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문제 정의
- 본 연구는 국내 멜론 유전자원 분류와 육종소재 평가에 필요한 정보를 제공하고자 형태적, 지리적으로 다양하게 수집된 83개 멜론 품종을 대상으로 하여 형질특성 조사와 EST-SSR 마커를 이용한 이들 간 유연관계를 분석하고자 수행되었다.
제안 방법
- Band 유, 무에 따라서 각각 “1”과 “0”으로 genotyping 하여 data matrix를 작성하였다.
- PCR 조건은 95°C에서 2분간 pre-denaturation, 94°C에서 15초간 denaturation, 60°C에서 30초간 anneling하여 매회 cycle 마다 0.5°C 감한 뒤 72°C에서 1분간 extension 과정을 10회 반복하고, 다시 94°C에서 15초간 denaturation, 55°C에서 30초간 annealing, 72°C에서 30초간 extension의 과정을 35회 반복하고, 3분간 72°C에서 최종 extension을 수행하였다.
- 5°C 감한 뒤 72°C에서 1분간 extension 과정을 10회 반복하고, 다시 94°C에서 15초간 denaturation, 55°C에서 30초간 annealing, 72°C에서 30초간 extension의 과정을 35회 반복하고, 3분간 72°C에서 최종 extension을 수행하였다. PCR 증폭이 확인된 PCR산물들에 대해서는 Fragment Analyzer (Adavanced Analytical Technologies, USA)를 이용하여 정밀한 유전자형 분석을 수행하였다. 유전자형 분석은 PROSize 2.
- 멜론(Cucumis melo L.) 유전자원 83 품종에 대한 형질특성 및 유전적 다양성을 분석하였다. 형질은 유묘, 잎, 줄기, 화기, 과실, 종자에 대해 총 35개 세부특성을 조사하고, 다변량(MANOVA) 분석을 하였다.
- Cluster I은 과특성에 있어 가장 높은 측정치를, Cluster II는 당도, Cluster V는 과의 성숙기간이 긴 품종들로 주로 구성되었다. 유전자형 분석은 Cucurbit Genomics Initiative (ICuGI) database에 공시된 15개의 Expressed-sequence Tag-Simple Sequence Repeat(EST-SSR) 마커를 이용하였으며 비가중평균결합법(UPGMA)을 통해 품종 간 유연관계를 분석하고 6개의 군으로 분류하였다. 형태적 군집분석 결과와 유전적 군집분석 결과의 상관관계를 조사한 결과 상관계수(r) 값이 –0.
- 재배된 멜론 품종의 유엽을 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 잎 샘플을 1.
- ) 유전자원 83 품종에 대한 형질특성 및 유전적 다양성을 분석하였다. 형질은 유묘, 잎, 줄기, 화기, 과실, 종자에 대해 총 35개 세부특성을 조사하고, 다변량(MANOVA) 분석을 하였다. 주성분 분석(PCA, principal component analysis) 결과 과중, 과장, 과경, 자엽길이, 종자직경, 종자길이 등 8개의 주성분이 전체 변량의 76.
대상 데이터
- 품종 간 유연관계 분석을 위해 EST-SSR 마커의 유전자형을 분석하였다. EST-SSR primer set는 International Cucurbit Initiative database (ICuGI, http://www.icugi.org)에 공시된 멜론 통합 유전자지도(integrated map)에서 genome 전역에 고루 분포된 마커를 기반으로 선발하였다. PCR 용액은 dNTP (each 10 mM) 0.
- 공시된 83개의 멜론 품종(Table 1)(Kim et al. 2015)을 2014년에 경상남도 농업기술원에 설치된 비닐하우스 시설을 이용하여 품종 당 3 반복씩 토경재배 하였다. 형질특성 조사는 International Union for the Protection of New Varieties of Plants [(http://www.
- 총 53개의 EST-SSR primer set 중 PIC 값이 크며 증폭된 밴드가 선명하고 재현성이 높은 15개의 EST-SSR 마커를 선발하였다(Table 4). 선발한 15개의 EST-SSR 마커에 의해 증폭된 band 수는 총 128개 였으며 각 마커 당 평균은 13.
데이터처리
- 실험에 사용된 83 품종에 대한 형태적 다양성을 평가하기 위해 주성분 분석을 수행하였다. 품종 간 조사된 형질특성 변이들에 대한 주성분 분석결과, 고유 값이 1이상인 제1주성분부터 제8주성분까지 전체 분산의 누적기여도는 76.
- PCR 증폭이 확인된 PCR산물들에 대해서는 Fragment Analyzer (Adavanced Analytical Technologies, USA)를 이용하여 정밀한 유전자형 분석을 수행하였다. 유전자형 분석은 PROSize 2.0 version 프로그램을 이용하여 PCR 증폭 산물(band)의 크기가 1bp 오차 범위 이내 일 때는 동일한 유전자형으로 간주하였으며, 증폭 산물이 명확한 것만 판독하였다. Band 유, 무에 따라서 각각 “1”과 “0”으로 genotyping 하여 data matrix를 작성하였다.
