산화적 스트레스에 대한 여주 (Momordica charantia) 추출물의 항산화 효과 및 세포사멸 억제 기전을 통한 신경세포보호효과 Neuroprotective effects of Momordica charantia extract against hydrogen peroxide-induced cytotoxicity in human neuroblastoma SK-N-MC cells원문보기
건 여주로부터 얻은 70%에탄올 추출물의 항산화 효과를 측정하고, $H_2O_2$에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호효과를 알아보기 위해 human neuroblastoma cell인 SK-N-MC세포를 이용하여 실험을 수행하였다. 여주 추출물의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 각각 28.51 mg gallic acid/extract g과 3.95 mg catechin/extract g 이었고, 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 ($IC_{50}$)은 $506.95{\mu}g/ml$ 이었다. 여주추출물을 신경세포에 전 처리한 후 $H_2O_2$을 처리하여 산화적 스트레스를 유도했을 때, 여주추출물에 의해 세포생존율은 증가되었고 세포내 ROS는 감소되는 것을 확인하였다. 그리고 세포내 항산화 방어시스템인 항산화효소 (SOD-1,2와 GPx-1)의 mRNA 발현이 여주추출물 처리에 의해 control 수준으로 회복되거나 control 보다 증가되는 결과를 보였으며, ROS 의존적 세포사멸과 연관 있는 것으로 알려진 MAPK pathway 중 p38과 JNK의 인산화를 여주추출물이 억제하였다. 또한 cleaved caspase-3와 cleaved PARP의 발현도 여주추출물의 처리에 의해 감소되었다. 본 연구 결과에서 70% 에탄올 여주추출물은 항산화효능이 우수하여 ROS를 직접적으로 제거할 뿐 아니라 세포내 ROS 축적을 억제시키는 효과를 보여주었다. 그리고 신경세포 내 항산화효소들의 발현 증가 기전과 p38, JNK의 인산화 억제 및 cleaved caspase-3, cleaved PARP의 발현 억제를 통한 세포사멸 억제 기전을 통해 산화적 스트레스로부터 신경세포를 보호하는 효과가 있음을 제시하고 있다. 따라서 여주추출물은 산화적 스트레스에 의한 알츠하이머병이나 파킨슨병 등과 같은 신경변성질환 (neurodegenerative disease)에 대한 예방 및 치료제의 소재로써 이용가치가 충분한 것으로 사료된다.
건 여주로부터 얻은 70%에탄올 추출물의 항산화 효과를 측정하고, $H_2O_2$에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호효과를 알아보기 위해 human neuroblastoma cell인 SK-N-MC세포를 이용하여 실험을 수행하였다. 여주 추출물의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 각각 28.51 mg gallic acid/extract g과 3.95 mg catechin/extract g 이었고, 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 ($IC_{50}$)은 $506.95{\mu}g/ml$ 이었다. 여주추출물을 신경세포에 전 처리한 후 $H_2O_2$을 처리하여 산화적 스트레스를 유도했을 때, 여주추출물에 의해 세포생존율은 증가되었고 세포내 ROS는 감소되는 것을 확인하였다. 그리고 세포내 항산화 방어시스템인 항산화효소 (SOD-1,2와 GPx-1)의 mRNA 발현이 여주추출물 처리에 의해 control 수준으로 회복되거나 control 보다 증가되는 결과를 보였으며, ROS 의존적 세포사멸과 연관 있는 것으로 알려진 MAPK pathway 중 p38과 JNK의 인산화를 여주추출물이 억제하였다. 또한 cleaved caspase-3와 cleaved PARP의 발현도 여주추출물의 처리에 의해 감소되었다. 본 연구 결과에서 70% 에탄올 여주추출물은 항산화효능이 우수하여 ROS를 직접적으로 제거할 뿐 아니라 세포내 ROS 축적을 억제시키는 효과를 보여주었다. 그리고 신경세포 내 항산화효소들의 발현 증가 기전과 p38, JNK의 인산화 억제 및 cleaved caspase-3, cleaved PARP의 발현 억제를 통한 세포사멸 억제 기전을 통해 산화적 스트레스로부터 신경세포를 보호하는 효과가 있음을 제시하고 있다. 따라서 여주추출물은 산화적 스트레스에 의한 알츠하이머병이나 파킨슨병 등과 같은 신경변성질환 (neurodegenerative disease)에 대한 예방 및 치료제의 소재로써 이용가치가 충분한 것으로 사료된다.
