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문제 정의
- 본 연구 결과로 확립된 도입유전자 검출기법은 국내 도입 LMO의 80%를 검출할 수 있어 자연환경으로 유출된 LMO 판단의 과학적 근거를 제공할 것이다. 또한, LMO 자연 생태계 안전관리를 위한 사후 모니터링 체계 마련에 활용하고자 국립생태원에서는 지속적으로 LMO의 검출기법을 확립하고자 한다.
제안 방법
- 7개 LM 작물의 내재유전자와 도입유전자에 특이적인 primer를 이용하여 얻은 PCR 산물은 PCR Purification system으로 정제하였다(Biofact, Daejeon, Korea). 그 후에, T-blunt PCR Cloning system (Solgent, Daejeon, Korea)을 이용하여 cloning 한 후에 염기서열을 분석하였다.
- Ethanol 제거 후 건조한 다음 100 µL의 멸균 수로 녹여 genomic DNA를 추출하였다.
- KBCH와 JRC로부터 수집된 7개 LM 작물별 특성, 도입유전자 특성, 검출을 위해 필요한 primer의 서열, 최적 검출을 위한 DNA 주형 농도와 연쇄 중합 효소 반응 조건 등에 관한 정보와 문헌 자료를 바탕으로 각 LM 작물과 형태학적 유사한 근연종과의 식별을 위한 내재유전자 및 이벤트 특이적 목적유전자를 검출할 수 있는 primer를 합성하였다(Table 2). PCR 실험을 통해 7개 LM 이벤트에서 제작한 내재유전자(Lectin1, AdhC와 Adh1) 특이적인 primer가 작용하여 PCR 산물을 확인할 수 있었으며(Fig.
- PCR 반응조건은 95℃에서 5분간 수행 후, 다음 단계에서 95℃ 15초, 60℃ 20초간 40 cycle을 반응시킨 뒤 4℃에서 PCR 산물을 보관하였다. PCR 산물은 2.5% agarose gel 상에서 100 V로 전기영동 하여 확인하였다.
- 각 작물의 내재유전자 primer는 NCBI GenBank 유전자 염기서열을 기초로 하여, 콩은 Lectin 1 (Le1, GenBank accession no. K00821), 면화 Alcohol DehydrogenaseC (AdhC, GenBank accession no. AF403330) 및 옥수수 Alcohol Dehydrogenase1(Adh1, GenBank accession no. AF123535)의 primer를 제작하였다. 그리고 7개 LM 작물에 도입된 목적 유전자를 검출하기 위한 primer는 유럽위원회 공동연구센터(European Commission, Joint Research Centre, JRC)와 LM 환경 위해성센터(Center for Environmental Risk Assessment, CERA)에서LMO 이벤트의 도입유전자 특성과 프라이머 서열 정보 등을 바탕으로 제작하였다(JRC 2014)(Table 2).
- 7개 LM 작물의 내재유전자와 도입유전자에 특이적인 primer를 이용하여 얻은 PCR 산물은 PCR Purification system으로 정제하였다(Biofact, Daejeon, Korea). 그 후에, T-blunt PCR Cloning system (Solgent, Daejeon, Korea)을 이용하여 cloning 한 후에 염기서열을 분석하였다. 최종적으로 Bioeditprogram을 이용하여 도입 유전자와 주변 염기서열을 비교 분석하였다.
- 그래서 국립생태원은 현재 국내 수입·유통되고 있는 LM 작물 중에서 구매 가능한 7개 이벤트를 선정하여 유럽공인기법을 바탕으로 2014년 LMO에 도입된 유전자 검출기법 구축연구를 수행하였다.
- AF123535)의 primer를 제작하였다. 그리고 7개 LM 작물에 도입된 목적 유전자를 검출하기 위한 primer는 유럽위원회 공동연구센터(European Commission, Joint Research Centre, JRC)와 LM 환경 위해성센터(Center for Environmental Risk Assessment, CERA)에서LMO 이벤트의 도입유전자 특성과 프라이머 서열 정보 등을 바탕으로 제작하였다(JRC 2014)(Table 2). 모든 primer는 ㈜마크로젠에서 제작하여 사용 전까지 -20℃에 보관하였고 도입유전자 검출 PCR 반응 시 10 pM로 희석하여사용하였다.
