 변이지역을 확인한다면 한우에서 성장과 지방대사 작용에 관련된 후보유전자 연구에 활용 가능할 것으로 사료된다.
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