Purpose: Many studies have suggested that neuronal cells protect against oxidative stress-induced apoptotic cell death by polyphenolic compounds. We investigated the neuroprotective effects and the mechanism of action of Momordica charantia ethanol extract (MCE) against $H_2O_2-induced$ c...
Purpose: Many studies have suggested that neuronal cells protect against oxidative stress-induced apoptotic cell death by polyphenolic compounds. We investigated the neuroprotective effects and the mechanism of action of Momordica charantia ethanol extract (MCE) against $H_2O_2-induced$ cell death of human neuroblastoma SK-N-MC cells. Methods: The antioxidant activity of MCE was measured by the quantity of total phenolic acid compounds (TPC), quantity of total flavonoid compounds (TFC), and 2,2-Diphenyl-1-pycrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity. Cytotoxicity and cell viability were determined by CCK-8 assay. The formation of reactive oxygen species (ROS) was measured using 2,7-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA) assay. Antioxidant enzyme (SOD-1,2 and GPx-1) expression was determined by real-time PCR. Mitogen-activated protein kinases (MAPK) pathway and apoptosis signal expression was measured by Western blotting. Results: The TPC and TFC quantities of MCE were 28.51 mg gallic acid equivalents/extract g and 3.95 mg catechin equivalents/extract g, respectively. The $IC_{50}$ value for DPPH radical scavenging activity was $506.95{\mu}g/ml$ for MCE. Pre-treatment with MCE showed protective effects against $H_2O_2-induced$ cell death and inhibited ROS generation by oxidative stress. SOD-1,2 and GPx-1 mRNA expression was recovered by pre-treatment with MCE compared with the presence of $H_2O_2$. Pre-treatment with MCE inhibited phosphorylation of p38 and the JNK pathway and down-regulated cleaved caspase-3 and cleaved PARP by $H_2O_2$. Conclusion: The neuroprotective effects of MCE in terms of recovery of antioxidant enzyme gene expression, down-regulation of MAPK pathways, and inhibition apoptosis is associated with reduced oxidative stress in SK-N-MC cells.
Purpose: Many studies have suggested that neuronal cells protect against oxidative stress-induced apoptotic cell death by polyphenolic compounds. We investigated the neuroprotective effects and the mechanism of action of Momordica charantia ethanol extract (MCE) against $H_2O_2-induced$ cell death of human neuroblastoma SK-N-MC cells. Methods: The antioxidant activity of MCE was measured by the quantity of total phenolic acid compounds (TPC), quantity of total flavonoid compounds (TFC), and 2,2-Diphenyl-1-pycrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity. Cytotoxicity and cell viability were determined by CCK-8 assay. The formation of reactive oxygen species (ROS) was measured using 2,7-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA) assay. Antioxidant enzyme (SOD-1,2 and GPx-1) expression was determined by real-time PCR. Mitogen-activated protein kinases (MAPK) pathway and apoptosis signal expression was measured by Western blotting. Results: The TPC and TFC quantities of MCE were 28.51 mg gallic acid equivalents/extract g and 3.95 mg catechin equivalents/extract g, respectively. The $IC_{50}$ value for DPPH radical scavenging activity was $506.95{\mu}g/ml$ for MCE. Pre-treatment with MCE showed protective effects against $H_2O_2-induced$ cell death and inhibited ROS generation by oxidative stress. SOD-1,2 and GPx-1 mRNA expression was recovered by pre-treatment with MCE compared with the presence of $H_2O_2$. Pre-treatment with MCE inhibited phosphorylation of p38 and the JNK pathway and down-regulated cleaved caspase-3 and cleaved PARP by $H_2O_2$. Conclusion: The neuroprotective effects of MCE in terms of recovery of antioxidant enzyme gene expression, down-regulation of MAPK pathways, and inhibition apoptosis is associated with reduced oxidative stress in SK-N-MC cells.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 SK-N-MC 신경세포에 H2O2를 처리하여 유도된 산화적 스트레스에 대한 여주 추출물의 세포 보호효과 및 그 작용 기전을 확인하고자 한다.
세포보호효과의 기전으로는, 상대적으로 약한 산화적 스트레스 상태 (H2O2200 μM)에서는 항산화효소의 발현 증가를 유도하여 세포 내 항산화 방어시스템의 정상화를 통한 보호효과를 나타내고, 강한 스트레스 상태 (H2O2 500 μM)에서는 MAPKpathway의 인산화와 cleaved caspase-3 및 cleaved PARP의 발현을 억제하여 apoptotic cell death 억제를 통한 보호 효과를 나타낸다 할 수 있다. 본 연구는 여주추출물의 신경세포보호효과에 대한 기전적인 연구를 통해 여주추출물이 산화적 스트레스에 의한 신경세포 손상 및 사멸을 억제하는데 효과적이었으며, 나아가 신경변성질환의 예방 및치료를 위한 기능성 소재로써의 가능성을 제시하였다. 위 연구 결과를 바탕으로 여주추출물이 본 연구에서 확인한 기전 외에 다양한 세포보호 기전에도 효과가 있을 것으로사료되며 추가적인 연구를 진행할 예정이다.
