[논문]PLCz 유전자의 유전적 다형성(g.158T>C)과 두록 동결정액의 운동학적 특성과의 연관성 분석

사수진; 이미진; 김기현; 우제석; 고준호; 김영주; 조은석

doi:10.12750/jet.2015.30.3.137

PLCz 유전자의 유전적 다형성(g.158T>C)과 두록 동결정액의 운동학적 특성과의 연관성 분석
Association Study Analysis of Phospholipase C Zeta (PLCz) Gene Polymorphism (g.158T>C) for Duroc Boar Post-Thawed Semen Motility and Kinematic Characteristics 원문보기

Journal of embryo transfer = 한국수정란이식학회지, v.30 no.3, 2015년, pp.137 - 142

사수진 (농촌진흥청 국립축산과학원) , 이미진 (농촌진흥청 국립축산과학원) , 김기현 (농촌진흥청 국립축산과학원) , 우제석 (농촌진흥청 국립축산과학원) , 고준호 (농촌진흥청 국립축산과학원) , 김영주 (농촌진흥청 국립축산과학원) , 조은석 (농촌진흥청 국립축산과학원)

Abstract ▼ AI-Helper

Cryopreservation of boar semen is continually researched in reproductive technologies and genetic resource banking in breed conservation. For evaluating the boar semen quality, sperm motility (MOT) is an important parameter because the movement of spermatozoa indicates active metabolism, membrane integrity and fertilizing capacity. Various researches have been trying to improve the quality of semen post-thawed in boar. Recently, polymorphism (g.158T>C) of phospholipase C zeta (PLCz) gene reported to be significant association with MOT. This study was conducted to evaluate the PLCz gene as a positional controlling for motility and kinematic characteristics of post-thawed boar semen. To results, The g.158 T>C SNP of PLCz was significantly associated with frozen semen motility and kinematic characteristics. g.158 T>C SNP was high significantly associated with MOT, VCL, VSL and VAP (p<0.0001, p=0.0002, p<0.0001 and p<0.0001, respectively). Therefore, we suggest that the intron region of the porcine PLCz, may be used as a molecular marker for Duroc boar post-thawed semen quality, although its functional effect was not defined yet. Whether the association is due to the candidate gene or not require further verification. Thus, it will be of interest to continue association studies in the regions surrounding those genes.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

따라서 본 연구에서는 돼지정액의 품질과 관련성인 높을 것이라고 판단되어지는 PLCz 유전자의 158번째의 염기를 확인하여 유전자형을 분석하였고, 본 연구에서 사용된 돼지 동결정액의 운동성 및 운동역학적 형질과 PLCz 유전자의 연관성 분석을 실시하였다.
본 연구에서는 이전에 보고되어 있는 PLCz 유전자의 SNP를 확인하여 유전자형을 분석하고, 두록 78두 동결정액의 운동학적 특성과 연관성을 분석하고자 하였다. PLCz 유전자의 intron 1 지역에서 염기서열 분석을 통하여 SNP를 확인한 결과, Fig.

