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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 ICuGI DB에 공시되어 있는 수박의 EST-SSR에 대한 PCR Primer 염기서열을 선발하여 수박 EST-SSR 마커의 타 박과 주요 작물(오이, 참외, 멜론, 호박)에 적용 가능성을 알아보고, 박과 종의 F1 품종과 계통 간 유연관계를 분석하고자 수행되었다.
제안 방법
- EST-SSR primer set의 PCR 증폭 산물들은 1차적으로 아가로스젤 전기영동을 통해 확인하였다. 전기영동은 2.
- PCR 조건은 95°C에서 15초간, 60°C에서 30초간 (2-10cycle 동안 각 cycle 간 0.5°C 감소), 72°C에서 30초간 10cycle, 95°C에서 15초간, 55°C에서 30초간, 72°C에서 1분간 35cycle의 touch-down PCR 단계를 거쳐 반응시켰다.
- Pellet이 완전히 건조되면 0.1 M Tris 200µL를 넣어 용해시키고 추출한 DNA는 Nanodrop 1000(Thermo Scientific, USA) 분광광도계로 정량분석을 하였다.
- 잡종 품종이 주를 이루는 육종 사업에서 넓은 유전적 배경을 파악할 수 있는 중요한 연구 분야이다. 과거 시설의 필요와 많은 시간이 투자되고 환경적인 영향에 의해 유전적 판별에 오류가 발생할 수 있는 표현형(phenotype)의 차이를 이용하였다. 그러나 유전자형(genotype)을 통하여 표현형을 판별하는 방법인 분자 표지(molecular marker)는 시간과 장소의 구애를 받지 않고 좀 더 정확한 유전정보를 얻을 수 있다.
- 마커 검정을 위한 PCR용액의 조성은 genomic DNA 20ng, forward와 reverse primer 각각 0.5µM, 10X PCR buffer, 0.2µM dNTPs, 0.6 U Taq polymerase(Solgent, Korea), 그리고 나머지는 3차 증류수를 충당하여 총 반응 용액량을 20µL 로 하였다.
- 새로운 1.5µL micro-centrifuge tube에 5µL glycogen solution (5mg･mL-1)과 600µL isopropanol을 넣은 후 원심분리시킨 tube의 상층액을 덜어서 새로운 튜브에 넣어주고 잘 혼합해준 뒤 10분간 14,240 × g으로 원심분리시켜 주었다.
- 합성한 primer set 중 1차 DNA 분석을 통해 대립유전자 특이적 PCR 증폭이 가능하고 식물 시료 간 다형성(polymorphism)을 보이는 primer set을 선발하였다. 선발된 primer set을 이용하여 2차 DNA 분석을 통해 보다 다양한 박과 식물시료의 유전자형 분석 및 유연관계 분석을 수행하였다.
- 아가로스젤 전기영동을 통해 PCR 증폭이 확인된 PCR 산물들에 대해서는 Fragment Analyzer™(Advanced Analytical Technologies, USA)을 이용하여 보다 정밀한 유전자형 분석을 수행하였다(Fig. 1).
- EST-SSR primer set의 PCR 증폭 산물들은 1차적으로 아가로스젤 전기영동을 통해 확인하였다. 전기영동은 2.5% 아가로스젤을 이용하여 TAE buffer 내에서 100V로 2시간 실시하였고, 분리된 PCR 생성물은 ethidium bromide를 이용 하여 염색한 후 UV light 하에서 관찰하였다.
- org)에 공시된 수박의 WMU unigene을 토대로 총 650개의 primer set를 대상으로 선발하였으며, 이 중 120개의 primer set을 합성(Bioneer, daejeon, Korea)하였다. 합성한 primer set 중 1차 DNA 분석을 통해 대립유전자 특이적 PCR 증폭이 가능하고 식물 시료 간 다형성(polymorphism)을 보이는 primer set을 선발하였다. 선발된 primer set을 이용하여 2차 DNA 분석을 통해 보다 다양한 박과 식물시료의 유전자형 분석 및 유연관계 분석을 수행하였다.
대상 데이터
- ), 호박 F1 3 품종[(Cucurbita moschata(Duch. ex Lam.) Duch. & Poir, Cucurbita maxima Duch., Cucurbita pepo L.)], 멜론 F1 1 품종(Cucumis melo var. cantalupensis Naudin.), 참외 F1 1 품종(Cucumis melo var. conomon Makino.), 오이 F1 1 품종(Cucumis sativus L.) 등 총 8점의 식물시료를 사용하였다(Table 1).
- ) 등 총 8점의 식물시료를 사용하였다(Table 1). 박과 작물 간 유연관계 분석을 위한 2차 DNA 분석 시료로는 수박 3 야생종 계통, F1 6 품종 총 9점, 호박 F1 4 품종, 오이 F1 5 품종, 멜론 F1 2 품종과 2 육성계통, 참외 F1 2 품종 등 총 24점의 식물시료가 사용되었다(Table 2).
