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문제 정의
- 여주와 관련된 선행 연구로는 대만산 야생 여주의 항산화 및 free radical 소거능 활성(Wu SJ & Ng LT 2008), 여주 종자를 정유한 오일의 화학성분 및 항균활성(Alessandra B et al 2008), 쥐를 이용한 여주 메탄올 추출물의 항궤양 활성(Alam S et al 2009), 여주 추출물의 항산화 활성(Park Y et al 2007) 등이 보고되었으나, 아직까지 여주 미숙과의 생리활성에 대한 연구는 미흡한 실정으로, 본 연구에서는 국내산 미성숙 건여주 열수 및 에탄올 추출물의 탄수화물 분해효소 저해활성 및 항염증 활성에 대해 분석하고, 기능성 식품소재로서의 이용 가능성을 살펴보았다.
가설 설정
- 2) Values are means of triplicate with standard deviation.
제안 방법
- 반응 후 측정한 흡광도에서 초기 흡광도를 뺀 값으로 α-glucosidase의 저해율을 계산하였고, 대조군으로는 acarbose(Gluciobay tab., Bayer Inc. Korea)를 사용하였다.
- 이를 여과지(Toyo No. 2, Advantec. Japan)를 이용하여 여과한 후 감압농축기(LABOROTA 4000-efficient, Heidolph Instruments GmbH & Co. Germany)를 이용하여 농축한 뒤 동결건조하였다.
- 건여주 추출물은 열수와 에탄올로 추출하여 제조하였다. 열수 추출물은 건여주 100 g에 증류수 2 L를 가하여 65℃의 수조에서 4시간 동안 추출한 후 원심분리하여 상등액을 얻었다.
- 5 : 1) 용액 100 μL를 첨가하여 85℃의 수조에서 15분간 반응시킨 후, 증류수 900 μL를 첨가하고 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료 무첨가 군은 시료 대신 증류수를 첨가하였고, blank test는 효소용액 대신 증류수를 첨가하였으며, 대조군은 acarbose를 사용하였다.
- 8 μL를 섞어 분주하였다. 37℃에서 3일간 반응시킨 후 3% KI에 용해한 5 mM I2 용액 4 mL를 가해 15분간 발색시켜 나타나는 환의 반지름을 측정하여 환의 면적을 산출하였으며, 시료 무첨가 군의 면적에 대한 % 비율로 저해율을 나타내었다. 시료 무첨가군는 시료 대신 증류수를 첨가하였으며, 대조군은 acarbose를 시료와 동일한 농도로 제조하여 사용하였다.
- 37℃에서 3일간 반응시킨 후 3% KI에 용해한 5 mM I2 용액 4 mL를 가해 15분간 발색시켜 나타나는 환의 반지름을 측정하여 환의 면적을 산출하였으며, 시료 무첨가 군의 면적에 대한 % 비율로 저해율을 나타내었다. 시료 무첨가군는 시료 대신 증류수를 첨가하였으며, 대조군은 acarbose를 시료와 동일한 농도로 제조하여 사용하였다.
- 배양액이 제거된 각 well에 DMSO : ethanol(1:1) 용액 150 μL를 첨가하여 shaking incubator에서 30분간 교반한 후, ELISA reader를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 산출하였다.
- 세포 배양액 100μL와 Griess 시약 100 μL를 혼합하여 상온에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하고, sodium nitrite로 검정곡선을 작성하여 NO 함량을 산출하였다.
- 미숙과 건여주 추출물이 RAW264.7 대식세포에 독성을 나타내는지 확인하기 위해 MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였으며, 그 결과는 Fig. 3과 같다. 미숙과 건여주 추출물을 처리한 결과, 열수 추출물을 처리한 군은 가장 낮은 농도인 25 ppm에서 62.
- 86%의 높은 세포 생존율을 보여 독성을 거의 나타내지 않는 것으로나타나, 안전성을 보유한 소재임을 확인할 수 있었다. 이들 결과를 바탕으로 NO 생성량 측정은 대식세포에 대해 독성을 나타낸 열수 추출물을 제외한 에탄올 추출물을 이용하여 수행하였다.
- 본 연구에서는 국내에서 재배된 미성숙 건여주의 열수 및에탄올 추출물을 이용하여 탄수화물 분해효소 저해 활성 및 항염증 활성을 분석하였다. α-Glucosidase 저해 활성 측정 결과, 열수 추출물은 4,000 ppm의 농도에서 50% 이상, 에탄올 추출물은 70% 이상의 높은 α-glucosidase 저해 활성을 나타내었다.
- 0.2% bovine serum albumin과 0.02% NaN3을 함유한 100 mM potassium phosphate buffer(pH 7.0)를 용매로 하여 농도별 시료와 α-glucosidase 용액(70 unit/mL) 및 5 mM pNPG(ρ-nitrophenyl-α-D-glucopyra- noside)를 제조하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 여주는 경남 함양군에서 미숙과 상태로 채취하여 건조시킨 것을 구입하여 사용하였다.
