[논문]HvIRIP 과발현 유채 형질전환체의 내한성 증진

노경희; 박종석; 강한철; 김종범; 장영석; 김광수; 이한길

doi:10.3839/jabc.2015.051

HvIRIP 과발현 유채 형질전환체의 내한성 증진
Overexpression of Ice Recrystallization Inhibition Protein (HvIRIP) from Barley Enhances Cold Tolerance in Transgenic rapeseed plants 원문보기

Journal of applied biological chemistry, v.58 no.4, 2015년, pp.325 - 332

노경희 (Department of Agricultural Biotechnology, National Academy of Agricultural Science, RDA) , 박종석 (Department of Agricultural Biotechnology, National Academy of Agricultural Science, RDA) , 강한철 (Department of Agricultural Biotechnology, National Academy of Agricultural Science, RDA) , 김종범 (Department of Agricultural Biotechnology, National Academy of Agricultural Science, RDA) , 장영석 (Bioenergy Crop Research Institute, National Institute of Crop Science, RDA) , 김광수 (Bioenergy Crop Research Institute, National Institute of Crop Science, RDA) , 이한길 (Department of Biological Sciences, Chungnam National University)

초록
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유채는 월동작물로 내한성이 약해 남부지역에서만 재배가 가능하다. 따라서 재배면적 확대 및 안정적 생산성 확보를 위해 내한성 증진 품종 육성이 절실하다. 본 연구에서는 유채의 내한성을 증진시키기 위해 보리에서 유래한 HvIRIP 유전자를 CaMV35S 프로모터 조절하에서 전신발현되도록 운반체를 제작하였고, 아그로박테리움을 이용하여 유채에 형질전환하였다. Southern 분석을 통해 HvIRIP 유전자가 유채 Genome 안으로 전이 되었음을 확인하였다. 또한 Northern 분석을 통해 $4^{\circ}C$에서 2주간 처리된 유묘에서 HvIRIP 유전자의 발현이 크게 증대되는 것을 알 수 있었다. 본엽 3-4매 전개 유채 형질전환체를 영하 $5^{\circ}C$에서 2일간 저온에 노출한 후 회복여부를 조사한 결과, 대조구는 회복하지 못하고 죽은 반면, 형질전환체는 회복이 정상적으로 이루어졌다. 또한 저온스트레스가 진행되는 동안에 스트레스를 극복하는데 필요한 Proline 함량이 형질전환체에서 크게 증대되는 것이 관찰되었다. 이 외에도 저온스트레스 과정 중에 생성되는 활성산소의 독성을 감소시키는 항산화제 효소인 CAT, SOD 그리고 ADH 활성을 측정한 결과, 대조구에 비해 형질전환체에서 그 함량이 현저히 증가됨을 알 수 있었다. 따라서 이러한 결과를 통해 HvIRIP 유전자가 함유된 유채 형질전환체의 내한성이 증진되었음을 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Rapeseed (Brassica napus) is now the second largest oilseed crop after soybean. Cold temperature tolerance is an important agronomic trait in winter rapeseed that determines the plant's ability to control below freezing temperatures. To improve cold tolerance of rapeseed plants, an expression vector containing an Barley Ice recrystallization inhibition protein (HvIRIP) cDNA driven by a cauliflower mosaic virus 35S promoter was transferred into rapeseed plants. Transgenic expression of HvIRIP was proved by southern- and northern-blot analyses. The level of freezing tolerance of transgenic $T_3$ plants was found to be significantly greater than that of wild-type rapeseed plants by freezing assay. Proline accumulation during cold stress was also highly induced in the transgenic rapeseed plants. The transgenic plants exhibited considerable tolerance against oxidative damage induced by cold stress. Our results indicated that heterologous HvIRIP expression in transgenic rapeseed plants may induce several oxidative-stress responsive genes to protect from cold stress.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 실험에서는 유채 형질전환체에서 HvIRIP 유전자의 전이 및 발현을 확인하였다. 그리고 Freezing assay를 통해 유채 형질전환체가 결빙 후 정상적으로 회복되는 것을 관찰하였다.

제안 방법

영하 5℃에서 2일간 처리 한 후 1시간에 1℃씩 온도를 올리며 4℃까지 온도를 조절하였다. 4℃에서 1일간 적응시킨 후 온실로 옮겨 생존여부를 관찰하였다. 이 때, 4℃처리는 Cold room (15 m² 크기)에서 실시되었고, Freezing 처리는 온도조절을 프로그래밍화 할 수 있는 Phytotron Chamber(Dasol Scientific co.