제안 방법

5 μl의 정자샘플을 38℃로 가온된 pre-wormed markler counting chamber(SefiMedical Instruments, Israel)에 올려놓고 샘플 당 최소 100마리의 정자를 평가하였으며, 분석은 5회 이상 실시하였다.
Genomic DNA는 Wizard Genomic DNA Purification Kit를 사용하여 제조사의 방법을 약간 변형하여 분리하였다(Promega, Madison, WI, USA). Direct sequencing을 위하여 두록 수퇘지 78두의 DNA를 이용하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하였다. PCR은 10 pml의 primer, 0.
Genomic DNA는 Wizard Genomic DNA Purification Kit를 사용하여 제조사의 방법을 약간 변형하여 분리하였다(Promega, Madison, WI, USA). Direct sequencing을 위하여 두록 수퇘지 78두의 DNA를 이용하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하였다.
PCR 수행 후 염기서열 분석을 위하여 Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit V3.0(Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, USA)와 ABI PRISM® 3730 Genetic Analyzer(Life Technologies Corp.)를 이용하여 염기서열 분석을 하였고, SeqMan program(DNASTAR Inc., Madison, WI, USA)을 이용하여 SNP(Sngle nucleotide polymorphism)를 비교하여 유전자형을 결정하였다.
PCR 조건은 94℃에서 30초, 64℃에서 30초 그리고 72℃에서 45초를 수행하였고, DNA Engine Tetrad® 2 Thermal Cycler(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 총 35반복으로 PCR을 수행하였다.
PCR은 10 pml의 primer, 0.25 mM dNTP, 10× PCR buffer, 1.25 μ DNA polymerase(Genet Bio, Chungnam, Korea)와 100 ng의 DNA를 포함하여 20 μl의 부피에서 수행하였다.
5 μl의 정자샘플을 38℃로 가온된 pre-wormed markler counting chamber(SefiMedical Instruments, Israel)에 올려놓고 샘플 당 최소 100마리의 정자를 평가하였으며, 분석은 5회 이상 실시하였다. 각 정자 샘플의 전체 운동성(TMS, Total motile spermatozoa, %), 곡선속도(VCL, Curvilinear velocity, um/s), 직선속(VSL, Straightline velocity, um/s), 평균이동속도(VAP, Average path velocity), 직진성(LIN, e.g., the ratio between VSL and VCL), ALH(Amplitude of Lateral Head displacement)를 포함하는 운동학적 특성들을 측정했다. 두록 78두 동결정액에 대한 평가결과는 Table 1에 제시하였다.
동결을 위한 전처리과정으로 액상정액 샘플을 17℃ 조건하에서 15분 동안 800 × g로 원심분리를 실시하였다.

대상 데이터

5∼2년생의 성숙한 수태지를 사용했으며, 정액의 채취는 의빈대를 이용한 수압법을 이용하였다. 본 연구에 사용된 샘플은 정자 운동성과 형태학적으로 정상인 정자의 비율이 80% 이상인 사출정액만을 이용했다. 정액필터를 통해 1차적으로 걸러진 정액을 37℃ BTS(Beltsville thawing solution)와 1:1 비율로 희석하여 신속히 실험실로 운반하였다.
본 연구에서 공시축은 2011년에서 2015년까지 1.5∼2년생의 성숙한 수태지를 사용했으며, 정액의 채취는 의빈대를 이용한 수압법을 이용하였다.
수퇘지들은 농촌진흥청 국립축산과학원에서 균등한 먹이 및 취급 조건들에서 사육되었다. 본 연구에서 공시축은 2011년에서 2015년까지 1.

데이터처리

연관성분석은 SAS 9.13(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)의 generalized linear model(GLM)을 이용하였으며, 유전자형의 효과와 경제형질들에 대해 최소 유의차 검정으로 평균간 차이에 대한 유의성을 조사하였다. 통계분석에 이용한 모형은 다음과 같다.

이론/모형

정자 운동성(MOT, Motility)은 정자자동분석기(CASA, Computer-assisted semen analysis system; SAIS SI-100, Medical Supply, Korea)를 사용하여 평가되었다. 정자샘플은 BTS로 희석하여 30×10⁶ cells/ml 농도로 준비하였다.

