Soybean mosaic virus(SMV)는 potyvirus 속에 속하며, 모자이크, 괴사, 기형 등의 병징을 야기하고 국내에서는 11개 계통(G1 to G7, G5H, G6H, G7H, G7a)이 보고되어있다. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP) 방법은 등온에서 유전자 증폭이 가능하게 하며, 이 방법은 PCR 과정이나 전기영동 없이도 바이러스에 감염된 식물을 검출할 수 있는 이점이 있다. RT-LAMP의 최적반응 조건은 $58^{\circ}C$, 60분으로 확인되었다. 특이성 검정을 위해 콩에서 발생하는 여러 바이러스들과 보유중인 SMV의 9 계통에서 그 특이성을 확인하였다. 그 결과 SMV에 대한 RT-LAMP primer들의 종 특이성이 확인되었으며, SMV의 계통들에 대해서도 적용이 가능한 것으로 확인되었다. 항온수조와 heating block과 같은 간편한 등온 장치에서 재현성을 확인하기 위해 Thermocycler 기기와 비교하여 증폭 여부를 확인한 결과 반응의 차이는 나타나지 않았다. RTLAMP 반응 이후, 반응물을 전기영동과 SYBR Green I을 이용하여 자연광과 UV광에서 증폭 여부를 확인하였다. 그 결과 전기 영동, 자연광, portable UV light와 UV transilluminator에서 모두 반응이 확인되었다.
Soybean mosaic virus(SMV)는 potyvirus 속에 속하며, 모자이크, 괴사, 기형 등의 병징을 야기하고 국내에서는 11개 계통(G1 to G7, G5H, G6H, G7H, G7a)이 보고되어있다. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP) 방법은 등온에서 유전자 증폭이 가능하게 하며, 이 방법은 PCR 과정이나 전기영동 없이도 바이러스에 감염된 식물을 검출할 수 있는 이점이 있다. RT-LAMP의 최적반응 조건은 $58^{\circ}C$, 60분으로 확인되었다. 특이성 검정을 위해 콩에서 발생하는 여러 바이러스들과 보유중인 SMV의 9 계통에서 그 특이성을 확인하였다. 그 결과 SMV에 대한 RT-LAMP primer들의 종 특이성이 확인되었으며, SMV의 계통들에 대해서도 적용이 가능한 것으로 확인되었다. 항온수조와 heating block과 같은 간편한 등온 장치에서 재현성을 확인하기 위해 Thermocycler 기기와 비교하여 증폭 여부를 확인한 결과 반응의 차이는 나타나지 않았다. RTLAMP 반응 이후, 반응물을 전기영동과 SYBR Green I을 이용하여 자연광과 UV광에서 증폭 여부를 확인하였다. 그 결과 전기 영동, 자연광, portable UV light와 UV transilluminator에서 모두 반응이 확인되었다.
Soybean mosaic virus (SMV) is a prevalent pathogen that causes significant yield reduction in soybean production worldwide. SMV belongs to potyvirus and causes typical symptoms such as mild mosaic, mosaic and necrosis. SMV is seed-borne and also transmitted by aphid. Eleven SMV strains, G1 to G7, G5...
Soybean mosaic virus (SMV) is a prevalent pathogen that causes significant yield reduction in soybean production worldwide. SMV belongs to potyvirus and causes typical symptoms such as mild mosaic, mosaic and necrosis. SMV is seed-borne and also transmitted by aphid. Eleven SMV strains, G1 to G7, G5H, G6H, G7H, and G7a were reported in soybean varieties in Korea. A reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) method allowed one-step detection of gene amplification by simple procedure and needed only a simple incubator for isothermal template. This RT-LAMP method allowed direct detection of RNA from virus-infected plants without thermal cycling and gel electrophoresis. In this study, we designed RT-LAMP primers named SML-F3/B3/FIP/BIP from coat protein gene sequence of SMV. After the reaction of RT-LAMP, products were identified by electrophoresis and with the detective fluorescent dye, SYBR Green I under daylight and UV light. Optimal reaction condition was at $58^{\circ}C$ for 60 min and the primers of RT-LAMP showed the specificity for nine SMV strains tested in this study.