DFCI Gene Index Database에 등록되어 있는 TC131871 클론의 염기서열정보를 이용하여 HvIRIP 유전자의 Open reading frame을 분리하여 858 bp에 해당하는 염기서열을 GenBank에 Accetion number EU887261를 부여받아 등록하였다. 분리한 HvIRIP 유전자는 CaMV35S 프로모터의 조절하에서 전신에서 발현이 되도록 클로닝되었으며, Phosphinothricin에 저항성을 갖는 Bar 유전자가 함께 발현되는 식물형질전환용 운반체를 제작하였다(Fig.
Freezing assay 를 하기 위해서 적정 온도 조건을 알아본 결과 영하 5℃에서 대조구가 모두 죽는것이 관찰되었다(data not shown). Freezing assay는 본엽이 4매정도 전개된 유묘를 4가 유지되는 저온순화실에서 2주간 전처리 한 후, 영하 5에서 2일간 배양한 후 다시 4로 조절하여 1일간 후처리 한 후, 온실로 옮겨 회복 여부를 관찰하였다(Fig. 6A). 이 때, 급격한 온도 변화를 막기 위해 1시간에 1씩 온도가 변하도록 배양기를 프로그래밍하였다.
HvIRIP 유전자 발현에 의한 유채 형질전환체의 내한성 증진 여부를 알아보기 위해 저온처리 후 생존 유무를 관찰하였다(Fig. 6). Freezing assay 를 하기 위해서 적정 온도 조건을 알아본 결과 영하 5℃에서 대조구가 모두 죽는것이 관찰되었다(data not shown).
그리고 cDNA synthesis kit (Takara, Japan)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. HvIRIP 유전자는 Dana-Farber Cancer Institute (DFCI) Gene Index Databases에 있는 TC131871 클론의 염기서열정보를 이용하여 Polymerase chain reaction (PCR)반응을 통해 분리하였다. 이때 PCR 50 µL 반응액에는 보리 cDNA (영하 10℃에서 30분간 처리) 50 ng, Taq DNA polymerase(Takara) 5 unit, Forword primer 1 pmole, Reverse primer 1 pmole, dNTP 등 0.
5% (W/V) Formaldehyde 아가로스 젤에서 전기영동하였다. Sodium citrate (20X SSC)버퍼를 이용하여 RNA를 나일론 막(Amersham)에 옮긴 다음 방사선 동위원소로 표지된 HvIRIP 유전자를 Probe로 이용하여 혼성화 반응을 65℃에서 하였다.
유채 형질전환은 기존에 보고된 방법(Roh 등, 2011)에 준하여 실시하였다. 간략하게 서술하자면, 자엽 부착 잎자루(Cotyledonary petiole)를 절단하여 식물형질전환용 운반체가 들어간 아그로박테리움 EHA105 균주 농도가 Optical Distance 값이 0.5가 되도록 조절한 후 접종하였다. 2일간의 공동배양(25±1℃, 암배양)을 거쳐 선발배지에서 캘러스를 거쳐 유기된 재분화된 줄기는 MS기본배지로 옮겨져 뿌리를 유기하였다.
보리(Hordeum vulgare)의 어린 유묘를 저온(4℃ 또는 영하 10℃)에서 시간별로 처리된 잎을 채취하여 RNeasy mini kit (Quagene, USA)을 이용하여 total RNA를 분리하였다. 그리고 cDNA synthesis kit (Takara, Japan)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. HvIRIP 유전자는 Dana-Farber Cancer Institute (DFCI) Gene Index Databases에 있는 TC131871 클론의 염기서열정보를 이용하여 Polymerase chain reaction (PCR)반응을 통해 분리하였다.
멸균된 종자는 MS배지(Murashige와 Skoog, 1962)에 치상하였고, 재료는 25±1℃가 유지되는 배양실에서 3일간 암배양 한 후 2일간 명배양 조건에서 육성하였다.
따라서 Proline 함량은 스트레스 저항성 정도를 측정하는 간접적 지표로 이용되어 오고 있다. 본 실험에서는 식물체가 저온 스트레스를 받는 시간에 따라 Proline 함량 변화를 살펴보았다(Fig. 7). 형질전환체에서의 Proline 함량 변화를 살펴보면 저온에서 1일 경과할 때까지는 큰 변화가 없다가 2일째부터 Proline 함량이 증가되기 시작하여 6일째에는 Proline 함량이 급격하게 증가되었다.