성능/효과

MOT, VCL, VSL 그리고 VAP (p<0.0001, p=0.0002, p<0.0001 and p<0.0001, 각각)에서 높은 유의성을 보였고, ALH(p=0.0160)에서는 낮은 유의성을 확인할 수 있었다.
본 연구에서는 이전에 보고되어 있는 PLCz 유전자의 SNP를 확인하여 유전자형을 분석하고, 두록 78두 동결정액의 운동학적 특성과 연관성을 분석하고자 하였다. PLCz 유전자의 intron 1 지역에서 염기서열 분석을 통하여 SNP를 확인한 결과, Fig. 1과 같이 이전논문과 동일하게 158번째 염기에서 다형성을 확인할 수 있었다. 두록 78두의 대립유전자와 유전자형의 빈도를 확인한 결과, Table 2와 같이 TT, TC 및 CC 유전자형의 빈도는 각각 0.
T>C SNP은 운동성 및 운동학적 특성들의 거의 대부분과 상당한 연관성이 있었고, TT 유전자형을 가진 돼지가 TC 및 CC 유전자형을 가진 돼지보다 대부분의 형질 값들이 더 높았다.
1과 같이 이전논문과 동일하게 158번째 염기에서 다형성을 확인할 수 있었다. 두록 78두의 대립유전자와 유전자형의 빈도를 확인한 결과, Table 2와 같이 TT, TC 및 CC 유전자형의 빈도는 각각 0.72, 0.22 그리고 0.06이었다. 그리고 T 대립유전자가(0.
또한, 유전자 및 조직 특이적 발현 패턴의 발현 수준을 조절하는 인트론들의 역할에 관한 보고서들의 수가 증가하고 있다. 본 연구의 결과는 두록 돼지의 운동성에 관련하여 높은 유의성을 보였다. 하지만 이러한 연구들이 앞으로 품종 특이적인 효과와 다른 집단 크기에서도 연구들이 고려되어져야 할 것이다.

후속연구

하지만 이러한 연구들이 앞으로 품종 특이적인 효과와 다른 집단 크기에서도 연구들이 고려되어져야 할 것이다. 결론적으로 이러한 연구는 돼지의 동결정액의 품질을 결정할 수 있는 기초적인 자료로 활용 가능할 것이다.
본 연구의 결과는 두록 돼지의 운동성에 관련하여 높은 유의성을 보였다. 하지만 이러한 연구들이 앞으로 품종 특이적인 효과와 다른 집단 크기에서도 연구들이 고려되어져야 할 것이다. 결론적으로 이러한 연구는 돼지의 동결정액의 품질을 결정할 수 있는 기초적인 자료로 활용 가능할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	양돈산업에서 인공수정을 하는 이유는?	양돈산업에 있어 돼지번식의 주요 수단으로 사용되는 인공수정은 전 세계적으로 그 보급률이 매년 증가해오고 있으며, 국내의 돼지인공수정 보급율은 90%에 이르고 있다. 인공수정은 자연교배에 비해 질병의 위험을 최소화할 수 있을 뿐만 아니라, 유전능력이 우수한 씨수퇘지의 유전자를 효율적으로 전달할 수 있어 개량을 가속화할 수 있는 장점을 가진 매우 유용한 기술이다(Maes et al., 2008).
	양돈산업에서 정액동결 기술의 한계점은?	, 2000). 그러나 정액을 동결보존하는 과정에서 발생하는 저온충격, 삼투압 스트레스 및 동결보호제의 독성 등에 의해 동결-융해 후 정자의 운동성은 40% 수준이며, 일반적으로 돼지 인공수정에 사용되고 있는 액상정액과 비교하면 정액의 품질이 매우 낮게 나타난다(Johnson et al., 1981). 특히, 돼지의 정자는 타축종에 비해 세포막에 불포화지방산의 함량이 높아 저온충격에 매우 민감하게 반응하며, 이로 인해 돼지 정자는 동결-융해 후 운동성이 큰 폭으로 감소하는 것으로 알려져 있다(Mazur, 1984).
	양돈산업에서 동결정액의 장점은?	이러한 이유는 동결정액의 동결과 융해방법, 동결보존액, 정액의 주입시간, 주입횟수, 주입정자수, 동결정액의 보존형태, 동결정액 보존기간, 개체에 따른 동결성 및 품종간의 차이 등이 동결정액 실용화를 어렵게 하는 요인들로 작용하기 때문이다. 그럼에도 불구하고 액상정액에 비해 반영구적인 보존이 가능한 동결정액은 유전능력이 우수한 씨수퇘지 유전자원을 장기 보존할 수 있을 뿐 아니라, 씨수퇘지의 활용도를 높여 개량속도를 높이고, 유전인자(정액) 도입 시 전염성 질병의 전파를 방지할 수 있다는 장점이 부각되면서 많은 관심을 받고 있다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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