Soybean mosaic virus (SMV) is a prevalent pathogen that causes significant yield reduction in soybean production worldwide. SMV belongs to potyvirus and causes typical symptoms such as mild mosaic, mosaic and necrosis. SMV is seed-borne and also transmitted by aphid. Eleven SMV strains, G1 to G7, G5H, G6H, G7H, and G7a were reported in soybean varieties in Korea. A reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) method allowed one-step detection of gene amplification by simple procedure and needed only a simple incubator for isothermal template. This RT-LAMP method allowed direct detection of RNA from virus-infected plants without thermal cycling and gel electrophoresis. In this study, we designed RT-LAMP primers named SML-F3/B3/FIP/BIP from coat protein gene sequence of SMV. After the reaction of RT-LAMP, products were identified by electrophoresis and with the detective fluorescent dye, SYBR Green I under daylight and UV light. Optimal reaction condition was at $58^{\circ}C$ for 60 min and the primers of RT-LAMP showed the specificity for nine SMV strains tested in this study.
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문제 정의
후)사용할">사용 할 수 있는 기기가 필요하다. 따라서 항온수조와 heating block과 같은 간편한 등온 장치에서 재현성을 확인하기 위해 Thermocycler 기기와 비교하여 반응 여부를 확인하였다. 세 가지 기기에서 58ºC, 60분 동안 실시된 반응을 전기영동으로 확인한 결과 모두 동일한 반응 결과를
본 연구에서는 특이성, 정밀성, 간편성을 갖춘 분자기법 중 하나인 RT-LAMP 방법을 이용하여 콩의 중요 바이러스인 SMV의 감염 유무를 신속하게 확인할 수 있는 진단법을 개발하고자 하였다.
제안 방법
html)를 이용하여 RT-LAMP용 primer들을 제작하였다. 4가지로 이루어진 SMV RT-LAMP용 primer들에서 SML-FIP와 SML-BIP는 loop를 형성하는 염기서열 부분 TTTT spacer를 포함하여 각각 42 nt로 설계되었으며, SML-F3와 SML-B3는 inner primer들의 바깥쪽에 위치하도록 각각 18 nt, 19 nt로 설계하였다(Table 1). 설계된 primer들은 Bioneer(Daejeon, Korea)에 주문 의뢰하여 합성하였으며, inner primer들에 대해서는 PAGE 정제된 것을 사용하였다.
RT-LAMP 반응은 RT-LAMP kit(Eiken Chemicals Co., Japan)와 반응액을 조제하는 방식으로 반응을 실시하였다. RT-LAMP kit의 사용은 제조사의 방법에 따라 실시하였다.
RT-LAMP는 total RNA를 주형으로 사용하는 것으로 전체 RNA내에서 특정 mRNA의 농도를 확인하기 위하여, SMV의 RT-LAMP로 증폭되는 부위를 포함하는 DNA clone을 주형으로 하여 민감도를 확인하였다. DNA clone 합성에 이용된 primer는 SM_LN2(5’-GTA CAA TGC AGT TAA AGA TGA ATA3’)과 SM_LC2 (5’-TCT CAA ATT CCT CAG TAG TCC ATA–3’)이다.
RT-LAMP는 total RNA를 주형으로 사용하는 것으로 전체 RNA내에서 특정 mRNA의 농도를 확인하기 위하여, SMV의 RT-LAMP로 증폭되는 부위를 포함하는 DNA clone을 주형으로 하여 민감도를 확인하였다. DNA clone 합성에 이용된 primer는 SM_LN2(5’-GTA CAA TGC AGT TAA AGA TGA ATA3’)과 SM_LC2 (5’-TCT CAA ATT CCT CAG TAG TCC ATA–3’)이다.
RT-LAMP의 최적 온도를 확인하기 위하여 반응온도를 48-66ºC로 각기 등온 조건을 유지하면서 실시하였다.
후)등 온">등온 장치에서 재현성을 확인하기 위해 Thermocycler 기기와 비교하여 증폭 여부를 확인한 결과 반응의 차이는 나타나지 않았다. RTLAMP 반응 이후, 반응물을 전기영동과 SYBR Green I을 이용하여 자연광과 UV광에서 증폭 여부를 확인하였다. 그 결과 전기영동, 자연광, portable UV light와 UV transilluminator에서 모두 반응이 확인되었다.
SYBR Green I(Lonza, USA)을 이용하여 반응 tube 내에서 색의 변화를 통해 증폭 여부를 육안으로 확인하였다. 색의 변화는 자연광, portable UV light(Spectronic, USA), UV transilluminator(Corebiosystem, Korea)에서 반응 여부를 확인하였다.
primer의 종 특이성 확인을 위하여 콩에서 발생하는 바이러스들에 대해 반응 여부를 확인하였다.