항산화 효소는 이러한 활성산소의 독성을 감소시켜 결과적으로 세포를 보호하는 기능을 한다고 알려져 있다(Kankofer, 2001). 본 실험에서는 저온처리기간에 따른 형질전환체내 항산화 효소인 CAT와 SOD의 활성과 ADH 활성을 측정하였다(Fig. 9). 저온처리에 따른 CAT 활성을 측정한 결과(Fig.
본 연구에서는 국내 육성 동보리에서 HvIRIP를 분리하여 전신발현 CaMV35S 프로모터 조절하에 발현될 수 있도록 식물형 질전환용 운반체를 제작하였고 아그로박테리움을 이용하여 유채에 형질전환 하였다. 여기에서 생산된 유채 형질전환체를 대상으로 Freezing assay 및 저온 스트레스 관련 효소 활성 검정실험 등을 통해 HvIRIP 유전자가 유채의 내한성을 증진시키는 것을 확인하였다.
본엽 4매 전개시 유묘를 4℃에서 2주간 전처리를 하고 1시간에 1℃씩 온도를 떨어뜨리며 영하 5℃까지 온도를 조절하였다. 영하 5℃에서 2일간 처리 한 후 1시간에 1℃씩 온도를 올리며 4℃까지 온도를 조절하였다.
본엽 6매 전개시 유묘를 온도처리별로 시료 채취하였으며, 시료 0.1 g을 액체질소로 잘 간 후 효소 활성을 측정하였다. Catalase (CAT) 활성은 Catalase Assay Kit(Calbiochem, Germany)을 이용하여 측정하였다.
본엽 6매 전개시 유묘를 온도처리별로 시료 채취하였으며, 총당 함량은 Anthrone을 이용하여 측정했다(Yemm과 Willis, 1954; Chow와 Landhusser, 2004). 시료 0.
DFCI Gene Index Database에 등록되어 있는 TC131871 클론의 염기서열정보를 이용하여 HvIRIP 유전자의 Open reading frame을 분리하여 858 bp에 해당하는 염기서열을 GenBank에 Accetion number EU887261를 부여받아 등록하였다. 분리한 HvIRIP 유전자는 CaMV35S 프로모터의 조절하에서 전신에서 발현이 되도록 클로닝되었으며, Phosphinothricin에 저항성을 갖는 Bar 유전자가 함께 발현되는 식물형질전환용 운반체를 제작하였다(Fig.2).
아그로박테리움을 이용하여 HvIRIP 유전자가 유채 게놈 DNA 안으로 들어가 새로운 형질을 획득할 수 있도록 하기 위해 형질전환 실험을 실시하였다(Fig. 3). 균 접종이 끝난 잎자루가 달린 자엽은 선발배지에서 2주정도 경과하면 하얗게 말라 죽어가면서 상처가 난 잎자루 부위의 끝에서 초록색의 캘러스가 발생하기 시작하는 것이 관찰되었고(Fig.
유채 형질전환체 유묘(본엽 5-6매 전개)를 저온처리(4℃ 및 영하 −3℃)를 한 후 잎 0.1g을 갈아 Trizol (Invitogen, USA)을 이용하여 total RNA를 분리하였다.
유채 형질전환체 잎 1g을 갈아 Genomic DNA Extraction Kit (Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하여 제한효소 XbaI으로 절단한 후 0.8% 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 알칼리 전이방법으로 DNA를 나일론 막(Amersham, UK)에 옮긴 다음 방사선 동위원소로 표지된 HvIRIP 유전자를 Probe로 이용하여 혼성화 반응을 65℃에서 하였다(Roh 등, 2011).
유채 형질전환체의 게놈 DNA 안에 존재하는 HvIRIP 유전자의 copy 수를 알아보기 위해 HvIRIP 유전자를 탐침(probe)으로 사용하여 Southern 분석을 하였다(Fig. 4). HvIRIP 유전자가 들어간 형질전환체는 5개체(1번-5번)임을 확인하였다.
6A). 이 때, 급격한 온도 변화를 막기 위해 1시간에 1씩 온도가 변하도록 배양기를 프로그래밍하였다. Freezing 처리 후 1주일이 경과했을 때 대조구가 죽은 것에 비해 형질전환체 3개체 모두 생존하는 것이 관찰되었다(Fig.