- 형태적 유연관계를 조사하기 위해 SAS program (SAS institute, SAS 9.4)을 사용하여 83개의 품종간의 형태적 특성에 대해 주성분 분석(PCA, principal component analysis)과 군집 분석(Cluster analysis)을 수행하였다. 주성분 분석을 통해 특성 간 상관행렬로부터 고유 값과 전체 변동에 대한 각 주성분의 기여도를 구하였으며, 군집분석에서는 Average Distance에 기초한 비가중평균결합법(UPGMA, unweighted pair group method on arithmetic averages)를 사용하였다.
- EST-SSR 마커의 유사도 분석은 Jaccard’s coefficient (Sneath and Sokal 1973) 방법을 따랐으며, UPGMA를 이용한 SHAN clustering 분석은 NTSYS-pc software program (Jamshidi and Jamshidi 2011)을 사용하여 수행하였다. 형태적 유연관계와 유전적 유연관계의 coefficient matrices는 NTSYS-pc의 MXCOMP (Rohlf 2002)를 사용한 Mantel test (Mantel 1967)를 통해 구하였다.
이론/모형
- EST-SSR 마커의 유사도 분석은 Jaccard’s coefficient (Sneath and Sokal 1973) 방법을 따랐으며, UPGMA를 이용한 SHAN clustering 분석은 NTSYS-pc software program (Jamshidi and Jamshidi 2011)을 사용하여 수행하였다.
- 4)을 사용하여 83개의 품종간의 형태적 특성에 대해 주성분 분석(PCA, principal component analysis)과 군집 분석(Cluster analysis)을 수행하였다. 주성분 분석을 통해 특성 간 상관행렬로부터 고유 값과 전체 변동에 대한 각 주성분의 기여도를 구하였으며, 군집분석에서는 Average Distance에 기초한 비가중평균결합법(UPGMA, unweighted pair group method on arithmetic averages)를 사용하였다.
- 품종 간 유연관계 분석을 위해 EST-SSR 마커의 유전자형을 분석하였다. EST-SSR primer set는 International Cucurbit Initiative database (ICuGI, http://www.
- 2015)을 2014년에 경상남도 농업기술원에 설치된 비닐하우스 시설을 이용하여 품종 당 3 반복씩 토경재배 하였다. 형질특성 조사는 International Union for the Protection of New Varieties of Plants [(http://www.upov.int 2006. Melon (Cucumis melo L.)]의 기준을 참고하여 생육 전반에 관련된 35개 형질들(Table 2)을 평가하였으며, 각 품종들의 형태적 특성에 따른 분류(Taxonomy group)는 Pitrat (2000) 분류 체계를 기준으로 수행하였다(Kim et al. 2015).
성능/효과
- 3). Cluster의 형질특성을 보면, Cluster I은 PI222187, PI120746 등으로 과의 크기가 작은 품종이 주를 이루었으며, Cluster II에서는 Reticulatus 형태의 품종이 많았으며, Cluster III에는 PI266933, Weed melon 등의 Makuwa와 Chito type의 품종이 속하였다. Cluster IV의 AGR, K018966은 Chate, Makuwa type의 멜론이며, Cluster V의 K145117은 Tibish type이었다.
- 2사분면에는 HT, CL, CW, FL, FT, SLS, SD, SFW, SDW의 측정값이 낮고 SLS와 FT는 높은 값을 가지는 품종들이 분포했다. FW와 FD의 값은 주성분 1과 주성분 2의 영향을 모두 받는데 제1주성분 값이 양(+)이고 제2주성분의 값이 음(-)인 4사분면의 멜론들이 제1주성분 값이 음(-)이고 제2주성분의 값이 양(+) 2사분면의 멜론들에 비해 FW, FD 값이 큰 경향을 보였다.
- PCA plot 결과(Fig. 1), 1사분면에는 HT, CL, CW, FW, FL, FD, FT, SLS, SD의 측정값이 높고, SFW, SDW의 측정값이 낮은 특징의 품종들이 분포했으며, 3사분면에는 HT, CL, CW, FW, FL, FD, FT, SLS, SD의 측정값이 낮고, SFW, SDW의 측정값이 높은 품종들이 분포했다. 4사분면에는 HT, CL, CW, FL, FT, SLS, SD, SFW, SDW의 측정값은 높고, SLS, FT는 낮은 측정값을 가지는 품종들이 분포했다.
- 2010). 따라서 본 연구의 결과, 유사한 형태적 특성을 의해 동일한 멜론 타입(taxonomic group)으로 분류된다 하더라도 DNA 수준에서는 매우 상이할 수 있음을 알 수 있었다.
- 754의 EST-SSR 마커를 사용할 경우 박과 작물의 유연관계 분석에 효과적이었다. 본 실험의 PIC 평균값은 0.68으로 Kim et al. (2015)의 수치보다 낮지만 사용된 15개 마커를 이용하여 모든 품종의 구별이 가능하였다. 품종 간 유사도의 범위는 0.
