미세주입법에 의한 형질전환 마우스 제작에는 대량의 전핵기란을 필요로 한다. 본 실험에서는 심플한 형질전환 마우스 제작방법을 확립하기 위해 초급속 동결한 전핵기란을 공시했다. 초급속 동결법으로 동결한 전핵기 체외수정란 139개를 융해 후 공시하고, ${\beta}-actin/luc^+$ 융합유전자를 미세주입하였다. 주입 조작 후, 형태학적으로 정상적인 수정란 101개(72.6%)를 5마리의 수란암컷 마우스에 이식하였다. 그 결과, 이식한 모든 마우스가 임신하고, 최종적으로 15마리(14.8%)의 산자가 태어났다. 한편, 450개의 체외수정란에 대해 동일한 배아조작 후에 338개(75.1%)가 생존하고 14마리의 수란암컷 마우스에 이식 하였다. 그 중에 78%의 수정암컷 마우스가 임신하고, 54마리(19.1%)의 산자가 태어났다. 태어난 산자에 대해서는 southern blot 법에 의해 염색체 내의 도입유전자의 도입을 확인한 결과, 동결수정란 처리구와 체외수정란구에서 각각 6.6%(1/15), 5.5% (3/54)의 마우스에서 도입유전자의 도입이 확인되었다. 더욱이 두 처리구 전부의 형질전환 마우스의 미부조직에서 도입유전자인 루시페라제 유전자의 발현이 관찰되었다. 이상의 결과에 의해 체외수정란 초급속 동결보존법을 사용한 Tg 마우스 제작방법의 확립을 확인하였고, 이러한 결과들로부터 실험기간의 단축과 작업의 간소화에 크게 이바지할 것으로 사료된다.
미세주입법에 의한 형질전환 마우스 제작에는 대량의 전핵기란을 필요로 한다. 본 실험에서는 심플한 형질전환 마우스 제작방법을 확립하기 위해 초급속 동결한 전핵기란을 공시했다. 초급속 동결법으로 동결한 전핵기 체외수정란 139개를 융해 후 공시하고, ${\beta}-actin/luc^+$ 융합유전자를 미세주입하였다. 주입 조작 후, 형태학적으로 정상적인 수정란 101개(72.6%)를 5마리의 수란암컷 마우스에 이식하였다. 그 결과, 이식한 모든 마우스가 임신하고, 최종적으로 15마리(14.8%)의 산자가 태어났다. 한편, 450개의 체외수정란에 대해 동일한 배아조작 후에 338개(75.1%)가 생존하고 14마리의 수란암컷 마우스에 이식 하였다. 그 중에 78%의 수정암컷 마우스가 임신하고, 54마리(19.1%)의 산자가 태어났다. 태어난 산자에 대해서는 southern blot 법에 의해 염색체 내의 도입유전자의 도입을 확인한 결과, 동결수정란 처리구와 체외수정란구에서 각각 6.6%(1/15), 5.5% (3/54)의 마우스에서 도입유전자의 도입이 확인되었다. 더욱이 두 처리구 전부의 형질전환 마우스의 미부조직에서 도입유전자인 루시페라제 유전자의 발현이 관찰되었다. 이상의 결과에 의해 체외수정란 초급속 동결보존법을 사용한 Tg 마우스 제작방법의 확립을 확인하였고, 이러한 결과들로부터 실험기간의 단축과 작업의 간소화에 크게 이바지할 것으로 사료된다.
Many pronuclear stage eggs were used to generate transgenic mice (Tg) by microinjection. In this study, we used in vitro fertilized mouse eggs, followed by ultrarapid freezing to establish a simple procedure for production of Tg mice. We produced in vitro fertilized mouse eggs and cryopreserved them...