얻어진 DNA 단편은 TOPO® TA Cloning Kit(Invitrogen, USA)를 이용하여 TA vector에 들어가게 한 후, Sequencing을 거쳐 858 bp에 해당하는 HvIRIP유전자 염기서열을 획득하여 GenBank에 등록번호 EU887261를 부여 받아 등록하였다. 이렇게 얻어진 HvIRIP 유전자는 NcoI과 NotI 제한효소인식 염기서열이 부착된 후, 이 두개의 제한효소를 이용하여 CaMV35S 프로모터의 조절을 받도록 클로닝 되었다. 최종적으로 식물형질전환용 운반체를 만들기 위해 HvIRIP 유전자 expression cassette는 EcoRI과 XbaI을 이용하여 pCAMBIA3300 벡터내로 클로닝되었다.
3C). 잎이 커지고 줄기 정단부의 생장점 부위가 명확하게 보이면 줄기를 잘라서 MS 배지에 옮겨 뿌리를 유기하여 완전한 재분화 식물체를 생산한 후(Fig. 3D), 외부 습도에 적응할 수 있도록 순화과정을 거쳐 포트로 이식되어 온실에서 재배하였다(Fig. 3E). 형질전환된 유채 식물체는 온실 이식 후 1주일 후에 4℃가 유지되고 광이 16시간 조사되는 저온배양실로 옮겨져 6주간 춘화처리과정을 거친 후 온실에서 재배되었다.
ADH는 알코올과 알데히드 또는 알코올과 케톤을 상호교환하는 역할을 하는데, 이는 세포내 독성을 갖는 알코올을 분해함으로써 세포활력에 영향을 주는 효소로 잘 알려져 있다(Christie 등, 1991; Jarillo 등, 1993). 저온스트레스환경하에서 식물 세포내 발생하는 알코올을 비독성으로 분해하는 ADH 활성을 조사하였다(Fig. 9C). 대조구와 형질전환체 모두에서 저온스트레스가 시작되고 3일이 경과할 때까지는 ADH활성에 변화가 없었으며, 저온스트레스 7일째에 형질전환체에서의 ADH 활성이 대조구에 비해 증가하는 것을 알 수 있었다.

대상 데이터

4). HvIRIP 유전자가 들어간 형질전환체는 5개체(1번-5번)임을 확인하였다. 이 중 형질전환체 1번은 약 5개의 HvIRIP 유전자 들어간 multi-copy line이었고, 형질전환체 2번은 적어도 2개의 HvIRIP 유전자가 들어간 것으로 보여지며, 형질전환체 3번과 5번은 동일한 캘러스에서 유래한 것으로 보여지며, HvIRIP 유전자가 2 copy 존재하는데, 이 중 1개는 크기가 2 kb로, 이는 형질전환 운반체의 Border sequence 안쪽에 위치해 있고 식물체 게놈 DNA 안으로 이동해 들어가는 부위인 4 kb보다 작다.
농촌진흥청 국립식량과학원 바이오에너지작물센타에서 육성한 고정종(OP; Open pollination)인 ‘영산유채’를 분양받아 실험에 사용하였다.
보리(Hordeum vulgare)의 어린 유묘를 저온(4℃ 또는 영하 10℃)에서 시간별로 처리된 잎을 채취하여 RNeasy mini kit (Quagene, USA)을 이용하여 total RNA를 분리하였다. 그리고 cDNA synthesis kit (Takara, Japan)을 이용하여 cDNA를 합성하였다.
얻어진 DNA 단편은 TOPO® TA Cloning Kit(Invitrogen, USA)를 이용하여 TA vector에 들어가게 한 후, Sequencing을 거쳐 858 bp에 해당하는 HvIRIP유전자 염기서열을 획득하여 GenBank에 등록번호 EU887261를 부여 받아 등록하였다.

이론/모형

이때, 표준물질로 bovine erythrocyte SOD (Cu/Zn)을 사용하였다. Alcohol dehydrogenase (ADH) 활성은 ADH assay kit (BioViosn)를 이용하여 측정하였다. 이때, 표준물질로 Nicotinamide adenine dinucleotide를 사용하였다.
1 g을 액체질소로 잘 간 후 효소 활성을 측정하였다. Catalase (CAT) 활성은 Catalase Assay Kit(Calbiochem, Germany)을 이용하여 측정하였다. 이때, 표준물질로 Formaldehydes를 사용하였다.
이때, 표준물질로 Formaldehydes를 사용하였다. Superoxide dismutase (SOD)활성은 SOD assay kit (BioViosn, USA)를 이용하여 측정하였다. 이때, 표준물질로 bovine erythrocyte SOD (Cu/Zn)을 사용하였다.