제안 방법
70% 에탄올로 추출한 여주추출물 내 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량을 측정하였고, 추출물 g당 각각 28.51± 1.75 mg gallic acid와 3.95 ± 0.92 mg catethin이었다(Table 2).
Apoptosis signal에 대한 MCE의 효과 확인을 위해 caspase-3, cleaved caspase-3, PARP, cleaved PARP의단백질 발현을 비교하였다. H2O2 500 μM 처리에 의해 cleaved caspase 3와 cleaved PARP 의 발현이 증가되었고,MCE 전 처리 후 산화적 스트레스를 유도 했을 때 상대적으로 감소되는 결과를 나타내었으며 이는 MCE 전 처리가산화적 스트레스에 의한 apoptosis를 억제한다는 결과라 할 수 있다 (Fig.
그 후 1M NaOH 50 μl을 넣은 다음 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. Catechin을 표준물질로 사용하여 검량선을 그려서 추출물의 총 플라보노이드의 함량을 계산하였다.
DCF-DA용액을 제거한 후 HBSS로 2회 세척한 후 과산화수소를 500 μM 농도로 처리하였고, 세포내 형광 광도의 변화를 형광광도계를 이용하여 485 nm와 530 nm에서 측정하였다.
그 후 4% Na2CO3 750 μl를 넣어준 후 섞어서 빛을 차단하여 1시간동안 방치한 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid를 표준물질로 사용하여검량선을 그려서 추출물의 총 폴리페놀의 함량을 계산하였다.
MAPK pathway인 ERK, JNK, p38의 인산화에 대한 억제 효과 여부를 확인하기 위하여 MCE를 6시간동안 전 처리한 후, H2O2로 18시간동안 산화적 스트레스를 유도한 후단백질을 추출하여 western blotting을 통해 단백질 발현을 비교하였다.
SK-N-MC cell에 H2O2와 여주추출물 (MCE)을 처리하여 CCK-8 assay를 통해 세포생존율을 측정하였다 (Fig. 1). 산화적 스트레스를 유도하기 위한 H2O2 처리 결과 200μM 농도에서부터 유의적인 세포생존율감소를 보였다.
SK-NMC 세포를 2 × 104 cell/100 μl로 96well plate에 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 여주추출물과 과산화수소를 농도별 시간별로 처리하였고 37oC, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 CCK-8용액 을 10 μl 처리하여 2시간 배양 후,450 nm에서 microplate reader (Sunrise, Tecan, Grödig,Austria)를 이용하여 측정하였다.
3% (w/v) fat-free BSA (Sigma-Aldrich, USA)를 용해시킨 TBS-T용액에 primary antibody를 1:1,000의 비율로 희석시켜 4oC에서 18 hr 동안 반응시켰고, TBS-T로 3회 세척 후 HRP-conjugated secondary antibody를 1:2,000으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBS-T로 3회 세척 후 ECL-western blotting substrate (Thermo scienrific, Rockford, U.S.A)을 처리한 뒤 결과를 확인하였다.
(San Diego, USA)에서 구입하였다. TRizol (invitrogen, Groningen, Netherland)을 이용하여 RNA를 추출하였고, cDNA 합성은 TaKaRa(Shuzo Shiga, Japan)의 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis kit를 이용하였다. Real time RT PCR은 Roche Diagnostics (Mannheim, Germany)의 Universal Probe-Library Probe와 LightCycler480 Probe Master를 이용하였다.
처치한 SK-N-MC 세포에서 trizol을 이용하여 total RNA를 추출하였고, PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis kit를 이용하여 total RNA를 cDNA로 합성하였다. cDNA는 희석한 후 Table 1의 primer와 Universal ProbeLibraryProbe를 LightCycler 480 Probe Master에 함께 혼합하여 LightCycler 480 multiwell plate에 분주하여 LightCycler 480 (Roche Diagnostics Ltd. Rolkreuz. Switzerland) 장비를 이용하여 real time PCR분석을 실시하였다.