- 이상의 분석결과를 종합하여 Cluster analysis를 수행한 결과, cluster 간의 평균 거리가 0.7 일 때 83개 품종이 5개의 cluster로 분류되었다(Fig. 2), 다섯 개 cluster 간 품종별 35개 형질특성을 비교하기 위해 cluster 내 품종들의 형질값을 평균하였을 때, cluster I은 과실의 크기가 관련된 형질들(FW, FL, FD, FT)의 값이 3053.60 g, 24.82 cm, 16.14 cm, 3.72 cm로 높았으나 SSC가 7.44 brix로 낮았다, cluster II에서는 과실의 크기와 관련된 형질들 값이(FW, FL, FD, FT)의 2250.47 g, 16.89 cm, 15.61 cm, 3.38 cm로 cluster I 다음으로 높았으며, SSC와 RR의 값이 각각 11.90 brix와 51.93 day로 cluster 중에 가장 높았다. cluster V는 과실 관련 형질(FW, FL, FD, FT)과 RR에 대한 평균값이 각각 234 g, 14.
- 제1주성분과 제2주성분을 이루는 특성간의 상관관계를 보면 제1주성분은 HT, CL, CW, FW, FL, LL, LW, FD, SL, SD, OHSW가 상관계수 0.22 ~ 0.24의 범위로 높은 정(+)의 상관관계를 보였으며, 제1주성분 값이 클수록 이들 형질특성의 측정값이 높았다. 따라서 제1주성분은 종자크기와 유묘, 잎, 그리고 과실의 크기에 영향을 주는 요소로 추정된다.
- 위의 결과를 바탕으로 기여도가 높은 제1주성분과 제2주성분의 상관관계를 정리한 결과는 Table 3과 같다. 제1주성분은 전체 분산에 대해 29.45%의 기여도를 보였으며, 제8주성분의 기여도는 3.3%로 낮았다. 위의 결과를 바탕으로 8개의 주성분과 각각의 특성간의 상관관계를 정리한 결과는 Table 4와 같다.
- 따라서 제1주성분은 종자크기와 유묘, 잎, 그리고 과실의 크기에 영향을 주는 요소로 추정된다. 제2주성분은 SLS, FW, FD, FT가 상관계수 0.24 ~ 0.30의 범위로 높은 정(+)의 상관관계를 보였다. 반면에, SFW와 SDW는 부(-)의 상관관계를 가지며, 상관계수는 0.
- 25의 범위를 보였다. 제2주성분이 값이 클수록 SLS, FW, FD, FT 측정값이 크며 SFW, SDW의 측정값이 낮았다. 따라서 제2주성분은 유묘의 생체중, 건물중, 유묘의 엽록소 함량 그리고 과실의 크기에 영향을 주는 요소로 추정된다.
- 형질은 유묘, 잎, 줄기, 화기, 과실, 종자에 대해 총 35개 세부특성을 조사하고, 다변량(MANOVA) 분석을 하였다. 주성분 분석(PCA, principal component analysis) 결과 과중, 과장, 과경, 자엽길이, 종자직경, 종자길이 등 8개의 주성분이 전체 변량의 76.3% 를 나타내었다. 평균연관법(Average linkage method)을 사용한 83개의 멜론의 군집분석(Cluster analysis) 결과 coefficient 0.
- 3% 를 나타내었다. 평균연관법(Average linkage method)을 사용한 83개의 멜론의 군집분석(Cluster analysis) 결과 coefficient 0.7에서 5개의 cluster로 분류되었다. Cluster I은 과특성에 있어 가장 높은 측정치를, Cluster II는 당도, Cluster V는 과의 성숙기간이 긴 품종들로 주로 구성되었다.
- (2015)의 수치보다 낮지만 사용된 15개 마커를 이용하여 모든 품종의 구별이 가능하였다. 품종 간 유사도의 범위는 0.11에서 0.90으로, 유사도 0.19에서 83개 품종을 총 6개의 cluster로 나눌 수 있었다(Fig. 3). Cluster의 형질특성을 보면, Cluster I은 PI222187, PI120746 등으로 과의 크기가 작은 품종이 주를 이루었으며, Cluster II에서는 Reticulatus 형태의 품종이 많았으며, Cluster III에는 PI266933, Weed melon 등의 Makuwa와 Chito type의 품종이 속하였다.
- 실험에 사용된 83 품종에 대한 형태적 다양성을 평가하기 위해 주성분 분석을 수행하였다. 품종 간 조사된 형질특성 변이들에 대한 주성분 분석결과, 고유 값이 1이상인 제1주성분부터 제8주성분까지 전체 분산의 누적기여도는 76.3%로 나타났으며, 제1주성분은 전체 분산에 대해 29.4%의 기여도를 보였으며, 제2주성분의 기여도는 11.6%로 나타났다. 위의 결과를 바탕으로 기여도가 높은 제1주성분과 제2주성분의 상관관계를 정리한 결과는 Table 3과 같다.
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