본엽 6매 전개시 유묘를 온도처리별로 시료 채취하였으며, Proline 함량은 Colorimetric assay 방법에 의해 측정했다(Bates, 1973). 시료 0.
멸균된 종자는 MS배지(Murashige와 Skoog, 1962)에 치상하였고, 재료는 25±1℃가 유지되는 배양실에서 3일간 암배양 한 후 2일간 명배양 조건에서 육성하였다. 유채 형질전환은 기존에 보고된 방법(Roh 등, 2011)에 준하여 실시하였다. 간략하게 서술하자면, 자엽 부착 잎자루(Cotyledonary petiole)를 절단하여 식물형질전환용 운반체가 들어간 아그로박테리움 EHA105 균주 농도가 Optical Distance 값이 0.

성능/효과

6). Freezing assay 를 하기 위해서 적정 온도 조건을 알아본 결과 영하 5℃에서 대조구가 모두 죽는것이 관찰되었다(data not shown). Freezing assay는 본엽이 4매정도 전개된 유묘를 4가 유지되는 저온순화실에서 2주간 전처리 한 후, 영하 5에서 2일간 배양한 후 다시 4로 조절하여 1일간 후처리 한 후, 온실로 옮겨 회복 여부를 관찰하였다(Fig.
이 때, 급격한 온도 변화를 막기 위해 1시간에 1씩 온도가 변하도록 배양기를 프로그래밍하였다. Freezing 처리 후 1주일이 경과했을 때 대조구가 죽은 것에 비해 형질전환체 3개체 모두 생존하는 것이 관찰되었다(Fig. 6B). 그리고 Freezing 처리 후 4주가 경과했을 때 생존한 형질전환체에서 추대가 올라오는 것을 볼 수 있었고, 심지어 화아분화가 정상적으로 이루어져 개화가 되는 것이 관찰되었다(Fig.
3). 균 접종이 끝난 잎자루가 달린 자엽은 선발배지에서 2주정도 경과하면 하얗게 말라 죽어가면서 상처가 난 잎자루 부위의 끝에서 초록색의 캘러스가 발생하기 시작하는 것이 관찰되었고(Fig. 3A, B), 2주마다 계대배양을 하면서 초록색의 캘러스가 점점 커지면서 겉이 단단한 배발생 캘러스(embryogenic callus)가 형성되고, 여기에서 줄기가 유기되었다(Fig. 3C). 잎이 커지고 줄기 정단부의 생장점 부위가 명확하게 보이면 줄기를 잘라서 MS 배지에 옮겨 뿌리를 유기하여 완전한 재분화 식물체를 생산한 후(Fig.
본 실험에서는 유채 형질전환체에서 HvIRIP 유전자의 전이 및 발현을 확인하였다. 그리고 Freezing assay를 통해 유채 형질전환체가 결빙 후 정상적으로 회복되는 것을 관찰하였다. 또한, Northern 분석을 통해 유채 형질전환체에서 HvIRIP 유전자가 저온(4℃) 처리시 강하게 발현되는 것을 알 수 있었다.
6B). 그리고 Freezing 처리 후 4주가 경과했을 때 생존한 형질전환체에서 추대가 올라오는 것을 볼 수 있었고, 심지어 화아분화가 정상적으로 이루어져 개화가 되는 것이 관찰되었다(Fig. 6C). 이 결과는 HvIRIP 유전자가 유채 형질전환체의 내한성을 증진시킨다는 것을 보여준다.
8). 대조구와 형질전환체 모두 저온 처리가 길어질수록 총당함량이 증가되었으며, 저온처리가 2일이 경과될 때까지는 대조구와 형질전환체간의 총당함량의 차이가 없는 것으로 보여진 반면, 저온처리가 3일 경과되면서부터 형질전환체의 총당함량이 대조구보다 증가되는 것을 보였고, 저온처리 6일째에는 형질전환체의 총당함량이 대조구의 총당함량 보다 유의하게 증가되는 것이 관찰되었다. 본 실험을 통해 얻은 연구결과는 기 보고된 연구결과(Strauss와 Hauser, 1986; Hill 등, 2003; Gusta 등, 2004; Klotke 등, 2004; Couee 등, 2006; Livingston 등, 2006; Rolland 등, 2006; Zhu 등, 2006)와 마찬가지로 저온처리가 지속될 때 식물세포는 스스로를 저온스트레스에서 보호하기 위해서 당을 더 축적하는 것을 알 수 있었고, 당함량과 저온저항성과 밀접한 관계가 있음을 알 수 있었다.