이 용액 1 ml을 다양한 농도의 시료 1 ml에 넣어 잘 혼합해주고 상온에서 30분간 반응시켜 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 별로DPPH radical을 50% 저해하는 농도인 IC50 (half-maximal inhibitory concentration)을 구하였다. 대조구로 ascorbic acid의 활성을 측정하여 IC50 값을 측정하였다.
건 여주로부터 얻은 70%에탄올 추출물의 항산화 효과를 측정하고, H2O2에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호효과를 알아보기 위해 human neuroblastomacell인 SK-N-MC세포를 이용하여 실험을 수행하였다. 여주 추출물의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 각각 28.
각 시료 별로DPPH radical을 50% 저해하는 농도인 IC50 (half-maximal inhibitory concentration)을 구하였다. 대조구로 ascorbic acid의 활성을 측정하여 IC50 값을 측정하였다.
따라서 68.5 ± 1.5%의 세포생존율을 보이는 H2O2500 μM을 최종 처리 농도로 정하였다 (Fig. 1A).
Human neuroblastoma cell line인 SK-N-MC 세포를EMEM 배지에 10% FBS와 1% antibiotics를 첨가한 배양액을 사용하여 배양하였다. 배양액은 48시간 주기로 교체하였으며, 여주추출물을 전 처리한 후 과산화수소 처리를 통해 산화적 스트레스를 유도하였다.
산화적 스트레스에 대한 체내 방어기전인 항산화효소에 대한 mRNA 수준에서의 발현을 real time PCR을 통해 비교하였다. 대표적인 항산화 효소인 SOD-1,2 (superoxidedismutase-1,2)와 GPx-1 (glutathion peroxidase-1)의 발현 정도는 Fig.
세포내 ROS의 축적 정도를 정량하기 위해 SK-N-MC 세포를 4 × 104 cell/100 μl로 96well plate에 분주하여 24시간 배양 후, 여주추출물을 농도별로 처리하여 37oC에서 6시간동안 배양하였다.
세포생존율 결과를 바탕으로 MCE의 세포내 ROS에 대한 감소 효과를 확인하기 위해 세포내 ROS 축적 정도를 정량하였다. 측정 결과 아무것도 처리하지 않은 control과 비교하여 H2O2 500 μM를 처리한 그룹에서 세포내 ROS가약 3배 상승하였고, MCE를 1, 5, 10 μg/ml 농도로 전 처리한 그룹에서 H2O2 500 μM 만 처리한 그룹과 비교하여 유의적으로 감소된 결과를 보였으며 그 값은 각 각 control대비 2.
여주 추출물이 H2O2처리에 의한 세포생존율 감소를 억제하고 세포내 ROS 축적 정도 감소시키는 결과를 통해 세포보호효과가 있음을 1차적으로 확인하였고, 이에 대한 기전 확인을 위해 추가 실험을 진행하였다.
처치한 SK-N-MC 세포에서 trizol을 이용하여 total RNA를 추출하였고, PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis kit를 이용하여 total RNA를 cDNA로 합성하였다. cDNA는 희석한 후 Table 1의 primer와 Universal ProbeLibraryProbe를 LightCycler 480 Probe Master에 함께 혼합하여 LightCycler 480 multiwell plate에 분주하여 LightCycler 480 (Roche Diagnostics Ltd.
최종 처리 농도를 정하고여주추출물을 0, 1, 5, 10 μg/ml 농도로 각각 6시간동안 전처리 후, 과산화수소를 500 μM로 18시간 처리하여 산화적스트레스를 유도하고 CCK-8 시약을 이용해 여주추출물농도별 세포생존율의 차이를 비교하였다.
대상 데이터
Cell counting kit-8(CCK-8) 시약은 Dojindo molecular technologies Inc.(Gaithersburg, MS, USA)의 제품을 사용하고, intracellular ROS assay kit는 Cell Biolabs, INC. (San Diego, USA)에서 구입하였다. TRizol (invitrogen, Groningen, Netherland)을 이용하여 RNA를 추출하였고, cDNA 합성은 TaKaRa(Shuzo Shiga, Japan)의 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis kit를 이용하였다.
Human neuroblastoma SK-N-MC 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockvill, VA, USA)에서구입하였다. 세포배양에 사용된 Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)와 fetal bovine serum (FBS), trypsin-EDTA, antibiotics, HBSS는 Well gene (Daegu, Korea) 제품을 구입하여 사용하였다.
