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느타리버섯 재배 토양으로부터 분리한 Ochrobactrum anthropi A-1의 식물생장촉진효과
Plant Growth Promotion Effect of Ochrobactrum anthropi A-1 isolated from Soil of Oyster Mushroom Farmhouse 원문보기

Journal of mushrooms = 한국버섯학회지, v.13 no.4, 2015년, pp.275 - 281  

이창재 (충남대학교 농업생명과학대학 생물환경화학과) ,  이헌학 (충남대학교 농업생명과학대학 생물환경화학과) ,  윤민호 (충남대학교 농업생명과학대학 생물환경화학과)

Abstract AI-Helper 아이콘AI-Helper

An auxin-producing bacteria (A-1) was isolated from soils of Oyster mushroom farmhouse in Daejeon city, South Korea. The strain A-1 was classified as a novel strain of Ochrobactrum anthropi based on a chemotaxanomic and phylogenetic analyses. The isolate was confirmed to produce indole-3-acetic acid...

주제어

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제안 방법

  • Auxin 생산능 확인시험으로 pot 재배를 통한 녹두발근검정법을 병행 수행하였다. 상기 ‘녹두발근생검법’에 따라 얻어진 녹두 자엽의 하배축을 멸균된 상토 (밭흙: 버미큘라이트: 상토= 2:1:1)에 선발균주의 배양 상등액을 100배 희석하여 3일에 한번 씩 20일 동안 관주한 후 형성된 발근수와 발근 길이를 측정하여 뿌리발근 효과를 조사하였다.
  • Auxin 생산능 확인시험으로 pot 재배를 통한 상추발근검정법을 병행 수행하였다. 자라고 있는 상추 묘목을 구입해 멸균된 상토 (밭흙: 버미큘라이트: 상토= 2:1:1)에 선발균주의 배양 상등액을 100배 희석하여 3일에 한번씩 약 한달 동안 관주한 후 형성된 발근 길이와 뿌리의 무게를 측정하여 뿌리발근 효과를 조사하였다.
  • 1% L-tryptophan이 첨가된 R2A agar 배지에 tooth-picking하여 Salkowski시약과 반응시켜 colony 주변에 붉은색을 형성하는 8개의 균을 1차 선발하였다. 고체 배지 상에서 양성반응을 보인1차 선발균주들을 0.1% L-tryptophan이 첨가된 R2A broth 배지(pH 7.0)에 접종하여 30℃, 24시간 진탕 배양한 배양액을 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 배양 상등액과 Salkowski 시약을 1:3의 비율로 혼합하여 30분 간암반응시킨 후 형성된 붉은색의 강약을 분광광도계를 이용하여 선발균들의 auxin 생성능을 확인한 결과, 선발균주 중 흡광도가 높은 A-1이 상대적으로 붉은색이 가장 짙게 나타남으로써 IAA 생성능이 높음을 육안으로 확인할수 있었다(Fig.
  • 1% L-tryptophan이 첨가된 R2A 고체배지에 도말하여 30℃에서 배양하였다. 고체배지에서 순수 분리 된 colony를 auxin 기본배지에 tooth-picking 한 후 Salkowski 시약을 분산시켜 외관상 colony 주변에 분홍색을 띄는 균주들을 auxin 생성균주로 1차 선발하였다.
  • 균일한 크기로 선별된 녹두묘로부터 자엽을 제거하고 자엽 밑으로 하배축을 4 cm 남기고 소독된 예리한 칼로 절단한 후 Salkowski test에서 auxin 생산성이 높게 나타난 균주의 배양 상등액50 µL와 멸균증류수 5 mL (배양 상등액: 멸균증류수=1:100)와 NPK양액이 첨가된 vial에 절단한 유묘 3개씩을 넣고 24시간마다 용액의 수분을 멸균증류수로 일정수준까지 보충하여 동일한 환경조건하에서 연속조명으로 10일간 발근시킨 후 1 mm 이상의 발근수를 계수하였고, 뿌리 길이를 측정하여 합산하였다.
  • 분리균 1%를 seed 접종 후 35℃에서 배양 시 균의 생육은 약 24시간에 대수기 후기에 도달하였으며, 생육초기에는 IAA의 생성량이 2 mg L-1 이하의 낮은 수준을 유지하였다. 그러나 생육이 최대인 배양 24시간에는 IAA가 5.9 mg L-1 이상으로 급격히 증가하였으며 또한, pH 변화는 배양 24시간 이전까지는 pH6.5 수준을 유지하다가 IAA 생성량이 증가하는 24시간 이후부터는 pH 6.0 이하로 낮아지는 결과를 나타냄으로 IAA 생성과 pH 변화와의 관련성을 예측하게 하였다(Fig.4). 최적배양 온도 및 pH 확인 실험에서는 35℃와 pH 7.
  • 대전광역시 유성구 원성동 지역 느타리 버섯 재배 농가 부근에서 토양을 채취하여 Salkowski 시약 첨가 배지를 이용하여 auxin 생성능이 뛰어난 세균 A-1 균주를 분리하였다. TLC 및 HPLC 분석을 통해 분리균이 생성한 IAA 농도를 확인한 결과, 0.