가장">분석하였다. 가장 변이가 적은 외피단백질 염기서열 정보를 이용하여 LAMP primer designing software인 Primer Explorer(http://primerexplorer.jp/e/index.html)를 이용하여 RT-LAMP용 primer들을 제작하였다. 4가지로 이루어진 SMV RT-LAMP용 primer들에서 SML-FIP와 SML-BIP는 loop를 형성하는 염기서열 부분 TTTT spacer를 포함하여 각각 42 nt로 설계되었으며, SML-F3와 SML-B3는 inner primer들의 바깥쪽에 위치하도록 각각 18 nt, 19 nt로 설계하였다(Table 1).
후)반응 시간">반응시간 이후에는 80ºC에서 10분간 유지시킨 후 반응을 종료하였다. 각 LAMP 반응이 끝나면 증폭산물들은 2% agarose gel에서 전기영동(HOEFER, USA)하여 EtBr로 염색하여 확인하였다.
후)종특이성에">종 특이성에 이용된 6종의 바이러스는 SMV를 포함하여 Soybean yellow mottle mosaic virus(SYMMV), Soybean yellow common mosaic virus(SYCMV), Peanut stunt virus(PSV), Bean common mosaic virus(BCMV)와 Peanut mottle virus(PeMoV)이다. 또한 보유 중인 SMV 9계통 G1, G2, G3, G5, G5H, G6, G6H, G7과 G7H에 대해서 그 특이성을 확인하였다. 또한, RT-LAMP에 이용되는 네 개의
또한 보유 중인 SMV 9계통 G1, G2, G3, G5, G5H, G6, G6H, G7과 G7H에 대해서 그 특이성을 확인하였다. 또한, RT-LAMP에 이용되는 네 개의 특이 primer들에 대한 요구 특이성을 확인하기 위하여 네 개의 primer들 중 하나 혹은 두 개 이상을 제외시켜 조성하고 정상적인 증폭산물과 비교하여 반응 여부를 확인하였다.
7). 또한, SYBR Green I을 이용하여 반응 tube내에서 색에 의한 반응 여부를 확인하였다. 색의 변화는 자연광, portable UV light와 UV transilluminator에서 그 반응을 확인하였다.
반응액 조성은 바이러스에 감염된 시료의 total RNA 1 ml와 40 pM inner primers, 5 pM outer primers, 8 U Bst DNA polymerase large fragment(New England Biolabs, USA), 1× ThermoPol Reaction Buffer [20 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1%Triton X-100,New England Biolabs, USA], 10 mM dNTP, 5% DMSO, DW로 총 20 ml의 반응액을 조성하였다.
SYBR Green I(Lonza, USA)을 이용하여 반응 tube 내에서 색의 변화를 통해 증폭 여부를 육안으로 확인하였다. 색의 변화는 자연광, portable UV light(Spectronic, USA), UV transilluminator(Corebiosystem, Korea)에서 반응 여부를 확인하였다.
후)반응tube내에서">반응 tube내에서 색에 의한 반응 여부를 확인하였다. 색의 변화는 자연광, portable UV light와 UV transilluminator에서 그 반응을 확인하였다. 자연광에서도 그
식물체 100 mg을 Lysis 용액(iNtRON bio., Korea)을 이용하여 제공자의 방법에 따라 분리하였다. 전체 RNA는 최종적으로 30 ml의 elution buffer에 녹여 RT-LAMP와 RT-PCR에 이용하였다.
이 DNA clone을 주형으로 1×100부터 1×10-7까지 단계적으로 희석하여 RT-LAMP와 RT-PCR을 수행하여 민감도를 비교 확인하였다.
4). 이번 실험에서 이용된 primer들의 경우 SMV의 외피 단백질을 기초로 하여 설계되었다. SMV의 외피단백질 유전자의 경우
후)종특이적">종 특이적 primer 선발을 위하여 NCBI GeneBank에 등록된 SMV의 11개 계통 G1(Accession no. FJ640977), G2(S42280), G3(FJ640978), G4(FJ640979), G5(AY294044), G6(FJ640980), G7(AY216010), G5H(FJ376388), G6H(FJ640981), G7A(FJ640982), G7H(AY294045)와 미국에서 분리된 SMV 계통 TNP(HQ845735)의 유전정보 염기서열을 DNASTAR(DNASTAR, Inc., USA) 소프트웨어를 이용하여 비교 분석하였다. 가장 변이가 적은 외피단백질
최소 반응시간을 확인하기 위하여 반응시간을 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120분으로 하여 증폭 여부를 확인하였다. 최소 30분 이상의
최적 반응 온도와 시간을 확인하기 위하여 온도는 48-66ºC, 시간은 10-120분으로 변화를 주어 반응을 실시하였다.