Human neuroblastoma cell line인 SK-N-MC 세포를EMEM 배지에 10% FBS와 1% antibiotics를 첨가한 배양액을 사용하여 배양하였다. 배양액은 48시간 주기로 교체하였으며, 여주추출물을 전 처리한 후 과산화수소 처리를 통해 산화적 스트레스를 유도하였다.
세포배양에 사용된 Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)와 fetal bovine serum (FBS), trypsin-EDTA, antibiotics, HBSS는 Well gene (Daegu, Korea) 제품을 구입하여 사용하였다. 본 실험에서 사용한 과산화수소 (H2O2)를 비롯한 일반 시약들은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Cell counting kit-8(CCK-8) 시약은 Dojindo molecular technologies Inc.
세포배양에 사용된 Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)와 fetal bovine serum (FBS), trypsin-EDTA, antibiotics, HBSS는 Well gene (Daegu, Korea) 제품을 구입하여 사용하였다.
여주는 충남 금산 (Geumsan, Korea)에서 생산되어, 건조된 여주를 구입하였다. 건 여주를 가루가 되도록 곱게 갈아주었다.
데이터처리
모든 측정값은 3회 이상 분석하였고, SPSS 20.0을 이용하여 student's t-test 또는 one-way ANOVA test 후 Duncan's test를 실시하여 p < 0.05 수준에서 대조군과 각 실험군 간의 유의성을 검증하였으며 모든 결과는 mean ± SD으로 표시하였다.
이론/모형
1C. The generation of intracellular ROS was determined by DCFDA methods using a fluorescence spectrophotometer with excitation and emission wavelengths of 485 nm and 530 nm, respectively. Value represent the mean ± SD.
생존율 측정은 CCK-8 assay kit를 이용하였다. SK-NMC 세포를 2 × 104 cell/100 μl로 96well plate에 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 여주추출물과 과산화수소를 농도별 시간별로 처리하였고 37oC, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 CCK-8용액 을 10 μl 처리하여 2시간 배양 후,450 nm에서 microplate reader (Sunrise, Tecan, Grödig,Austria)를 이용하여 측정하였다.
총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis’s phenol method로 측정하였다.
총 플라보노이드 함량은 염화알루미늄의 비색법에 따라 측정하였다.33 추출한 시료를 methanol로 20배 희석하여 10 mg/ml이 되도록 만들었다.
추출물의 free radical 소거 활성을 측정하기 위하여DPPH를 이용한 Blios의 방법을 사용하였다.34 DPPH (2,2-diphenyl-1-pycrylhydrazyl)를 methanol에 용해시켜 0.
성능/효과
H2O2 500 μM 처리에 의해 cleaved caspase 3와 cleaved PARP 의 발현이 증가되었고,MCE 전 처리 후 산화적 스트레스를 유도 했을 때 상대적으로 감소되는 결과를 나타내었으며 이는 MCE 전 처리가산화적 스트레스에 의한 apoptosis를 억제한다는 결과라 할 수 있다 (Fig. 5).
H2O2 500 μM를 처리한 경우 control과 비교하여 MAPKpathway의 인산화정도가 증가되었지만, MCE 전 처리를 통해서 인산화가 억제 되는 것을 확인할 수 있었다.
MCE 5, 10 μg/ml 농도로 처리한 그룹에서 H2O2 200μM만 처리했을 때와 비교하여 통계적으로 유의적인 발현증가를 보였으며, 특히 5 μg/ml 농도로 처리한 그룹에서는 control 수준으로 회복 하거나 그 이상으로 증가 (5 μg/ml에서의 SOD-2 발현은 1.12 ± 0.0배. Fig. 3B)되는 것으로 나타났다 (Fig. 3).
MCE를 처리한 결과 control과 비교하여 MCE의 처리가 세포 생존율에 거의 영향을 미치지 않았다. MCE 20 μg/ml 농도 이상부터 세포 생존율이 감소하는 경향을 보였지만,통계적으로 유의하지는 않았다 (Fig.
그러나 본 연구의 세포생존율과 세포내 ROS 축적 정도를 정량한 실험과 같은 조건으로 (H2O2 500 μM) 산화적스트레스를 유도했을 때, SOD-2와 CAT의 발현은 여주추출물 전 처리에 의해 증가되기는 하였으나 증가의 정도가약하였고 SOD-1과 GPx-1은 여주추출물 처리 유무와는 상관없이 발현이 감소하는 것으로 나타나는 등 (data not shown) H2O2 500 μM 농도에서는 여주추출물의 세포내 항산화 방어 시스템에 대한 보호효과를 확인할 수 없었다.