- RAW264.7 대식세포는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받아 사용하였다. RAW264.
- 7 대식세포는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받아 사용하였다. RAW264.7 대식세포는 10% FBS, 1% penicillin이 첨가된 RPMI-1640 배지에서 배양하였으며, 37℃, 5% CO2 조건하에서 계대배양하며 사용하였다.
데이터처리
- 4) Capital letters (A∼C) are significantly different among the different samples in the same concentration by Duncan's multiple range test (p<0.05).
- 본 실험을 통해 얻은 결과들은 SPSS(version 20) program 을 이용하여 t-test 및 분산분석(ANOVA, analysis of variance) 을 실시하여 분석하였고, 각 시료들 간의 유의성 검증은 Duncan's multiple range test를 이용하여 실시하였다.
이론/모형
- α-Amylase agar diffusion을 이용한 건여주 추출물의 α-amylase 저해 활성은 Lim SH 등(2010)의 방법을 이용하여 측정하였다.
- 건여주 추출물의 α-amylase 저해 활성은 Ali H 등(2006)의 방법을 이용하여 측정하였다.
- 건여주 열수 및 에탄올 추출물의 α-glucosidase 저해 활성은 Watanabe J 등(1997)의 방법을 이용하여 측정하였다.
- RAW264.7 대식세포의 생존율은 Carmichael J 등(1987)의 방법을 이용하여 MTT assay를 실시하여 측정하였다. 세포가 1×105 cells/well이 되도록 배양액으로 희석한 후 96 well plate에 180 μL씩 분주하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양하였다.
- Lee SJ 등(2012)의 방법을 이용하여 건여주 열수 및 에탄올 추출물의 nitric oxide(NO) 생성량을 측정하였다. RAW264.
성능/효과
- 미성숙 건여주 열수 및 에탄올 추출물은 모두 당뇨병 치료제로 사용되고 있는 대조군인 acarbose보다 α-glucosidase에 대한 저해 활성이 낮았으나, α-glucosidase에 대한 저해 활성을 가지고 있었으며, α-glucosidase 농도가 높아질수록 α-glucosidase에 대한 저해 활성이 증가하였다.
- 그러나 에탄올 추출물은 무첨가군에 비해 clear zone이 현저히 감소하여 α-amylase에 대한 높은 저해 활성을 가지고 있음을 볼 수 있었다.
- α-Amylase agar diffusion 측정에서는 α-amylase 활성에 대한 시료의 억제 활성이 높을수록 전분 분해가 감소하여 요오드와 반응하는 면적은 늘고 clear zone은 줄어들게 되는데, 실험 결과, 열수 추출물과 acarbose의 clear zone은 무첨가군에 비해 감소하였으며, 두 시료 간에는 큰 차이가 나타나지 않았다.
- 본 연구에서 미숙과 건여주 에탄올 추출물은 당뇨병 치료제인 acarbose보다 높은 α-amylase 저해 활성을 보였으며, 1,000 ppm에서 acarbose에 비해 α-amylase 저해 활성이 4.1배로 높게 나타나, 우수한 저해 활성을 가지고 있는 효과적인 천연 당뇨조절제로서의 이용 가능성을 보여주었다.
- 특히, 에탄올 추출물의 α-amylase 저해 활성(41.34∼73.37%)은 모든 농도에서 대조군인 acarbose의 저해 활성(10.96∼49.04%) 및 열수 추출물의 저해 활성(12.83∼52.17%)보다 유의적으로 높게 나타났다.
- 미숙과 건여주 에탄올 추출물과 열수 추출물 모두 α-amylase에 대한 저해 활성을 보였으며, 추출물의 농도가 증가함에 따라 α- amylase에 대한 저해 활성도 증가하는 농도 의존적 활성 억제 양상을 보였다.
- 따라서 본 실험에서 나타난 미숙과 건여주 열수 및 에탄올 추출물의 α-glucosidase 저해 활성은 쇠비름 에탄올 추출물의 저해 활성보다 좀 더 높은 것으로 나타나, 양호한 항당뇨 활성을 가지고 있는 것으로 확인되었다.
- 또한, 에탄올 추출물은 열수 추출물보다 유의적으로 높은 α-glucosidase에 대한 저해 활성을 보였으며, 4,000 ppm 농도에서 에탄올 추출물은 70% 이상의 높은 저해 활성을 나타내었고, 열수 추출물은 50% 이상의 저해 활성을 나타내었다.
- 환의 반지름을 측정하여 면적을 구해서 시료의 α-amylase 저해율을 산출한결과(Table 2), 에탄올 추출물은 72.35%, 열수 추출물은 40.76%, acarbose는 34.75%의 순으로 α-amylase에 대한 저해 활성을 나타내어 앞의 α-amylase 저해 활성 실험과 일치하는 결과를 보여주었다.