  • 표준곡선의 작성은 Sigma사의 IAA를 10, 30, 50, 70 mg L-1 농도로 methanol 에 첨가 후 535 nm에서 측정하였다. 또한, 선발균의 배양조건과 auxin 생성능을 비교하기 위하여 35℃에서 24시간 배양하면서 배양기간에 따른 균주의 생장, IAA 생성 유도 전구물질인 L-tryptophan의 최적농도, IAA 생성 및 최종pH를 측정하였다.
  • 0)에 접종하여 30℃, 170 rpm에서 24시간 이상 진탕 배양한 배양액을 4℃, 4000 rpm, 15분간 원심분리하여 균체를 침강시킨 후 상등액을 회수하였다. 배양 상등액과 Salkowski 시약을 1:3 (배양 상등액: 시약)의 비율로 혼합하여 30분간 암반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 535 nm에서 흡광도를 측정하여 선발균들의 auxin 생성능을 확인하였다. 표준곡선의 작성은 Sigma사의 IAA를 10, 30, 50, 70 mg L-1 농도로 methanol 에 첨가 후 535 nm에서 측정하였다.
  • 본 실험에서는 토양으로부터 PGPR 관련 미생물 중 식물생장촉진물질인 auxin 생산능이 우수한 균주를 분리한 후 분리균의 동정 및 배양조건별 auxin 생산성을 조사하였고, 또한 Bio assay 실험법을 이용한 재배실험을 통해 auxin의 식물 생육촉진효과를 검토하였다.
  • 분리한 Auxin 생성균 A-1과 F-2가 작물의 뿌리 생육에 미치는 효과를 검토하기 위하여 녹두묘와 상추묘를 공시작물로 이용하여 수경법과 pot 재배실험을 통한 분리균배양액의 접종효과를 조사하였다.
  • 상기 ‘녹두발근생검법’에 따라 얻어진 녹두 자엽의 하배축을 멸균된 상토 (밭흙: 버미큘라이트: 상토= 2:1:1)에 선발균주의 배양 상등액을 100배 희석하여 3일에 한번 씩 20일 동안 관주한 후 형성된 발근수와 발근 길이를 측정하여 뿌리발근 효과를 조사하였다.
  • 선발된 균주들의 auxin 생성능을 TLC 분석을 통해 확인하기 위하여 배양 상등액을 염산으로 pH 2.8까지 산성화 시킨 후, 2배의 cold ethyl acetate로 분획추출 하였다. 이 중 옥신성분이 함유된 ether층을 회수하여 감암증류장치를 이용하여 농축한 후, 얻어진 잔사를 methanol 2 mL에 녹여 TLC 분석을 위한 시료로 사용하였다.
  • 8까지 산성화 시킨 후, 2배의 cold ethyl acetate로 분획추출 하였다. 이 중 옥신성분이 함유된 ether층을 회수하여 감암증류장치를 이용하여 농축한 후, 얻어진 잔사를 methanol 2 mL에 녹여 TLC 분석을 위한 시료로 사용하였다. TLC의 전개용매로는 1-propanol: NH4OH: H2O(6:3:1) 혼합액을 사용하였으며, 발색시약은 증류수 100 mL, 농 염산150 mL, p-dimethylaminobenzaldehyde 0.
  • 자라고 있는 상추 묘목을 구입해 멸균된 상토 (밭흙: 버미큘라이트: 상토= 2:1:1)에 선발균주의 배양 상등액을 100배 희석하여 3일에 한번씩 약 한달 동안 관주한 후 형성된 발근 길이와 뿌리의 무게를 측정하여 뿌리발근 효과를 조사하였다.
  • 다기능성 PGPR 생성균의 분리를 위해 대전광역시 유성구 원성동 느타리 버섯 재배 농가 부근에서 토양을 채취하였다. 채취한 토양 1g을 멸균 생리식염수 99 mL에 첨가하여 진탕 배양기에서 170 rpm으로 30분간 진탕한 후 단계적 희석 평판법에 의해 각 희석액을 auxin 생성균 분리용 배지인 0.1% L-tryptophan이 첨가된 R2A 고체배지에 도말하여 30℃에서 배양하였다. 고체배지에서 순수 분리 된 colony를 auxin 기본배지에 tooth-picking 한 후 Salkowski 시약을 분산시켜 외관상 colony 주변에 분홍색을 띄는 균주들을 auxin 생성균주로 1차 선발하였다.
  • 최종선발균 A-1을 0.1% L-tryptophan이 함유된 R2A broth (pH 7)배지에 배양하면서 auxin 생성을 위한 최적 배양조건을 검토하였다. 분리균 1%를 seed 접종 후 35℃에서 배양 시 균의 생육은 약 24시간에 대수기 후기에 도달하였으며, 생육초기에는 IAA의 생성량이 2 mg L-1 이하의 낮은 수준을 유지하였다.
  • 추출한 ether층 methanol 수용액 내의 IAA 함량을 HPLC 정량분석을 통해 확인하였다. 사용한 분석기기는 JASCO사의 PU 980이고, UV detector는 JASCO 사의PU 975로 285 nm에서 측정하였고, 컬럼은 Luna 5U C18(250×4.
  • 배양 상등액과 Salkowski 시약을 1:3 (배양 상등액: 시약)의 비율로 혼합하여 30분간 암반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 535 nm에서 흡광도를 측정하여 선발균들의 auxin 생성능을 확인하였다. 표준곡선의 작성은 Sigma사의 IAA를 10, 30, 50, 70 mg L-1 농도로 methanol 에 첨가 후 535 nm에서 측정하였다. 또한, 선발균의 배양조건과 auxin 생성능을 비교하기 위하여 35℃에서 24시간 배양하면서 배양기간에 따른 균주의 생장, IAA 생성 유도 전구물질인 L-tryptophan의 최적농도, IAA 생성 및 최종pH를 측정하였다.