Many pronuclear stage eggs were used to generate transgenic mice (Tg) by microinjection. In this study, we used in vitro fertilized mouse eggs, followed by ultrarapid freezing to establish a simple procedure for production of Tg mice. We produced in vitro fertilized mouse eggs and cryopreserved them by ultrarapid freezing method. A total of 139 cryopreserved-thawed pronuclear eggs, of which 101 (72.6%) were survived following microinjection of chicken ${\beta}-actin$ promoter-driven firefly improved luciferase cDNA (${\beta}-act/luc^+$) and were transferred into 5 recipients. All recipients became pregnant and gave birth to a total of 15 (14.8%) pups. As a control, same DNA construction (${\beta}-act/luc^+$) was also injected into 450 in vitro fertilized eggs, of which 338 (75.1%) were survived and then were transferred into 14 recipients. Eleven (78%) mice became pregnant and littered a total of 54 (19.1%) pups. Southern blotting analysis of Tg mice indicated that one (1/15, 6.6%) and three (3/54, 5.5%) transgenic mice were production from cryopreserved and in vitro fertilized eggs, respectively. All Tg mice produced from both eggs showed the expression of improved luciferase gene. These results indicated that efficiency of produced of Tg mice from cryopreserved eggs was comparable to that from in vitro fertilized eggs. Furthermore, it is suggested that microinjection of transgene into in vitro fertilized eggs cryopreserved by ultrarapid freezing is an easy and conveniently method for production of Tg mice.
Many pronuclear stage eggs were used to generate transgenic mice (Tg) by microinjection. In this study, we used in vitro fertilized mouse eggs, followed by ultrarapid freezing to establish a simple procedure for production of Tg mice. We produced in vitro fertilized mouse eggs and cryopreserved them by ultrarapid freezing method. A total of 139 cryopreserved-thawed pronuclear eggs, of which 101 (72.6%) were survived following microinjection of chicken ${\beta}-actin$ promoter-driven firefly improved luciferase cDNA (${\beta}-act/luc^+$) and were transferred into 5 recipients. All recipients became pregnant and gave birth to a total of 15 (14.8%) pups. As a control, same DNA construction (${\beta}-act/luc^+$) was also injected into 450 in vitro fertilized eggs, of which 338 (75.1%) were survived and then were transferred into 14 recipients. Eleven (78%) mice became pregnant and littered a total of 54 (19.1%) pups. Southern blotting analysis of Tg mice indicated that one (1/15, 6.6%) and three (3/54, 5.5%) transgenic mice were production from cryopreserved and in vitro fertilized eggs, respectively. All Tg mice produced from both eggs showed the expression of improved luciferase gene. These results indicated that efficiency of produced of Tg mice from cryopreserved eggs was comparable to that from in vitro fertilized eggs. Furthermore, it is suggested that microinjection of transgene into in vitro fertilized eggs cryopreserved by ultrarapid freezing is an easy and conveniently method for production of Tg mice.
이러한 방법에는 전핵기 수정란을 동결보존하는 것으로 마우스의 콜로니를 대량유지가 필요 없고, 미세주입조작에 공시하는 수정란을 획득하기 위해서 실험과정 간소화가 가능해, 계획적인 실험과 실험방법의 효율화 등의 이점이 예상된다. 따라서 본 연구에서는 완만동결법과 비교해 조작이 용이하고, 시간적 제약이 없는 초급속 동결법에 의한 체외수정 유래의 전핵기 수정란의 동결보존을 실시하고, 융해 후에 이런 수정란을 이용해 효율적인 Tg 마우스 제작방법을 검토 및 확립을 위해 시도를 하였다.
대상 데이터
실험에 사용한 마우스는 Imamichi Institute of Animal Reproduction(Ibaraki, Japan)에서 구입하였다. 또한, 본 실험에서는 한 번에 대량의 전핵기란을 확보하기 위해 체외수정란을 이용하였다.
데이터처리
본 시험에서 얻어진 모든 자료들의 통계 분석은 Statistical Analysis System(SAS release ver. 8.2, 2002)의 General Linear Model(GLM) procedure를 이용하여 분산분석을 실시하였고, 처리구 간에 유의성은 Dincan’s multiple range-test(Duncan, 1955)를 이용하여 5% 수준에서 검정하였으며, 각 요인들의 상관관계의 유의성 검정은 Pearson’s correlation coefficient를 활용하였다.
성능/효과
초급속 동결수정란의 미세조작 후, 그 생존율과 이식 후의 산자 생산율은 체외수정란을 이용한 처리구와 비교해서 통계 상의 유의적인 차이는 없고, 오히려 태어난 산자수에 대해서 Tg 마우스의 제작효율도 거의 차이가 나지 않음을 확인하였다. 이에 반해 Leibo 등(1991)의 보고에 의하면 완만 동결법을 이용해 동결한 배아 처리구에 있어서도 Tg 마우스의 제작효율은 체외수정란구와 거의 동일한 결과를 얻었지만, 산자 생산율이 낮다는 것이 보고되었다.