- 도입유전자별 특성 조사 및 검출법 개발을 위해 확보한 7개 LMO 표준시료 중, 1개의 DNA 상태(콩 FG72) 표준시료를 제외한 6개의 분말 시료와 비변형 표준시료에서DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)을이용하여 genomic DNA를 순수분리·정제하였다.
- 3). 따라서 검증된 내재 primer와 이벤트 특이적 primer를 이용하여 7개 LM 표준시료와 Non-LM 표준시료에서 도입유전자 검출기법을 확립하기 위한 실험을 수행하였다(Savini et al. 2011; Savini et al. 2012a; Charles et al. 2011; Savini et al. 2012b; Mazzara et al. 2006; Mazzara et al. 2012; Savini et al. 2012c).
- 매회 50 ng의 genomic DNA를 사용하여 한 시료당 최종부피가 30 µL가 되도록 2X EF-Taq PCR Pre-Mix (Solgent,Daejeon, Korea)와 혼합하여 PCR 실험을 수행하였다(ProplexPCR system, Applied Biosystems, Waltham, USA).
- 1). 분리된 genomic DNA는 멸균 수로 희석하여 매회 50 ng의 genomic DNA를 도입유전자 검출을 위한 증폭 실험에 사용되었다. 표준 DNA 시료의 경우 10 ㎍으로 제공되어, 분말 시료와 동일하게 농도를 희석해 50 ng의 시료를 유전자 증폭 실험을 위해 사용하였다.
- 그 후에, T-blunt PCR Cloning system (Solgent, Daejeon, Korea)을 이용하여 cloning 한 후에 염기서열을 분석하였다. 최종적으로 Bioeditprogram을 이용하여 도입 유전자와 주변 염기서열을 비교 분석하였다.
대상 데이터
- 2014년 2월까지 국내에 승인된 LMO 이벤트 현황은 한국바이오안전성정보센터(Korea Biosafety Clearing House, KBCH)로부터 수집되었고, 미생물, 분말로 수입되는 감자, 알팔파, 사탕무 및 Stack 수입품을 제외한 국내 자연환경 유출 가능성이 큰 단일 품목 7개의 LMO를 선별하였다(Table 1). 7개 LM 작물과 비변형 콩, 면화 및 옥수수 Non-LM 표준시료로부터 genomic DNA를 정제하고 Nano-drop을 이용하여 DNA 정확한 농도를 측정하였고 1.
- CERA 및 GMO Detection Method Database (GMDD)로부터7개 LM 작물의 개발 목적, 도입유전자의 특성, 이벤트 특이적 primer의 위치와 정보 및 중합반응 조건 및 반응 횟수, 생성물의 크기에 관한 내용을 수집하였다. 또한, BIOSAFETY SCANNER Website로부터 제공된 정보를 통해 각 이벤트별 도입유전자의 특성과 발현을 위해 사용된 프로모터와 종결인자의 종류, 분자생물학적 특성 및 주변 염기서열의 유전 정보를 파악할 수 있었다.
- LM 작물에 도입된 유전자별 특성 조사 및 검출법 개발에 필요한 표준시료의 확보를 위해 2곳의 표준물질 연구소를 조사하였다. 유전자변형 면화(281/3006, GHB119) 및 비변형 면화의 표준시료를 표준물질 및 측정연구소(Institute for Reference Materials and Measurements, IRMM)의 대행회사인 Sigma-Aldrich (St.
- 4). 마찬가지로 해충 및 제초제 저항성 특성을 목적으로 개발된 281/3006 (Cry1Ac, Cry1F, PAT 유전자삽입)과 GHB119 (Cry2Ae, PAT 유전자 삽입) 등 2개의 LM 면화와 가뭄 저항성 특성을 목적으로 개발된 MON87460(CspB 유전자 삽입) LM 옥수수를 대상으로 PCR 실험을 수행하였다. Fig.
- 유전자변형 면화(281/3006, GHB119) 및 비변형 면화의 표준시료를 표준물질 및 측정연구소(Institute for Reference Materials and Measurements, IRMM)의 대행회사인 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)사에서 구매하였으며, 미국유지화학협회(American Oil Chemists’ Society(AOCS, Urbana, IL, USA))로부터 유전자변형 콩(CV127, MON87701, MON87705, FG72)과 유전자변형 옥수수(MON87460) 및 비변형 콩과 옥수수의 표준시료를 구매하였다.