- 실험에 사용된 EST-SSR primer의 염기서열 정보는 International Cucurbit Genomics Initiative database(ICuGI, http:// www.icugi.org)에 공시된 수박의 WMU unigene을 토대로 총 650개의 primer set를 대상으로 선발하였으며, 이 중 120개의 primer set을 합성(Bioneer, daejeon, Korea)하였다. 합성한 primer set 중 1차 DNA 분석을 통해 대립유전자 특이적 PCR 증폭이 가능하고 식물 시료 간 다형성(polymorphism)을 보이는 primer set을 선발하였다.
이론/모형
- 는 각각의 유전자형에서 나타나는 단편의 총 개수를 의미한다. 군집분석(cluster analysis)은 Nei-Li similarity 값을 기반으로 비가중 산술 결합법(UPGMA, unweighted pair group method on arithmetic averages) 방법을 이용하여 분석하였다. 모든 통계 분석에는 NTSYS-PC version 2.
- 증폭된 384개 PCR 밴드와 Nei-Li similarity index를 이용 하여 짝유사행렬(Pairwise similarity matrix)을 작성하였다 (Table 4). 작성된 짝유사행렬에서 보여진 유사도의 범위는 0.
성능/효과
- Clade II는 ‘농우조생풋’[Cucurbita moschata(Duch. ex Lam.) Duch. & Poir.], ‘단밤’(Cucurbita maxima Duch.), ‘태양 쥬키니’(Cucurbita pepo L.), ‘흑종’(Cucurbita ficifolia Bouche.) 로 구성되었으며 동양계 품종인 ‘농우조생풋’과 서양계 품종인 ‘단밤’이 0.42의 유사도를 보이며 하위그룹 II-1을 이루었고 쥬키니계 품종인 ‘태양쥬키니’와 대목계 품종인 ‘흑종’ 이 0.51의 유사도를 보이며 하위그룹 II-2를 이루었다.
- PCR 증폭 산물의 크기 ± 2 bp 오차 범위 내에 있을 경우 동일한 유전자형으로 간주하고 증폭 산물이 명확한 것만 판독하였다.
- 가장 높은 유사도를 보인 것은 크림슨계 수박 품종인 ‘Charleston Gray’와 무지계 수박 품종인 ‘화보’로 0.84의 값을 나타내었으며, 반면에 가장 낮은 유사도를 보인 것은 대목계 호박 F1인 ‘흑종’과 무지계 수박 품종인 ‘화보’로 0.10의 값을 나타내었다.
- 선발된 49개의 primer set을 24개의 2차 식물시료에 대해 PCR 검정과 Fragment Analyzer를 이용한 전기영동 및 유전자형 분석 결과, 총 382개의 PCR 밴드가 확인되었다. 가장 많은 수와 가장 적은 수의 다형성 PCR 밴드를 나타낸 primer set 는 WMU15338과 WMU15818로 각각 16개와 2개였으며, 한 primer set당 평균 다형성 PCR 밴드 수는 7.8개였다. 각 primer set의 PIC 값은 다양하였는데, 이 중 46개의 primer set이 0.
- 이와 같이 오이와 멜론은 수박과 호박 등 타 종에 비하여 유전적으로 매우 유사한 종임을 본 연구에서도 확인할 수 있었다. 멜론과 오이 품종군은 유사도 0.37에서 두 개의 독립된 군으로 나누어졌으며, 멜론군(I-2a)은 다시 유사도 0.57에서 일반 멜론(Cucumis melo var. cantalupensis) (I-2a-1)과 오리엔탈 멜론(참외, Cucumis melo var. conomon) (I-2a-1)으로 구분되었다. Silberstein 등(Yi et al.
- 5 이상의 값을 보였다(Table 3). 사용된 49개 primer set의 평균 PIC 값은 0.754였으며, 가장 높은 PIC 값을 보인 primer set은 WMU2826으로 0.904, 가장 낮은 PIC 값을 보인 primer set은 WMU15818로 0.100이었다.
- 8%)였다. 선발된 49개의 primer set을 24개의 2차 식물시료에 대해 PCR 검정과 Fragment Analyzer를 이용한 전기영동 및 유전자형 분석 결과, 총 382개의 PCR 밴드가 확인되었다. 가장 많은 수와 가장 적은 수의 다형성 PCR 밴드를 나타낸 primer set 는 WMU15338과 WMU15818로 각각 16개와 2개였으며, 한 primer set당 평균 다형성 PCR 밴드 수는 7.