9C). 대조구와 형질전환체 모두에서 저온스트레스가 시작되고 3일이 경과할 때까지는 ADH활성에 변화가 없었으며, 저온스트레스 7일째에 형질전환체에서의 ADH 활성이 대조구에 비해 증가하는 것을 알 수 있었다. 이러한 연구결과를 통해 HvIRI 유전자는 형질전환체의 저온저항성을 향상시켜 결과적으로 저온스트레스가 발생할 때 항산화효소의 활성을 높이고 독성 물질을 분해시키는 ADH 활성을 높여 세포 활력을 유지시키는 것으로 사료된다.
따라서 우리는 저온(4℃)에 장시간 노출되었을 때 HvIRIP의 유전자가 저온스트레스에 어떻게 반응하는지를 살펴본 결과, 대조구에 비해 형질전환체에서 스트레스 저항성에 관여하는 Proline 함량이 급격히 증가되었고, ROS 효소 활성이 시간이 지날수록 점점 증가되는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과들로부터 보리 유래 HvIRIP 유전자가 유채 Genome으로 전이된 형질전환체에서 저온에 장시간 노출되는 과정에서 내한성을 증진시키는 것을 알 수 있었다.
그리고 Freezing assay를 통해 유채 형질전환체가 결빙 후 정상적으로 회복되는 것을 관찰하였다. 또한, Northern 분석을 통해 유채 형질전환체에서 HvIRIP 유전자가 저온(4℃) 처리시 강하게 발현되는 것을 알 수 있었다.
보리 유묘의 저온처리에 따른 HvIRIP 유전자의 발현양상을 살펴본 결과, 4℃에서 24시간 처리하였을 때 HvIRIP 유전자의 발현이 시작되어 처리시간이 길어질수록 발현양이 점차 증가하는 것을 알 수 있었으며, 흥미롭게도 영하 10℃에서 30분간 처리하였을 때 발현양이 가장 많았고, 이 후에는 점차 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 1). 이결과는 HvIRIP 유전자가 저온과 밀접한 관계가 있음을 보여주며, 특히 결빙이 발생하는 영하의 온도에서도 유전자가 지속적으로 발현됨을 있었다.
본 실험에서도 보리의 HvIRIP 유전자가 저온(4℃)에서 처리기간이 길어짐에 따라 유전자 발현이 증가하는 것이 관찰되었으며, 유채 형질전환체내에서 HvIRIP 유전자가 저온(4℃)에서 2주간 처리되었을 때 유전자가 매우 강하게 발현되는 것이 관찰된 반면, 저온 순화과정 없이 바로 영하(−3℃)로 처리된 잎에서는 HvIRIP 유전자의 발현양이 상대적으로 매우 적었다.
대조구와 형질전환체 모두 저온 처리가 길어질수록 총당함량이 증가되었으며, 저온처리가 2일이 경과될 때까지는 대조구와 형질전환체간의 총당함량의 차이가 없는 것으로 보여진 반면, 저온처리가 3일 경과되면서부터 형질전환체의 총당함량이 대조구보다 증가되는 것을 보였고, 저온처리 6일째에는 형질전환체의 총당함량이 대조구의 총당함량 보다 유의하게 증가되는 것이 관찰되었다. 본 실험을 통해 얻은 연구결과는 기 보고된 연구결과(Strauss와 Hauser, 1986; Hill 등, 2003; Gusta 등, 2004; Klotke 등, 2004; Couee 등, 2006; Livingston 등, 2006; Rolland 등, 2006; Zhu 등, 2006)와 마찬가지로 저온처리가 지속될 때 식물세포는 스스로를 저온스트레스에서 보호하기 위해서 당을 더 축적하는 것을 알 수 있었고, 당함량과 저온저항성과 밀접한 관계가 있음을 알 수 있었다.