여주추출물을 신경세포에 전 처리한 후 H2O2을 처리하여 산화적 스트레스를 유도했을 때, 여주추출물에 의해 세포생존율은 증가되었고 세포내 ROS는감소되는 것을 확인하였다. 그리고 세포내 항산화 방어시스템인 항산화효소 (SOD-1,2와 GPx-1)의 mRNA 발현이 여주추출물 처리에 의해 control 수준으로 회복되거나 control 보다 증가되는 결과를 보였으며, ROS 의존적 세포사멸과 연관 있는 것으로 알려진 MAPK pathway 중 p38과 JNK의 인산화를 여주추출물이 억제하였다. 또한 cleaved caspase-3와 cleaved PARP의 발현도 여주추출물의 처리에 의해 감소되었다.
본 연구 결과에서 여주추출물이 CAT의 mRNA 발현에는 영향을 미치지 않았지만 (data not shown), 나머지 항산화 효소들 대부분에서는 발현 증가를 나타낸 것으로 보아 H2O2에 의한 세포내 항산화 방어 시스템의 mRNA 발현 감소를 여주추출물이 억제시킴으로써 세포보호효과를 갖는 다고 할 수 있다. 그리고 일반적으로 항산화 효소 활성 또는 유전자 발현은 산화적 스트레스 상태에서 상승하는데, 본 연구에서는 H2O2에 의한 산화적 스트레스 상태에서 항산화효소의 mRNA발현이 control에 비해 감소하였다. 본 연구의 결과와 비슷한 결과를 보였던 H2O2 200 μM 농도로 24시간동안 처리한 Choi 등39의 연구에서는 H2O2에 대한 장시간 노출이 고농도의산화적 스트레스 상태를 유도하였으며 이로 인한 세포에 손상 때문일 것으로 설명하고 있으며, 본 연구결과도 동일한 이유일 것으로 사료된다.
대표적인 항산화 효소인 SOD-1,2 (superoxidedismutase-1,2)와 GPx-1 (glutathion peroxidase-1)의 발현 정도는 Fig. 3에서와 같이 H2O2 200 μM을 처리한 그룹에서 발현이 가장 낮았으며 MCE 전 처리에 의해 증가되었고 control수준으로 회복되는 것으로 나타났다.
87%였다. 따라서 본 연구의 여주추출물이 높은 라디칼 소거능을 가지며 항산화능이 우수하다고 할 수 있다.
또한 cleaved caspase-3와 cleaved PARP의 발현도 여주추출물의 처리에 의해 감소되었다. 본 연구 결과에서 70% 에탄올 여주추출물은 항산화효능이 우수하여 ROS를 직접적으로 제거할 뿐 아니라 세포내 ROS 축적을 억제시키는 효과를 보여주었다. 그리고 신경세포 내 항산화효소들의 발현 증가 기전과 p38, JNK의 인산화 억제 및 cleaved caspase-3,cleaved PARP의 발현 억제를 통한 세포사멸 억제 기전을 통해 산화적 스트레스로부터 신경세포를 보호하는 효과가 있음을 제시하고 있다.
이러한 결과는 Choi 등39의 연구에서 추출물인 corn milk maysin을 처리한 그룹에서 SOD-1,2, CAT, GPx-1 등의 항산화효소 mRNA 발현이 H2O2만 처리한 그룹과 비교하여 증가하였고 control 수준으로의 회복을 보이는 결과와 같은 경향이었으며, 도라지와 더덕추출물이 H2O2만 처리한 그룹과 비교하여 항산화효소의 mRNA 발현을 증가시킨다는 Kim 등12의 연구 결과와도 비슷한 결과였다. 본 연구 결과에서 여주추출물이 CAT의 mRNA 발현에는 영향을 미치지 않았지만 (data not shown), 나머지 항산화 효소들 대부분에서는 발현 증가를 나타낸 것으로 보아 H2O2에 의한 세포내 항산화 방어 시스템의 mRNA 발현 감소를 여주추출물이 억제시킴으로써 세포보호효과를 갖는 다고 할 수 있다. 그리고 일반적으로 항산화 효소 활성 또는 유전자 발현은 산화적 스트레스 상태에서 상승하는데, 본 연구에서는 H2O2에 의한 산화적 스트레스 상태에서 항산화효소의 mRNA발현이 control에 비해 감소하였다.
본 연구에 사용된 여주의 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량 측정 결과 70% 에탄올 추출물 g당 총 폴리페놀과 총 플라보노이드는 각각 28.51 ± 1.75 mg gallic acid와 3.95 ± 0.92 mg catethin로 나타났다.