- 오이(Cucumis sativus L.) 품종들로 구성된 하위그룹 I-2b에는 ‘장형낙합’, ‘강력삼척’, ‘강호백침’, ‘다이너시티’, ‘마샤’의 5개의 품종이 속하였으며 이 중 가시오이계 품종인 ‘강력삼척’과 반백다다기계 품종인 ‘강호백침’이 0.70로 가장 높은 유사도를 보였고 취청계 품종인 ‘장형낙합’과 피클용 품종인 ‘마샤’가 0.51로 가장 낮은 유사도를 보였다.
- 이상의 결과를 통하여 수박 EST-SSR 마커들이 타 박과 종의 유전체 및 마커 개발 연구분야에 적용될 수 있음을 확인하였다. 특히 이들 마커를 이용한 유연관계 분석 결과가 Cucurbiteae 족의 호박을 제외한 Benincaseae 족에서 기존의 종명법에 따른 분류법과 종간 유연관계와 일치한다는 사실은 선발된 수박 EST-SSR 마커들이 타 박과 작물의 유전적 다양성 분석뿐만 아니라 유전자 지도 작성 및 박과작물 간 비교유전체 분석에 활용 가치가 있음을 보여준다.
- ficifolia는 중생식물이며 다년생 식물로 알려져 있다(Bisognin, 2002). 이와 같은 생물학적 분류로 미루어 볼 때 C. moschata, C. pepo, C. maxima 와 C. ficifolia가 유전적 거리가 동떨어지게 그룹 지어질 것으로 예상하였지만 결과는 다르게 나왔다. 또한 Sanjur 등 (Schaefer et al.
- , 2011). 이와 같이 오이와 멜론은 수박과 호박 등 타 종에 비하여 유전적으로 매우 유사한 종임을 본 연구에서도 확인할 수 있었다. 멜론과 오이 품종군은 유사도 0.
- 일반 멜론 품종군(I-2a-1)에는 ‘Earl’s Elite’, ‘Charentise’, JC-23, JC-24이 속하였는데, 얼스엘리트계 F1품종 ‘얼스엘리트’와 녹육계 계통 JC-24가 0.71의 유사도를 나타내어 가장 높은 유사도를 보였으며 JC-24와 유럽계 품종 ‘Charentise’가 0.64으로 가장 낮은 유사도를 보였다.
- 짝유사행렬을 토대로 UPGMA를 통해 계통도(dendrogram)를 분석한 결과, 유사도 0.23에서 크게 2개의 clade(Clade I 과 Clade II)로 구분되었다. Clade I에는 수박, 멜론, 오이의 모든 품종들이 군을 이루었으며, Clade II에는 호박의 모든 품종들이 군을 이루었다.
- 총 8개의 1차 검정 시료에 대해 120개 수박 EST-SSR primer set의 PCR 검정 결과, 51개(49.17%) primer set은 모든 식물시료에서 PCR 증폭이 가능하였으며, 이 중 식물시료 간 대립유전자 특이적 증폭산물(EST-SSR 마커) 크기에 따른 다형성을 보인 primer set은 총 49개(40.8%)였다. 선발된 49개의 primer set을 24개의 2차 식물시료에 대해 PCR 검정과 Fragment Analyzer를 이용한 전기영동 및 유전자형 분석 결과, 총 382개의 PCR 밴드가 확인되었다.
- 이상의 결과를 통하여 수박 EST-SSR 마커들이 타 박과 종의 유전체 및 마커 개발 연구분야에 적용될 수 있음을 확인하였다. 특히 이들 마커를 이용한 유연관계 분석 결과가 Cucurbiteae 족의 호박을 제외한 Benincaseae 족에서 기존의 종명법에 따른 분류법과 종간 유연관계와 일치한다는 사실은 선발된 수박 EST-SSR 마커들이 타 박과 작물의 유전적 다양성 분석뿐만 아니라 유전자 지도 작성 및 박과작물 간 비교유전체 분석에 활용 가치가 있음을 보여준다. 또한 육종분야에 있어서도 다양한 박과작물의 형질선발용 분자마커 개발 및 F1 순도검정과 품종식별 마커개발(Choi et al.
후속연구
- 특히 이들 마커를 이용한 유연관계 분석 결과가 Cucurbiteae 족의 호박을 제외한 Benincaseae 족에서 기존의 종명법에 따른 분류법과 종간 유연관계와 일치한다는 사실은 선발된 수박 EST-SSR 마커들이 타 박과 작물의 유전적 다양성 분석뿐만 아니라 유전자 지도 작성 및 박과작물 간 비교유전체 분석에 활용 가치가 있음을 보여준다. 또한 육종분야에 있어서도 다양한 박과작물의 형질선발용 분자마커 개발 및 F1 순도검정과 품종식별 마커개발(Choi et al., 2012)에 활용이 가능할 것으로 기대된다.
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