[논문]나노물질의 세포독성 평가법으로 Colony Forming Efficiency Assay에 대한 검증연구

조은혜; 이재우; 박선영; 김필제; 최경희; 엄익춘

doi:10.5668/jehs.2015.41.1.17

나노물질의 세포독성 평가법으로 Colony Forming Efficiency Assay에 대한 검증연구
Pre-validation of Colony Forming Efficiency Assay for Assessing the Cytotoxicity of Nanomaterials 원문보기

韓國環境保健學會誌 = Journal of environmental health sciences, v.41 no.1, 2015년, pp.17 - 23

조은혜 (국립환경과학원) , 이재우 (국립환경과학원) , 박선영 (국립환경과학원) , 김필제 (국립환경과학원) , 최경희 (국립환경과학원) , 엄익춘 (국립환경과학원)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives: The cytotoxcities of Au, Ag, SWCNT, $SiO_2$, and ZnO nanomaterials were evaluated in order to assess their potential toxicological effects in in vitro cell models using colony forming efficiency (CFE) assay. Methods: The CFE assay of the test materials was carried out on Hep G2 cells. The size distribution of nanomaterials was studied by transmission electron microscopy (TEM). Changes in cell viability after treatment with a toxicant will result in a decreased number of colonies formed in comparison to solvent. Results: The TEM images show that all the particles except SWCNT and ZnO can be considered approximately spherical. The gold and $SiO_2$ nanoparticles show no response (no toxicity) in concentration response experiments. A statistically significant toxic effect was found in Hep G2 cells treated with Ag, SWCNT and ZnO nanomaterials. Conclusion: In this study, we considered CFE assay to be a promising test for screening studies for cytotoxicity with physicochemical analysis.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

본 연구에서는 국내뿐만 아니라 국외에서도 다량 사용되고 있는 금, 은, SWCNT, 이산화규소, 산화아연 나노물질을 OECD WPMN과 EU JRC에서 정립한 colony형성능 시험을 이용하여 세포독성시험을수행하였으며, 향후 이 시험법이 국제적으로 나노물질을 평가하는 표준시험법으로 채택된 이후 우리나라의 대응방안을 모색하고자 하였다.

제안 방법

본 연구에서는 HepG2 세포를 이용하여 금, 은, 이산화규소, 산화아연 나노물질 및 SWCNT의 잠재적 독성을 연구하고 본 시험에 사용된 colony 형성능 시험의 적용성을 검증해 보았다. HepG2 세포는 대부분의 독성물질 표적이 될 수 있는 사람의 간세포 (간모세포종) 모델로 나노물질이 인체에 미치는 영향을 연구하기 적합하여 사용되었다.

대상 데이터

HepG2 세포는 JRC에서 제공받아 시험 전 최소세 번의 계대배양 후 본 시험에 사용하였다. 37℃ ±1℃, 90% ± 5% humidity, 5.
시험대상 나노물질은 5 nm와 35 nm 금나노물질 2종, 30 nm와 20 nm 은나노물질 2종, 274,6 nm×1,70µm SWCNT(Single-walled carbon nanotube, 단일벽탄소나노튜브) 1종, 20 nm와 90 nm 이산화규소 나노물질 2종, 240 nm 산화아연 나노물질 1종으로 총 8종이다(Table 1). 모든 시험물질은 JRC에서 colony 형성능 시험의 실험실간 교차 검증 프로그램의 일환으로 제공받은 것으로 적절한 친수성 용매에 분산되어 있었다.

데이터처리

05로 설정하였다. 분석은 정규성을 가정하고 모수적인 일원분산 분석(One-way ANOVA)을 적용하였으며, Sheffe로 사후검정을 실시하여 대조군과 유의한 차이가 나타나는 처리군을 확인하였다.

성능/효과

38 µg/mL 농도군까지 유의적인 colony 개수의 감소가 관찰되었고 그 이상의 농도에서는 세포가 사멸되었다. 30 nm와 20 nm 은나노물질은 각 대조군과 유의적인 상관관계에서는 차이가 보였지만, 전반적으로 0.05 µg/mL 이상의 농도에서 농도 의존적으로 감소하는 동일한 독성 영향을 보여 두 입자간의 크기 차에 의한 세포독성 영향은 없는 것으로 판단되었다.
따라서 OECD WPMN과 JRC에서 진행하고 있는 교차검증시험 종료 후 표준화된 시험법이 만들어진다면 이를 우리나라 나노물질 평가, 관리에 적용하여 기초자료 생산 및 위해성평가에 기여할 수 있을 것이다. 더해서 향후 나노물질의 물리화학적 특성 결과와 본 시험의 결과를 잘 활용한다면 세포 내 독성기전, 분자생물학적 종말점/표적 및 용량반응관계를 추가적으로 연구할 수 있어, 세포독성 평가법은 나노물질의 발암성시험, 유전독성, 산화적 스트레스 시험으로 확대, 적용시킬 수 있을 것이다.
은나노물질, SWCNT, 산화아연 나노물질의 노출로 감소된 colony 개수를 % CFE로 환산할 결과 30 nm, 20 nm 은나노물질은 각각 0.38 µg/mL와 0.27µg/mL 이상의 농도에서 SWCNT는 10 µg/mL와 100µg/mL 처리군에서, 산화아연 나노물질은 184.2 µg/mL 이상의 농도 처리군에서 용매 대조군에 비해 50%이상의 세포독성이 관찰되었다.