따라서 여주추출물이 MAPK pathway 중 특히 p38과 JNK의 인산화 억제를 통해 신경세포의 사멸을 억제하는 신경세포에 대한 보호효과를 나타낸다고 할 수 있다. 본 연구에서 MAPK pathway 중 ERK의 인산화 억제에는 유의한 결과를 보이지 않았다 (data not shown).
의 연구에서도 ROS에 의한 apoptosis signal-regulating kinase (ASK1)의 활성은 p38과 JNK를 활성화시키고 이것은 신경세포의 apoptosis를 초래 한다고 보고되어 있다. 본 연구의 여주추출물은 산화적 스트레스가 유도된 신경세포에서 p38,JNK의 인산화를 효과적으로 억제시켰다. Chung 등40과 Park 등45 그리고 Jiang 등46의 연구에서도 H2O0로 산화적스트레스가 유도된 신경세포에서 p38, JNK, ERK의 인산화가 증가되었고, 각 연구에서의 보호효과 평가를 위한 물질을 처리했을 때 p38, JNK, ERK의 인산화를 억제하는 결과를 보고하고 있다.
산화적 스트레스로부터 MCE에 의한 세포보호효과를 확인하기 위해 MCE를 6시간동안 전 처리한 후, H2O2로 18시간동안 산화적 스트레스를 유도했을 때 세포생존율을 확인한 결과, MCE를 전 처리한 그룹 1, 5, 10, 20 μg/ml 농도에서 각 각 85.8 ± 2.1, 85.9 ± 1.3, 80.5 ± 0.4, 76.5 ±0.6%로 H2O2만 처리한 그룹 (59.6 ± 2.2%)보다 약 17~26%정도 세포생존율이 높은 것을 확인할 수 있었으며 통계적으로도 유의적인 결과가 나타났다 (Fig. 1C).
산화적 스트레스를 유도하기 위한 H2O2 처리 결과 200μM 농도에서부터 유의적인 세포생존율감소를 보였다.
생체 내에 항산화 방어시스템으로 작동하는 4가지 항산화 효소 (SOD1, SOD2, CAT, GPx)들의 mRNA 발현에 대하여 여주추출물이 미치는 영향을 real time PCR을 통해 알아본 결과 H2O2 200 μM 처리에 의해 발현이 감소되었던 SOD-1,2와 GPx-1의 발현이 여주추출물 전 처리에 의해 control수준으로 회복되거나 control보다 증가된 발현을 보였고 통계적으로도 유의하였다.
95 μg/ml 이었다. 여주추출물을 신경세포에 전 처리한 후 H2O2을 처리하여 산화적 스트레스를 유도했을 때, 여주추출물에 의해 세포생존율은 증가되었고 세포내 ROS는감소되는 것을 확인하였다. 그리고 세포내 항산화 방어시스템인 항산화효소 (SOD-1,2와 GPx-1)의 mRNA 발현이 여주추출물 처리에 의해 control 수준으로 회복되거나 control 보다 증가되는 결과를 보였으며, ROS 의존적 세포사멸과 연관 있는 것으로 알려진 MAPK pathway 중 p38과 JNK의 인산화를 여주추출물이 억제하였다.
우수한 라디칼 소거능을 통해 항산화능력 확인된 여주추출물의 세포내 ROS 감소 및 세포 사멸에 대한 보호 효과를 확인한 결과, 여주추출물을 전 처리한 후 H2O2를 처리하여 산화적 스트레스를 유도한 그룹이 H2O2만 처리한 그룹에 비해 세포생존율은 증가되고 세포내 ROS는 감소된 것을 확인하였다. 다양한 식품 추출물을 처리한 연구들11,39,40에서 H2O2만 처리한 그룹에서 감소한 세포생존율과 증가한 세포내 ROS수준이 각 각 연구에 사용한 추출물을 처리하였을 때 control 그룹의 결과 수준으로 정상화되었으며, 이는 본 연구결과와 일치하였다.
15-17 본 연구에서도 H2O2에 의해 cleaved caspase-3와 cleaved PARP의 발현이 증가되었고, 여주추출물을 전처리한 후 H2O2을 처리하여 산화적 스트레스를 유도했을 때 그 발현이 유의적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig 5A, B). 이 결과를 통해 H2O2에 의한 caspase-3와PARP 의존성 세포사멸 유도를 여주추출물이 억제시켜주는 것을 확인하였다.