9A), 대조구와 형질전환체 모두 저온스트레스 초기부터 CAT 활성이 급격히 감소되는 것을 알 수 있었으며, 대조구의 경우 저온스트레스가 진행됨에 따라 CAT 활성이 계속 감소되어진 반면, 형질전환체에서는 저온스트레스 발생 24시간 이후부터는 CAT 활성이 꾸준이 일정수준을 유지하는 것을 알 수 있었다. 식물 세포내 존재하는 항산화 방어 기전 중 가장 최상위에 있는 SOD의 활성도를 측정한 결과(Fig.9B), 대조구와 형질전환체 모두 저온스트레스 초기에는 SOD 활성에 큰 변화가 없었으며, 저온스트레스 2일째부터 형질전환체에서의 SOD 활성은 오히려 증가하기 시작한 반면, 대조구에서는 저온스트레스가 지속됨에 따라 SOD 활성이 꾸준이 감소하는 경향을 보였다. ADH는 알코올과 알데히드 또는 알코올과 케톤을 상호교환하는 역할을 하는데, 이는 세포내 독성을 갖는 알코올을 분해함으로써 세포활력에 영향을 주는 효소로 잘 알려져 있다(Christie 등, 1991; Jarillo 등, 1993).
본 연구에서는 국내 육성 동보리에서 HvIRIP를 분리하여 전신발현 CaMV35S 프로모터 조절하에 발현될 수 있도록 식물형 질전환용 운반체를 제작하였고 아그로박테리움을 이용하여 유채에 형질전환 하였다. 여기에서 생산된 유채 형질전환체를 대상으로 Freezing assay 및 저온 스트레스 관련 효소 활성 검정실험 등을 통해 HvIRIP 유전자가 유채의 내한성을 증진시키는 것을 확인하였다.
6C). 이 결과는 HvIRIP 유전자가 유채 형질전환체의 내한성을 증진시킨다는 것을 보여준다.
한편, 대조구에서도 저온처리 시간이 길어짐에 따라 Proline 함량이 증가되었지만 형질전환체와 비교해보면 Proline 함량 변화의 폭이 매우 적다는 것을 알 수 있었다. 이 결과를 통해 형질전환체가 저온 스트레스를 잘 견딜 수 있게 저온 저항성이 향상되었음을 알 수 있었다. 지금까지 온도 스트레스에 대한 저항성이 증진된 식물체에서 스트레스 발생시 Proline 함량이 크게 증가되었다는 연구결과가 꾸준히 보고되었다(Xin과 Browse, 1998; Molinari 등, 2007; Lv 등, 2011).
1). 이결과는 HvIRIP 유전자가 저온과 밀접한 관계가 있음을 보여주며, 특히 결빙이 발생하는 영하의 온도에서도 유전자가 지속적으로 발현됨을 있었다. 이와 유사하게 Chew 등(2012)은 남극좀쇄풀(Deschampsia antarctica)의 내동성 메커니즘을 밝히는 과정에서 저온에 노출되는 시간이 길면 길수록 DaIRIP 유전자의 발현양이 크게 증가하는 것을 보고하였다.
대조구와 형질전환체 모두에서 저온스트레스가 시작되고 3일이 경과할 때까지는 ADH활성에 변화가 없었으며, 저온스트레스 7일째에 형질전환체에서의 ADH 활성이 대조구에 비해 증가하는 것을 알 수 있었다. 이러한 연구결과를 통해 HvIRI 유전자는 형질전환체의 저온저항성을 향상시켜 결과적으로 저온스트레스가 발생할 때 항산화효소의 활성을 높이고 독성 물질을 분해시키는 ADH 활성을 높여 세포 활력을 유지시키는 것으로 사료된다.
따라서 우리는 저온(4℃)에 장시간 노출되었을 때 HvIRIP의 유전자가 저온스트레스에 어떻게 반응하는지를 살펴본 결과, 대조구에 비해 형질전환체에서 스트레스 저항성에 관여하는 Proline 함량이 급격히 증가되었고, ROS 효소 활성이 시간이 지날수록 점점 증가되는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과들로부터 보리 유래 HvIRIP 유전자가 유채 Genome으로 전이된 형질전환체에서 저온에 장시간 노출되는 과정에서 내한성을 증진시키는 것을 알 수 있었다.
저온 처리에 따른 유채 형질전환체 잎에서의 HvIRIP 유전자의 발현양상을 살펴본 결과(Fig. 5), 4℃에서 2주간 처리구에서 HvIRIP 유전자의 발현양이 매우 크게 증대되었음을 알 수 있었고, 상온에서 저온 순화과정 없이 −3℃ 처리 되었을 때 HvIRIP 유전자의 발현양은 매우 적고, 처리 시간이 길어짐에 따라 HvIRIP 유전자의 발현양이 다소 증가하는 경향을 보였다.