- 콩은 제초제 저항성 특성을 목적으로 개발된 CV127 (Csr1-2 유전자 삽입), FG72 (2mEPSPS와 hppdPfW336 유전자 삽입) 와 MON87701 (Cry1Ac와 CP4 EPSPS 유전자 삽입) 및 고올레산 생산유전자인 Fad2-1A, Fatb1-A이 삽입된 MON87705 등 4개 LM 이벤트를 대상으로 검출기법을 확립하고자 하였다. 그 결과, 모든 Non-LM 표준시료와 LM 표준시료에서 내재유전자가 증폭되어 대상 작물인 콩을 확인하였고, 각 이벤트별 특이 primer는 LM 표준시료에서만 특이적으로 작용하여 4개 LM 콩 이벤트의 도입유전자 검출기법이 잘 확립되었다는 것을 확인할 수있었다(Fig.
- 분리된 genomic DNA는 멸균 수로 희석하여 매회 50 ng의 genomic DNA를 도입유전자 검출을 위한 증폭 실험에 사용되었다. 표준 DNA 시료의 경우 10 ㎍으로 제공되어, 분말 시료와 동일하게 농도를 희석해 50 ng의 시료를 유전자 증폭 실험을 위해 사용하였다.
성능/효과
- 2014년 2월까지 국내에 승인된 LMO 이벤트 현황은 한국바이오안전성정보센터(Korea Biosafety Clearing House, KBCH)로부터 수집되었고, 미생물, 분말로 수입되는 감자, 알팔파, 사탕무 및 Stack 수입품을 제외한 국내 자연환경 유출 가능성이 큰 단일 품목 7개의 LMO를 선별하였다(Table 1). 7개 LM 작물과 비변형 콩, 면화 및 옥수수 Non-LM 표준시료로부터 genomic DNA를 정제하고 Nano-drop을 이용하여 DNA 정확한 농도를 측정하였고 1.0% agarose gel을 사용하여 전기영동을 통해 DNA band를 확인한 결과,Non-LM과 LM 표준시료의 DNA가 손상되지 않은 상태로 순수 분리되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 분리된 genomic DNA는 멸균 수로 희석하여 매회 50 ng의 genomic DNA를 도입유전자 검출을 위한 증폭 실험에 사용되었다.
- 마찬가지로 해충 및 제초제 저항성 특성을 목적으로 개발된 281/3006 (Cry1Ac, Cry1F, PAT 유전자삽입)과 GHB119 (Cry2Ae, PAT 유전자 삽입) 등 2개의 LM 면화와 가뭄 저항성 특성을 목적으로 개발된 MON87460(CspB 유전자 삽입) LM 옥수수를 대상으로 PCR 실험을 수행하였다. Fig. 5와 Fig. 6에서 보는 것과 같이 유전자변형 면화와 옥수수에 대해서만 특이적인 PCR 산물이 확인되어 281/3006, GHB119와 MON87460 이벤트의 도입유전자 특이적 검출기법 또한 잘 확립되었다는 것을 각각 확인할 수 있었다.
- KBCH와 JRC로부터 수집된 7개 LM 작물별 특성, 도입유전자 특성, 검출을 위해 필요한 primer의 서열, 최적 검출을 위한 DNA 주형 농도와 연쇄 중합 효소 반응 조건 등에 관한 정보와 문헌 자료를 바탕으로 각 LM 작물과 형태학적 유사한 근연종과의 식별을 위한 내재유전자 및 이벤트 특이적 목적유전자를 검출할 수 있는 primer를 합성하였다(Table 2). PCR 실험을 통해 7개 LM 이벤트에서 제작한 내재유전자(Lectin1, AdhC와 Adh1) 특이적인 primer가 작용하여 PCR 산물을 확인할 수 있었으며(Fig. 2), 이벤트 특이적 primer가 7개 LM 이벤트에서 잘 작용하는 것을 검증하였다(Fig. 3). 따라서 검증된 내재 primer와 이벤트 특이적 primer를 이용하여 7개 LM 표준시료와 Non-LM 표준시료에서 도입유전자 검출기법을 확립하기 위한 실험을 수행하였다(Savini et al.