- 항염증 효과가 있는 찔레꽃 나무뿌리의 에탄올 추출물은 100 μg/mL의 농도에서 대식세포에 대해 세포 독성을 나타내었다고 보고되었는데(Park GH et al 2011), 본 연구에서 미숙과 건여주 에탄올 추출물은 200 ppm 농도에서도 94.86%의 높은 세포 생존율을 보여 독성을 거의 나타내지 않는 것으로나타나, 안전성을 보유한 소재임을 확인할 수 있었다.
- 또한 α-amylase 저해 활성을 측정 결과, 에탄올 추출물은 모든 농도에서 열수 추출물과 대조군인 acarbose에 비해 유의적으로 높은 α-amylase 저해 활성을 보여주었다.
- α-Glucosidase 저해 활성 측정 결과, 열수 추출물은 4,000 ppm의 농도에서 50% 이상, 에탄올 추출물은 70% 이상의 높은 α-glucosidase 저해 활성을 나타내었다.
- 또한 미성숙 건여주 에탄올 추출물을 200 ppm 농도로 처리한 군에서 NO 생성량은 11.58 μM로, LPS 단일 처리군의 NO 생성량(21.19 μM)보다 약 45% 감소되어 건여주 에탄올 추출물의 NO 생성 저해 활성이 우수한 것으로 나타났다.
- LPS를 처리한 RAW264.7 대식세포에미 성숙 건여주 에탄올 추출물을 25∼200 ppm의 농도로 처리하여 NO 함량을 측정한 결과, 시료의 농도가 증가함에 따라 NO 함량이 유의적으로 감소하여(17.80∼11.58 μM) 건여주 에탄올 추출물 농도에 의존적인 것을 확인할 수 있었다.
- RAW264.7 대식세포가 기본적으로 생산해 내는 NO 함량을 측정하기 위해 LPS와 시료 모두 처리하지 않고 측정하였을때 NO 농도는 7.71 μM로 나타났으며, LPS를 처리하였을 때는 21.19 μM로 나타나 LPS 무처리군에 비해 NO 함량이 약 3배 정도 증가하였다.
- 3과 같다. 미숙과 건여주 추출물을 처리한 결과, 열수 추출물을 처리한 군은 가장 낮은 농도인 25 ppm에서 62.94%의 생존율을 보였으며, 이후 농도가 증가함에 따라 생존율은 낮아지는 것으로 나타났다. 반면, 에탄올 추출물을 처리한 군은 시료 무첨가군과 비교하였을 때 모든 농도에서 90% 이상의 높은 생존율을 나타내었다.
- α-Amylase agar diffusion을 이용한 α-amylase 저해율 산출에서도 에탄올 추출물은 72.35%, 열수추출물은 40.76%, acarbose는 34.75%의 순으로 α-amylase에 대한 저해를 나타내어 에탄올 추출물이 가장 높은 α-amylase 저해 활성을 나타내었다.
- 항염증 활성 분석에서는 RAW264.7 대식세포에 대한 세포 생존율을 확인한 결과, 열수 추출물을 처리한 군은 세포독성을 나타낸 반면, 에탄올 추출물을 처리한 군은 무처리군과 비교하였을 때 모든 농도(25∼200 ppm)에서 90% 이상의 높은 세포 생존율을 나타내었다.
- 7 대식세포에 대한 세포 생존율을 확인한 결과, 열수 추출물을 처리한 군은 세포독성을 나타낸 반면, 에탄올 추출물을 처리한 군은 무처리군과 비교하였을 때 모든 농도(25∼200 ppm)에서 90% 이상의 높은 세포 생존율을 나타내었다. LPS를 처리한 대식세포에 에탄올 추출물을 처리하여 NO 생성 억제 활성을 측정한 결과, 추출물의 농도가 증가함에 따라 NO 생성량이 유의적으로 감소하는 결과를 보였다. 따라서 이들 결과를 통해 미숙과 건여주 에탄올 추출물의 탄수화물 분해효소 저해 활성 및 항염증 활성이 우수함을 확인할 수 있었으며, 향후 이들이 혈당 조절 및 항염증 활성을 가진 건강기능식품 및 의약품 등의 천연 기능성 소재로서 이용 가능성이 높을 것으로 기대된다.
후속연구
- LPS를 처리한 대식세포에 에탄올 추출물을 처리하여 NO 생성 억제 활성을 측정한 결과, 추출물의 농도가 증가함에 따라 NO 생성량이 유의적으로 감소하는 결과를 보였다. 따라서 이들 결과를 통해 미숙과 건여주 에탄올 추출물의 탄수화물 분해효소 저해 활성 및 항염증 활성이 우수함을 확인할 수 있었으며, 향후 이들이 혈당 조절 및 항염증 활성을 가진 건강기능식품 및 의약품 등의 천연 기능성 소재로서 이용 가능성이 높을 것으로 기대된다.
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