대상 데이터

  • 이 중 옥신성분이 함유된 ether층을 회수하여 감암증류장치를 이용하여 농축한 후, 얻어진 잔사를 methanol 2 mL에 녹여 TLC 분석을 위한 시료로 사용하였다. TLC의 전개용매로는 1-propanol: NH4OH: H2O(6:3:1) 혼합액을 사용하였으며, 발색시약은 증류수 100 mL, 농 염산150 mL, p-dimethylaminobenzaldehyde 0.7 g을 용해한 Ehrlich 시약(Lim et al., 1995)을 사용하였다.
  • 느타리 버섯 재배농가 토양으로부터 순수 분리된 각 균주들을 auxin 생성균 분리용 배지인 0.1% L-tryptophan이 첨가된 R2A agar 배지에 tooth-picking하여 Salkowski시약과 반응시켜 colony 주변에 붉은색을 형성하는 8개의 균을 1차 선발하였다. 고체 배지 상에서 양성반응을 보인1차 선발균주들을 0.
  • 다기능성 PGPR 생성균의 분리를 위해 대전광역시 유성구 원성동 느타리 버섯 재배 농가 부근에서 토양을 채취하였다. 채취한 토양 1g을 멸균 생리식염수 99 mL에 첨가하여 진탕 배양기에서 170 rpm으로 30분간 진탕한 후 단계적 희석 평판법에 의해 각 희석액을 auxin 생성균 분리용 배지인 0.
  • 사용한 분석기기는 JASCO사의 PU 980이고, UV detector는 JASCO 사의PU 975로 285 nm에서 측정하였고, 컬럼은 Luna 5U C18(250×4.60 mm), 이동상은 MeOH : H2O(5:5)를 사용하였으며, 용출속도는 1 mL min-1 였다(Bak et al., 2010).

