초록 ▼

□ 연구개요
암 환자 샘플의 전장유전체 연관분석 연구 (Genome-Wide Association Study) 에서 단백질로 직접 번역되는 염기서열의 돌연변이 뿐만 아니라 인트론 (intron) 등의 비번역 RNA 들에서의 염기서열 변 이가 암에 관여한다는 보고가 있으나 상당수 돌연변이들의 분자 기전은 아직 잘 알려져 있지 않음. 또한 DNA 염기서열 변이 뿐만 아니라 RNA 로 전사된 후의 RNA 변이 및 편집과 암의 연관성도 알 려지고 있음. 본 연구에서는 CRISPR 유전자편집 기술을 응용하여 DNA 염기서열 변화없이 R

□ 연구개요
암 환자 샘플의 전장유전체 연관분석 연구 (Genome-Wide Association Study) 에서 단백질로 직접 번역되는 염기서열의 돌연변이 뿐만 아니라 인트론 (intron) 등의 비번역 RNA 들에서의 염기서열 변 이가 암에 관여한다는 보고가 있으나 상당수 돌연변이들의 분자 기전은 아직 잘 알려져 있지 않음. 또한 DNA 염기서열 변이 뿐만 아니라 RNA 로 전사된 후의 RNA 변이 및 편집과 암의 연관성도 알 려지고 있음. 본 연구에서는 CRISPR 유전자편집 기술을 응용하여 DNA 염기서열 변화없이 RNA 염 기서열을 정밀하게 한 염기씩 세밀하게 조절할 수 있는 획기적인 RNA 직접 염기편집(RNA direct base editing) 기술을 개발함으로써 RNA 조절에 관련된 암 분자 기전 규명 및 암 치료제 개발 연구 플랫폼 구축을 목표로 함

□ 연구 목표대비 연구결과
세부 목표와 연구 결과:
1. CRISPR 기반 RNA 직접 염기편집을 적용하여 RNA 의 각 염기서열을 정밀하게 조절하는 기술을 확보함으로써, 전장유전체 연관분석에서 암과 높은 연관성을 보이는 염기변이들의 번역 및 비번역 RNA를 조절하여 암에 관여하는 분자기전 규명연구 수행
- 본 과제에서는 RNA를 직접 표적해서 조절하는 Cas13a 기반 기술을 구현하였음. mRNA를 표적하여 m6A를 조절하는 dC2c2-Alkbh5 기반 기술로 mRNA의 스플라이싱, 번역 및 안정성을 조절할 수 있음을 또한 고효율 Cas13a 인 CasRX를 사용하여 표적 mRNA를 녹다운 하는 기술을 수립함. 또한 mRNA 의 발현을 전사수준에서 조절하는 기법 연구를 수행함. 난치성 암인 신경교종을 포함하여 다수의 암에서는 텔로미어 길이를 연장하는 TERT가 과발현되어있음. 이에 대응하는 항암전략으로써 TERT의 mRNA를 전사 수준에서 억제하는 dCas9-KRAB 기술을 개발하였음. 또한 Cas12a를 활용하여 표적 유전자의 전사를 높여 mRNA 생성을 늘리는 Cas12a 기반 기술인 dCpf1-VPR를 적용하여 줄기세포 분화를 조절할 수 있음을 입증하였음.
2. RNA 직접 염기편집 기술을 적용하여 암 연관 RNA 염기서열 변이를 유도하고 암의 진행을 각 세포 수준에서 규명하기 위해 단일세포 차세대염기서열 분석을 진행하여 대용량 유전데이터 확보. 데이터들을 분석하여 암 진행에서 각 세포들이 나타내는 특성을 파악함으로써 세포특이적 암 유전자 상호작용을 규명하고 새로운 암 관련 유전자를 탐색.
- 암 특이적인 유전자인 TERT의 발현을 조절하는 dCas9-KRAB의 lentivirus를 제작하여 암세포의 TERT를 억제하고 유전자 발현변화를 확인하였음. 또한 CRISPR 기술에서 표적 유전자의 염기서열을 단일 염기쌍 오차까지 구분하는 수준으로 높이는 정확도 분석 연구 수행. 암을 유발하는 특정 바이러스들은 각 세포의 유전체 임의적 위치에 삽입되어 유전자 발현을 조절함으로써 암을 유발함이 알려져 있음. 이에 본 과제에서는 CRISPR를 활용하는 CReVIS-seq 기술을 개발하여 각 세포의 유전체 내에 바이러스 서열이 삽입되는 위치를 탐색하는 기술을 개발하였음.
3. RNA 염기변이 및 편집 대용량 유전데이터를 분석하는 알고리즘 및 소프트웨어를 개발하여 환자 맞춤형 암 기전 분석 및 치료법 연구 플랫폼 구축
- 대용량 단일세포 염기서열 분석에 있어서 핵심이 되는 후성유전체 데이터에서의 정밀한 피크 검출을 위하여 인간 연구자의 시각적 검사를 모방한 딥러닝 플랫폼(CNN-Peaks)을 개발하였음. 본 연구에서 개발한 후성유전체 염기서열 데이터 분석 AI 플랫폼을 이용하면 후성유전체 데이터에서의 유전적 특이 구간 (전사인자, 히스톤변형, 개방염색질 등)을 기존의 기법보다 정확하게 검출해낼 수 있음. 이는 기존의 후성유전체 분석 도구들이 가지는 높은 거짓양성 오류의 단점을 극복하고, 인간 연구자의 시각적 검사 수준으로 대용량 염기서열 데이터를 분석해낼 수 있음. CNN-Peaks 플랫폼은 최근 활발하게 연구되고 있는 단일세포 기반 ATAC-seq 및 RNA-seq 대용량 데이터 분석을 통한 암 기전 연구에도 활용될 수 있음.

□ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성)
⦁ 본 과제를 통해 개발한 CRISPR 기반 고정밀 mRNA 조절 기술들은 암 특이적 유전자 조절에 범용적으로 적용될 수 있어 암 치료제를 개발하는 후속 연구과제에 활용할 것임.
⦁ TERT 유전자 발현조절은 암세포의 cell viability에 영향을 주는 것으로 연구되어 발전된 발현조절 모듈을 연구하여 치료제로써의 발전가능성이 있을 것으로 예상하여 후속 연구과제에서 추가적으로 연구를 진행할 것임.
⦁ CRISPR system의 최근 이슈로 떠오른 것은 off-target 효과임. 이문제를 해결하기위해 본연구진은 표적 유전자의 염기서열을 단일 염기쌍 오차까지 구분하는 수준으로 높이는 정확도 분석 연구 수행하였고 연구 결과를 활용하여 암진단이나 유전병진단방법으로서의 발전 가능성을 기대함
⦁ 특정 바이러스들은 세포내 유전체에 삽입되어 유전자 발현을 조절함으로써 암을 유발함이 알려져 있음. 본 과제에서는 CReVIS-seq 기술 개발을 통해 CRISPR를 활용하여 유전체 내에 바이러스 서열이 삽입되는 위치를 탐색하는 기술을 개발하여 바이러스 서열이 유전체에 삽입되는 현상을 분석하였으며, 이 기술은 바이러스 뿐만 아니라 copy number variation 이나 structural vatiation 등 암 발생에 원인이 되는 유전체 변이를 탐색하는 데 적용될 수 있음.
⦁ 고전적인 기법 사용시 거짓양성 오류가 많아서 정확한 분석이 어렵기 때문에 인간 연구자가 수동으로 검사를 해야함. 하지만 이때 약 30억개의 많은 게놈 영역에 대해서 모두 검사할 수 없다. 인간의 시각을 모방하는 딥러닝을 이용하여 정확성과 속도를 모두 만족할 수 있는 암 유전체 대용량 데이터 분석 플랫폼을 구축하여 암관련 유전자 탐색에 있어 시간과 비용을 절감할 수 있는 효과가 나타날 것으로 예상함.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구결과 요약문 ... 2
• 목차 ... 4
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 5
• 가. 연구의 목표 ... 5
• 나. 연구의 내용 ... 5
• 다. 연구의 필요성 ... 6
• 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 8
• 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 12
• 1) 정성적 연구개발성과(연구개발결과) ... 12
• 2) 세부 정량적 연구개발성과 ... 17
• 3) 목표 달성 수준 ... 19
• 4) 목표 미달 시 원인 분석 ... 20
• 4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 20
• 가. CRISPR 기반의 RNA 직접 염기편집 기술을 적용해 RNA 변이와 편집이 암 진행에 미치는 분자기전 규명 ... 20
• 나. 단일 세포 수준의 대용량 데이터의 처리기술 개발 및 인재양성 ... 21
• 다. 정밀 의학의 유전자 진단 및 치료 관련 IT/BT 융합 연구 기반 구축 및 지적재산권 창출 ... 21
• 5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 21
• 6. 참고문헌 ... 22
• [붙임1] 세부 정량적 연구개발성과 ... 23
• [붙임2] 연구책임자 대표적 연구실적 및 증빙(요약문 및 사본) ... 27
• 끝페이지 ... 37