이상의 연구결과들에서 여주추출물의 우수한 항산화력과 신경세포 보호효과를 확인하였다. 세포보호효과의 기전으로는, 상대적으로 약한 산화적 스트레스 상태 (H2O2200 μM)에서는 항산화효소의 발현 증가를 유도하여 세포 내 항산화 방어시스템의 정상화를 통한 보호효과를 나타내고, 강한 스트레스 상태 (H2O2 500 μM)에서는 MAPKpathway의 인산화와 cleaved caspase-3 및 cleaved PARP의 발현을 억제하여 apoptotic cell death 억제를 통한 보호 효과를 나타낸다 할 수 있다.
3 mg gallic acid의 총 페놀화합물 함량을 보고하고 있고, Kim 등24의 연구결과에서도 흑두나 어성초와 같이 항산화능이 높다고 알려져 있는 식물추출물에서 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 매우 낮거나 아예 검출되지 않았다고 보고하고 있다. 이에 본 연구에서 추출한 여주추출물은 항산화 작용이 뛰어난 폴리페놀과 플라보노이드의 함량이 비교적 높은 것으로 나타나 천연항산화제로써 이용가치가 충분하다고 판단된다.
측정 결과 아무것도 처리하지 않은 control과 비교하여 H2O2 500 μM를 처리한 그룹에서 세포내 ROS가약 3배 상승하였고, MCE를 1, 5, 10 μg/ml 농도로 전 처리한 그룹에서 H2O2 500 μM 만 처리한 그룹과 비교하여 유의적으로 감소된 결과를 보였으며 그 값은 각 각 control대비 2.1 ± 0.1, 2.0 ± 0.1, 2.0 ± 0.1배였다 (Fig. 2).
특히MCE 5, 10 μg/ml에서 H2O2 500 μM에 비해 유의적으로 낮은 인산화 정도를 나타냈으며, p38의 인산화보다 JNK의인산화 억제에 더 효과적임을 알 수 있었다 (Fig. 4).
후속연구
본 연구는 여주추출물의 신경세포보호효과에 대한 기전적인 연구를 통해 여주추출물이 산화적 스트레스에 의한 신경세포 손상 및 사멸을 억제하는데 효과적이었으며, 나아가 신경변성질환의 예방 및치료를 위한 기능성 소재로써의 가능성을 제시하였다. 위 연구 결과를 바탕으로 여주추출물이 본 연구에서 확인한 기전 외에 다양한 세포보호 기전에도 효과가 있을 것으로사료되며 추가적인 연구를 진행할 예정이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
활성산소종은 무엇이 있으며, 무엇을 유발하는가?
ROS는 superoxide radical (-O2), hydrogen peroxide(H2O2), hydroxyl radical (-OH) 등이 있으며, 환경적 요인이나 생활습관 또는 스트레스로 인해 생성되고 과다 생성되거나 축적이 계속되면 산화적 스트레스를 유발하며 이로 인한 세포 사멸 유도는 노화를 촉진되고 뇌질환, 심혈관계 질환, 당뇨, 암 등을 유발한다.6,7 특히 뇌는 세포막에 불포화지방산과 철분, 구리, 아연 등의 금속이온이 풍부하고 산소 순환이 집중되기 때문에 산화되기 쉬우며, 산화적 손상으로 인한 순차적 신호전달에 의해 세포사멸이 일어난다.
여주란 무엇인가?
여주 (Momordica charantia L.)는 인도, 중국, 중앙아메리카에서는 당뇨의 민간요법 치료제로써 사용되어지고있는 박과의 덩굴식물로 비타민C, β-carotene, glucoside,saponin, alkaloid, terpene, protein, Fe, K 등을 함유한다.18미숙한 여주열매는 비타민C, 비타민A와 철 등의 주요한 공급원이 되고 있으며, 여주의 쓴맛에는 식물스테롤 배당체들과 많은 종류의 amino acid, galacturonic acid, citruline,pectin 등의 성분이 들어 있다.
여주의 쓴맛에는 어떤 성분들이 포함되어있는가?
)는 인도, 중국, 중앙아메리카에서는 당뇨의 민간요법 치료제로써 사용되어지고있는 박과의 덩굴식물로 비타민C, β-carotene, glucoside,saponin, alkaloid, terpene, protein, Fe, K 등을 함유한다.18미숙한 여주열매는 비타민C, 비타민A와 철 등의 주요한 공급원이 되고 있으며, 여주의 쓴맛에는 식물스테롤 배당체들과 많은 종류의 amino acid, galacturonic acid, citruline,pectin 등의 성분이 들어 있다. 특히 여주의 과실과 종자에는 charantin 성분은 항 당뇨 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
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