후속연구
이에 반해 Leibo 등(1991)의 보고에 의하면 완만 동결법을 이용해 동결한 배아 처리구에 있어서도 Tg 마우스의 제작효율은 체외수정란구와 거의 동일한 결과를 얻었지만, 산자 생산율이 낮다는 것이 보고되었다. 따라서 초급속 동결법으로 동결한 전핵기란을 공시한 경우, 완만동결법과 비교해서 미세조작 후의 높은 발생률을 얻기 위해 본 실험에서 사용한 초급속 동결법은 효율적으로 Tg 마우스 제작에 활용할 가능성이 기대된다. 또한, 본 실험에서 유전자의 도입이 확인된 Tg 마우스 전 개체에 루시페라제 활성을 확인한 결과, 개체 간에 있어 도입유전자의 발현량에 차이가 확인되었다.
, 1986). 이상의 결과들로부터 체외수정란 초급속 동결법을 사용한 Tg 마우스 제작방법의 확립을 확인하였고, 이러한 결과들로부터 실험기간의 단축과 작업의 간소화에 크게 이바지할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
동결보존기술을 이용한 Tg마우스 제작 기술은 무엇이 있는가?
그래서 Tg 마우스 제작을 보다 효율적으로 하기 위해서는 미세주입법과 함께 동결보존기술을 잘 조합한 새로운 방법이 연구되었다. 현재까지 완만 동결법(Leibo et al., 1991), 유리화 동결방법(Tada et al., 1995) 그리고 초급속 동결법(Anzai et al., 1994)을 이용해 동결 보존한 전핵기 수정란을 사용해서 Tg 마우스를 제작한 보고가 있었다. 이러한 방법에는 전핵기 수정란을 동결보존하는 것으로 마우스의 콜로니를 대량유지가 필요 없고, 미세주입조작에 공시하는 수정란을 획득하기 위해서 실험과정 간소화가 가능해, 계획적인 실험과 실험방법의 효율화 등의 이점이 예상된다.
전핵기 수정란 미세 주입법에 의한 형질 전환 마우스를 사용해 가능하게 된 것은 무엇인가?
, 1980). 이 기술을 이용해 염색체 게놈에 외래유전자를 도입시킨 형질전환 마우스(이하 Tg 마우스)를 제작해 특정 유전자의 생리적인 기능 등을 생체 내에서 해석하는 것이 가능하게 되었다(Brinster et al., 1982; Palmiter et al.
초급속 동결수정란의 미세 조작 후 결과는 체외 수정란의 마우스 제작 효율과 어떤 차이가 있는가?
초급속 동결수정란의 미세조작 후, 그 생존율과 이식 후의 산자 생산율은 체외수정란을 이용한 처리구와 비교해서 통계 상의 유의적인 차이는 없고, 오히려 태어난 산자수에 대해서 Tg 마우스의 제작효율도 거의 차이가 나지 않음을 확인하였다. 이에 반해 Leibo 등(1991)의 보고에 의하면 완만 동결법을 이용해 동결한 배아 처리구에 있어서도 Tg 마우스의 제작효율은 체외수정란구와 거의 동일한 결과를 얻었지만, 산자 생산율이 낮다는 것이 보고되었다.
참고문헌 (16)
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Brinster RL, Chen HY, Warren R, Sarthy A and Palmiter RD. 1982. Regulation of metallothionein-thymidine kinase fusion plasmids injected into mouse eggs. Nature. 296:39-42.
Fregien N and Davidson N. 1990. Activating elements in the promoter region of the chicken beta-actin gene. Gene. 48:1-11.
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Matsumoto K, Anzai M, Nakagata N, Takahashi A, Takahashi Y and Miyata K. 1994. Ont of paternal gene activation in early mouse embryos fertilized with transgenic mouse sperm. Mol. Reprod. Dev. 39:136-140.
Nakagata N. 1990. Cryopreservation of unfertilized mouse oocytes from inbred strains by ultrarapid freezing. Exp. Anim. 39:303-305.
Palmiter RD, Brinster RL, Hammer RE, Trumbauer ME, Rosenfeld MG, Birnberg NC and Evans RM. 1982. Dramatic growth of mice that development from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes. Nature. 300:611-615.
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Wilmut I. 1972. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. II. Nov. 11:1071-1079.
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