이론/모형

  • 본 균주의 생리학적 특성은 Gram 음성 세균의 동정에 사용되는 API 20NE kit (Bio Merieux)를 제조회사의 시행방법에 따라 사용하였다. DNA-DNA hybridization 실험은 photobiotin-labelled DNA probe 와 micro-dilution wells을 이용하여(Ezaki et al., 1989)에 의해 기술된 방법에 의해 수행하였다. 또한 16S rRNA 염기서열 해석 및 계통수 작성을 위하여 16S rRNA의 부분서열의 상동성은 DDBJ/EMBL/GenBank database의 Blast program을 이용하여 분석하였으며, 각 염기서열의 alignment는 Cluster X program package(version 1.
  • , 1989)에 의해 기술된 방법에 의해 수행하였다. 또한 16S rRNA 염기서열 해석 및 계통수 작성을 위하여 16S rRNA의 부분서열의 상동성은 DDBJ/EMBL/GenBank database의 Blast program을 이용하여 분석하였으며, 각 염기서열의 alignment는 Cluster X program package(version 1.8)를 이용하여 정렬하였고, 계통도의 작성은 근린결합법에 의거하여 결정되었다.
  • 본 균주의 생리학적 특성은 Gram 음성 세균의 동정에 사용되는 API 20NE kit (Bio Merieux)를 제조회사의 시행방법에 따라 사용하였다. DNA-DNA hybridization 실험은 photobiotin-labelled DNA probe 와 micro-dilution wells을 이용하여(Ezaki et al.
  • 선발된 auxin 생성균주의 생육촉진효과를 검토하기 위하여 auxin 생성검정방법으로 많이 활용되고 있는 녹두발근검정법 (mungbean adventitious root induction method)을 이용하여 auxin 호르몬의 주요 기능 중 하나인 뿌리발근 촉진효과를 조사하였다. 녹두종자를 0.
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질의응답

핵심어 질문 논문에서 추출한 답변
근권미생물은 무엇인가? 근권미생물(rhizosphere microorganisms)들은 토양병 해충을 억제하고 식물 뿌리의 활력뿐만 아니라 식물의 생육에 중요한 영향을 미치는 토양미생물로 식물의 생육을 촉진하는 미생물을 통칭하여 식물생육촉진근권세균(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)이라 한다. Kloepper 등(1980)은 PGPR 미생물들의 존재를 발표하였고, 이러한 PGPR에 의해 작물의 수확량이 증대 되고 토양 병을 방제할 수 있다는 연구결과들이 보고되어 이들 미생물에 대한 관심이 높아졌다.
PGPR 미생물을 사용해서 어떤 효과를 얻을 수 있는가? 근권미생물(rhizosphere microorganisms)들은 토양병 해충을 억제하고 식물 뿌리의 활력뿐만 아니라 식물의 생육에 중요한 영향을 미치는 토양미생물로 식물의 생육을 촉진하는 미생물을 통칭하여 식물생육촉진근권세균(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)이라 한다. Kloepper 등(1980)은 PGPR 미생물들의 존재를 발표하였고, 이러한 PGPR에 의해 작물의 수확량이 증대 되고 토양 병을 방제할 수 있다는 연구결과들이 보고되어 이들 미생물에 대한 관심이 높아졌다. PGPR 균주들의 토양 내에서의 기능은 β-1,3-glucanase, chitinase, cellulase와 같은 식물병원성 진균의 외벽을 가수분해하는 효소를 생성하여 병원성 곰팡이의 병해억제 기능 (Jung et al.
대전광역시 유성구 원성동 지역 느타리 버섯 재배 농가 부근 토양에서 분리해낸 세균 A-1의 종은 무엇으로 밝혀졌는가? 6 mg L-1이었다. 생리적 특성 및 계통학적 특성분석을 통해 분리균은 Gram 음성 간균인 Ochrobactrum anthropi A-1로 동정되었다. 분리균에 의한 식물생육촉진 효과를 조사하기 위하여 수경재배 및 pot재배를 통한 녹두발근 생검법과 상추발근 생검법을 수행한 결과, O.
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