9). 저온처리에 따른 CAT 활성을 측정한 결과(Fig. 9A), 대조구와 형질전환체 모두 저온스트레스 초기부터 CAT 활성이 급격히 감소되는 것을 알 수 있었으며, 대조구의 경우 저온스트레스가 진행됨에 따라 CAT 활성이 계속 감소되어진 반면, 형질전환체에서는 저온스트레스 발생 24시간 이후부터는 CAT 활성이 꾸준이 일정수준을 유지하는 것을 알 수 있었다. 식물 세포내 존재하는 항산화 방어 기전 중 가장 최상위에 있는 SOD의 활성도를 측정한 결과(Fig.
형질전환된 유채 식물체는 온실 이식 후 1주일 후에 4℃가 유지되고 광이 16시간 조사되는 저온배양실로 옮겨져 6주간 춘화처리과정을 거친 후 온실에서 재배되었다. 추대가 올라와 개화가 시작되고 결과적으로 종자 수확에 이르기까지 정상적인 생육을 보였다(Fig. 3F). 이렇게 생산된 유채 형질전환체는 유전자 고정 및 계통 육성을 위해 국립식량과학원 바이오에너지 작물센터내 유채 유전자변형식물체 전용 온실에서 후대 증식이 이루어졌다(Fig.
형질전환체에서의 Proline 함량 변화를 살펴보면 저온에서 1일 경과할 때까지는 큰 변화가 없다가 2일째부터 Proline 함량이 증가되기 시작하여 6일째에는 Proline 함량이 급격하게 증가되었다. 한편, 대조구에서도 저온처리 시간이 길어짐에 따라 Proline 함량이 증가되었지만 형질전환체와 비교해보면 Proline 함량 변화의 폭이 매우 적다는 것을 알 수 있었다. 이 결과를 통해 형질전환체가 저온 스트레스를 잘 견딜 수 있게 저온 저항성이 향상되었음을 알 수 있었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	국내에서 유채의 재배 실정은 어떠한가?	)는 배추과에 속하는 유지작물로서 종자 내 지방산 함량이 약 35−45%로 높고, 지방산 조성 중 바이오디젤 원료로 가장 좋은 올레인산(C18:1) 함량이 약 60−70% 함유되어 있는 고 올레인산 계통과 화장품 원료로 고부가성을 갖는 에루진산(C22:1) 함량이 약 40−50% 함유되어 있는 고 에루진산 계통이 있어 상업적 이용 가치가 매우 높은 작물이다(Booth와 Gunstone, 2004). 국내에서 유채는 추파재배로 이루어지고 있는데, 월동성이 약해 남부지역에서만 재배가 가능한 실정으로 재배면적을 확대하기 위해서는 내한성이 증진된 품종 개발이 필요하다.
	식물체내 동결현상을 이겨내기 위한 방법인 동결-회피와 동결-내성은 식물에서 어떻게 다른가?	식물체내 동결(freezing)현상을 이겨내기 위해서는 동결-회피(freeze-avoidance)하거나 동결-내성(freeze-tolerance)이 있어야 한다. 동결-회피식물은 주로 결빙방지물질을 생성해 빙점을 낮추거나 또는 얼 수 있는 물의 함량이 최소화 된 종자형태로 월동을 한다. 동결-내성식물은 세포밖(extracellular)에 형성된 얼음을 이겨내거나 또는 세포내(intracellular) 얼음이 형성되지 않도록하는 내동성을 가진다(Zamecnik과 Janacek, 1992). 최근에는 월동기 저온 순화과정에서 apoplast에 축적되는 특수 단백질인 결빙방지단백질(antifreezing proteins; AFPs)에 관한 연구가 활발히 진행 중이다(Atici와 Nalbantoğlu, 2003; Moffatt 등, 2006).
	유채란 무엇인가?	유채(Brassica napus L.)는 배추과에 속하는 유지작물로서 종자 내 지방산 함량이 약 35−45%로 높고, 지방산 조성 중 바이오디젤 원료로 가장 좋은 올레인산(C18:1) 함량이 약 60−70% 함유되어 있는 고 올레인산 계통과 화장품 원료로 고부가성을 갖는 에루진산(C22:1) 함량이 약 40−50% 함유되어 있는 고 에루진산 계통이 있어 상업적 이용 가치가 매우 높은 작물이다(Booth와 Gunstone, 2004). 국내에서 유채는 추파재배로 이루어지고 있는데, 월동성이 약해 남부지역에서만 재배가 가능한 실정으로 재배면적을 확대하기 위해서는 내한성이 증진된 품종 개발이 필요하다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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