- 콩은 제초제 저항성 특성을 목적으로 개발된 CV127 (Csr1-2 유전자 삽입), FG72 (2mEPSPS와 hppdPfW336 유전자 삽입) 와 MON87701 (Cry1Ac와 CP4 EPSPS 유전자 삽입) 및 고올레산 생산유전자인 Fad2-1A, Fatb1-A이 삽입된 MON87705 등 4개 LM 이벤트를 대상으로 검출기법을 확립하고자 하였다. 그 결과, 모든 Non-LM 표준시료와 LM 표준시료에서 내재유전자가 증폭되어 대상 작물인 콩을 확인하였고, 각 이벤트별 특이 primer는 LM 표준시료에서만 특이적으로 작용하여 4개 LM 콩 이벤트의 도입유전자 검출기법이 잘 확립되었다는 것을 확인할 수있었다(Fig. 4). 마찬가지로 해충 및 제초제 저항성 특성을 목적으로 개발된 281/3006 (Cry1Ac, Cry1F, PAT 유전자삽입)과 GHB119 (Cry2Ae, PAT 유전자 삽입) 등 2개의 LM 면화와 가뭄 저항성 특성을 목적으로 개발된 MON87460(CspB 유전자 삽입) LM 옥수수를 대상으로 PCR 실험을 수행하였다.
- 또한, BIOSAFETY SCANNER Website로부터 제공된 정보를 통해 각 이벤트별 도입유전자의 특성과 발현을 위해 사용된 프로모터와 종결인자의 종류, 분자생물학적 특성 및 주변 염기서열의 유전 정보를 파악할 수 있었다. 따라서 도입유전자의 삽입된 위치 정보와 검출기법의 정확성을 확인하기 위하여 PCR 산물을 이용한 염기서열 분석 및 alignment를 실시한 결과, Table 3에서 보듯이 7개 이벤트 모두 도입유전자의 오른쪽 또는 왼쪽 경계 염기서열과 LM 작물 유전자가 상보적으로 설계되었으며 기존에 수집된 LMO의 유전정보와 일치함을 확인하였다(Fig. 7). 이들 정보는 7개 이벤트 특이적 도입유전자 검출을 위한 PCR 반응으로부터 생성된 최종 생성물의 염기서열을 분석하는 데 활용하였고 Table 3에 정리하였다(Table 3).
- CERA 및 GMO Detection Method Database (GMDD)로부터7개 LM 작물의 개발 목적, 도입유전자의 특성, 이벤트 특이적 primer의 위치와 정보 및 중합반응 조건 및 반응 횟수, 생성물의 크기에 관한 내용을 수집하였다. 또한, BIOSAFETY SCANNER Website로부터 제공된 정보를 통해 각 이벤트별 도입유전자의 특성과 발현을 위해 사용된 프로모터와 종결인자의 종류, 분자생물학적 특성 및 주변 염기서열의 유전 정보를 파악할 수 있었다. 따라서 도입유전자의 삽입된 위치 정보와 검출기법의 정확성을 확인하기 위하여 PCR 산물을 이용한 염기서열 분석 및 alignment를 실시한 결과, Table 3에서 보듯이 7개 이벤트 모두 도입유전자의 오른쪽 또는 왼쪽 경계 염기서열과 LM 작물 유전자가 상보적으로 설계되었으며 기존에 수집된 LMO의 유전정보와 일치함을 확인하였다(Fig.
후속연구
- 그래서 국립생태원은 현재 국내 수입·유통되고 있는 LM 작물 중에서 구매 가능한 7개 이벤트를 선정하여 유럽공인기법을 바탕으로 2014년 LMO에 도입된 유전자 검출기법 구축연구를 수행하였다. 본 연구 결과로 확립된 도입유전자 검출기법은 국내 도입 LMO의 80%를 검출할 수 있어 자연환경으로 유출된 LMO 판단의 과학적 근거를 제공할 것이다. 또한, LMO 자연 생태계 안전관리를 위한 사후 모니터링 체계 마련에 활용하고자 국립생태원에서는 지속적으로 LMO의 검출기법을 확립하고자 한다.
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