후)특이성검정을">특이성 검정을 위해 콩에서 발생하는 여러 바이러스들과 보유중인 SMV의 9 계통에서 그 특이성을 확인하였다. 그 결과 SMV에 대한 RT-LAMP primer들의
대상 데이터
본 연구에서 사용된 SMV는 2013년도 전국 주요 콩 재배지에서 채집된 시료와 보유 중인 9개의 SMV 계통을 반응에 이용하였다. 채집된 시료와 분양받은 시료는
4가지로 이루어진 SMV RT-LAMP용 primer들에서 SML-FIP와 SML-BIP는 loop를 형성하는 염기서열 부분 TTTT spacer를 포함하여 각각 42 nt로 설계되었으며, SML-F3와 SML-B3는 inner primer들의 바깥쪽에 위치하도록 각각 18 nt, 19 nt로 설계하였다(Table 1). 설계된 primer들은 Bioneer(Daejeon, Korea)에 주문 의뢰하여 합성하였으며, inner primer들에 대해서는 PAGE 정제된 것을 사용하였다.
이론/모형
, Japan)와 반응액을 조제하는 방식으로 반응을 실시하였다. RT-LAMP kit의 사용은 제조사의 방법에 따라 실시하였다. 반응액 조성은 바이러스에 감염된 시료의 total RNA 1 μl와 40 pM inner primers, 5 pM outer primers, 8 U Bst DNA polymerase large fragment(New England Biolabs, USA), 1× ThermoPol Reaction Buffer [20 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.
성능/효과
후)계통간">계통 간 변이가 크지 않으며, 검정한 9계통 모두에서 그 반응의 특이성이 확인되어 모든 계통에 적용하여도 가능할 것으로 예상된다. 4가지로 이루어진 SMV의 RT-LAMP용 primer들에 대한 요구 특이성을 확인하기 위하여 primer를 하나 또는 두 개를 제외하여 조성한 후 반응을 확인한 결과 4개의 primer 들이 포함된 positive control에서만 증폭이 확인되었다. 이는 SMV의 RT-LAMP 반응에서 4개의 primer들이 모두 있어야 함을
51ºC부터63℃의 범위에서 증폭이 가능한 것으로 확인되었으며, 최적의 반응을 보인 온도는 57-60ºC로 확인되었다(Fig. 1).
Primer들의 종 특이성 확인을 위하여 콩에서 발생하는 주요 바이러스 6종에 대하여 반응 여부를 확인한 결과 SMV에서만 반응이 확인되어 SMV의 RT-LAMP 진단에 특이적인 primer들로 확인되었다(Fig. 3). 또한 보유 중인 SMV의 9계통 G1, G2, G3, G5, G5H, G6, G6H, G7와 G7H에 대해서 그 특이성이
RT-PCR의 검출 한계는 1×10-4정도로 RT-LAMP의 민감도가 10배 높은 것으로 확인되었다 (Fig. 6B).
후)외피단백질을">외피 단백질을 기초로 하여 설계되었다. SMV의 외피단백질 유전자의 경우 계통 간 변이가 크지 않으며, 검정한 9계통 모두에서 그 반응의 특이성이 확인되어 모든 계통에 적용하여도 가능할 것으로 예상된다. 4가지로 이루어진 SMV의 RT-LAMP용 primer들에 대한
후)9계통에서">9 계통에서 그 특이성을 확인하였다. 그 결과 SMV에 대한 RT-LAMP primer들의 종 특이성이 확인되었으며, SMV의 계통들에 대해서도 적용이 가능한 것으로 확인되었다. 항온수조와 heating block과 같은 간편한
RTLAMP 반응 이후, 반응물을 전기영동과 SYBR Green I을 이용하여 자연광과 UV광에서 증폭 여부를 확인하였다. 그 결과 전기영동, 자연광, portable UV light와 UV transilluminator에서 모두 반응이 확인되었다.
3). 또한 보유 중인 SMV의 9계통 G1, G2, G3, G5, G5H, G6, G6H, G7와 G7H에 대해서 그 특이성이 확인되었다(Fig. 4). 이번 실험에서 이용된 primer들의 경우 SMV의
세 가지 기기에서 58ºC, 60분 동안 실시된 반응을 전기영동으로 확인한 결과 모두 동일한 반응 결과를 나타내었다(Fig. 7).
이 DNA clone을 주형으로 1×100부터 1×10-7까지 단계적으로 희석하여 RT-LAMP와 RT-PCR을 수행한 결과 RT-LAMP는 1×10-5까지 검출이 가능한 것으로 확인되었다(Fig. 6A).
색의 변화는 자연광, portable UV light와 UV transilluminator에서 그 반응을 확인하였다. 자연광에서도 그 증폭여부의 확인이 충분히 가능하나 portable UV light와 UV transilluminator를 이용할 경우 확실한 반응여부를 확인할 수 있었다(Fig. 8). 하지만 현장에
후)반응 시간을">반응시간을 확인하기 위하여 반응시간을 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120분으로 하여 증폭 여부를 확인하였다. 최소 30분 이상의 반응시간이 주어질 때 반응이 확인되었으며, 60분 이상이면 최적의 반응을 나타내는 것으로 확인되었다(Fig. 2). 이후에 진행된 모든 반응 시간은 60분으로 실시되었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
콩모자이크바이러스의 전염 경로는?
콩의 중요 바이러스인 콩모자이크바이러스(Soybean mosaic virus, SMV)는 Potyviridae 과, Potyvirus 속에 속하는 바이러스로 진딧물을 통해 충매전염 되며, 콩에서 최대 43%의 종자전염이 이루어지는 것으로 보고되어 있다. 이 바이러스는 콩 생산량과 직접적으로 관련 있는 꼬투리 수의 감소, 꼬투리 당 종자수의 감소, 종자의 크기 및 중량의 감소와 콩 껍질의 얼룩생성 등을 초래한다(Domier 등, 2007, 2011).
RT-LAMP 방법의 장점은?
RNA 바이러스를 검출하기 위해서는 역전사 과정이 수반 되기 때문에 일반 DNA 바이러스를 검출하는 것보다 더 많은 시간이 소모된다. 하지만, RT-LAMP는 LAMP와 마찬가지로 등온에서 RT과정과 LAMP 반응이 동시에 수행함으로서 진단 시간을 현저히 줄일 수 있는 장점이 있어 이미 다른 분야에서는 RTLAMP가 적용된 바 있다(Fukuta 등, 2003; Parida 등, 2004). 또한 일정한 온도만 유지가 된다면 반응이 이루어지기 때문에 등온 유지가 가능한 항온 수조나 heating block 등 저가의 장비에서도 반응이 가능하여 고가의 Thermocycler 장비가 필요하지 않다. 그리고 SYBR Green I을 사용하여 전기영동없이 육안확인이 가능하기 때문에 유해한 ethidium bromide(EtBr)를 사용하지 않고, 현장 및 기타 어느 장소에서도 병원체에 대한 진단이 가능한 장점을 가지고 있다.
콩이란?
콩(Glycine max)은 장미목(Rosales) 콩과(Leguminosae)에 속하는 한해살이 쌍떡잎식물로 한반도를 포함한 아시아 동북부 지역이 원산지로 알려져 있으며, 전 세계적으로 550속 13,000종, 우리나라에서는 36속 92종이 자생하고 있다. 콩은 단백질과 지방 공급원으로 예로부터 중요시 되는 작물이며, 현재는 공업용 소재로도 각광받고 있는 작물이다(Ann, 2012).
참고문헌 (11)
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Domier, L. L., Steinlage ,T. A., Hobbs, H. A., Wang, Y., Herrera-Rodriguez, G., Haudenshield, J. S., McCoppin, N. K. and Hartman, G. L. 2007. Similarities in seed and aphid transmission among Soybean mosaic virus isolates. Plant Dis. 91: 546-550.
Domier, L. L., Hobbs, H. A., McCoppin, N. K., Bowen, C. R., Steinlage, T. A., Chang, S. Y., Wang, Y. and Hartman, G. L. 2011. Multiple loci condition seed transmission of Soybeanmosaic virus (SMV) and SMV-induced seed coat mottling in soybean. Phytopathology 101: 750-756.
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Seo, J. K., Ohshima, K., Lee, H. G., Son, M., Choi, H. S., Lee, S. H., Sohn, S. H. and Kim, K. H. 2009. Molecular variability and genetic structure of the population of Soybean mosaic virus based on the analysis of complete genome sequences. Virol. J. 393: 91-103.
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