후속연구

따라서 OECD WPMN과 JRC에서 진행하고 있는 교차검증시험 종료 후 표준화된 시험법이 만들어진다면 이를 우리나라 나노물질 평가, 관리에 적용하여 기초자료 생산 및 위해성평가에 기여할 수 있을 것이다. 더해서 향후 나노물질의 물리화학적 특성 결과와 본 시험의 결과를 잘 활용한다면 세포 내 독성기전, 분자생물학적 종말점/표적 및 용량반응관계를 추가적으로 연구할 수 있어, 세포독성 평가법은 나노물질의 발암성시험, 유전독성, 산화적 스트레스 시험으로 확대, 적용시킬 수 있을 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	제조나노물질이란 무엇인가?	제조나노물질은 동일 성분의 일반 화학물질과는 달리 나노 수준의 미세입자로 새로운 특성을 갖는 입자이고, 이러한 특성으로 여러가지 새로운 상업적 목적으로 사용되고 있다.1) 그러나 나노물질은 미세입자로써의 특성으로 환경과 사람의 건강에 의도하지 않은 유해성을 가질 수 있다.
	나노물질의 안전성을 평가하는데 기존의 방법을 이용하기 힘든 이유는 무엇인가?	나노기술은 급진적 으로 발전하고 있지만 이러한 나노물질의 독성을 평가할 수 있는 시험법은 아직 개발되어 있지 못하다. 나노물질의 안전성을 평가하기 위해서 기존의 동물을 이용한 시험법을 수정하여 사용하기에는 많은 시간과 비용이 요구된다. 최근 동물대체시험법의 개발이 이러한 어려운 점을 보완해 줄 수 있지만 이 또한 기존의 화학물질의 평가에 국한되어 있다.
	제조나노물질을 in vitro 시험법으로 평가하는 것이 쉽지 않은 이유는 무엇인가?	제조나노물질을 in vitro 시험법으로 평가하는 데는 많은 문제점이 있다. 나노물질은 특이적인 물리적 성질로 수용액 내에서 응집 또는 응축이 일어나고 불안정하기 때문이다.4) 그래서 시험물질의 농축액과 배지 내 나노물질의 물리화학적 특성 분석뿐만 아니라 표준화된 시험법 확립이 필수적이다.

참고문헌 (17)

Ministry of Environment. 2014 Hazard Assessment Guidance of Manufacture Nanomaterials. Available: http://lib.me.go.kr:8018/search/DetailView.ax?sid1&cid5583017 [accessed 4 December 2014]
OECD. Guidance manual for the testing manufactured nanomaterials: OECD's sponsorship programme; first revision. Available: http://www.oecd.org/officialdocuments/publicdisplaydocumentpdf/?coteenv/jm/mono(2009)20/rev&doclanguageen [accessed 4 December 2014]
Ceriotti L, Ponti J, Broggi F, Kobc A, Drechsler S, Thedinga E, et al. Real-time assessment of cytotoxicity by impedance measurement on a 96-well plate. Sensors and Actuators B. 2007; 123(2): 769-778.

상세보기
Oberdorster G, Oberdorster E, Oberdorster J. Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles. Environ Health Perspect. 2005; 113(7): 823-839.

상세보기
Kim H, Park k. Excretion, tissue distribution and toxicities of titanium oxide nanoparticles in rats after oral administration over five consecutive days. J Environ Health Sci. 2013; 39(4): 369-375.
Jones C, Grainger DW. In vitro assessments of nanomaterial toxicity. Adv Drug Deliv Rev. 2009; 61(6): 438-456.

상세보기
Stren ST, McNeil SE. Nanotechnology Safety Concerns Revisited. Toxicol Sci. 2008; 101(1): 4-21.

상세보기
ISO. ISO 10993-1:2009 Biological Evaluation of Medical Devices -- Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. Available: http://iso.org/iso/catalogue_detail.htm?csnumber36406 [accessed 4 December 2014]
OECD. Nanosafety at the OECD. Available: http://www.oecd.org/science/nanosafety/47104296.pdf [accessed 4 December 2014]
Bar-Ilan O, Albrecht RM, Fako VE, Furgeson DY. Toxicity assessments of multisized gold and silver nanoparticles in zebrafish embryos. Small. 2009; 5(16): 1897-1910.

상세보기
Castiglioni S, Caspani C, Cazzaniga A, Maier JA. Short- and long- term effects of silver nanoparticles on human microvascular endothelial cells. World J Biol Chem. 2014; 5(4): 457-464.
Herzog E, Casey A, Lyng FM, Chambers G, Byrne HJ, Davoren M. A new approach to the toxicity testing of carbon-based nanomaterials-the clonogenic assay. Toxicol Lett. 2007; 174(1-3): 49-60.

상세보기
De Angelis I, Barone F, Zijno A, Bizzarri L, Russo MT, Pozzi R, et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells. Nanotoxicology. 2013; 7(8): 1361-1372.

상세보기
Ponti J, Colonato R, Rauscher H, Gloria S, Broggi F, Franchini F, et al. Coloy Forming Efficiency and microscopy analysis of multi-wall carbon nanotubes cell interaction. Tox Letters. 2010; 197(1): 29-37.

상세보기
Casey A, Herzog E, Davoren M, Lyng FM, Byrne HJ, Chambers G. Spectroscopic analysis conforms the interactions between single walled carbon annotates and various dyes commonly used to assess cytotoxicity. Carbon. 2007; 45: 1425-1432.

상세보기
Monteiro-Riviere NA, Inman AO, Zhang LW. Limitations and relative utility of screening assays to assess engineered nanoparticles toxicity in a human cell line. Toxicol Appl Pharmacol. 2009; 234(2): 222-235.

상세보기
EU JRC. EURL ECVAM Recommendation on the Cell Transformation Assay based on the Bhas 42 cell line. Available: https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations/files-bhas/EURL_ECVAM_Recommendation_Bhas-CTA_2013.pdf [accessed 4 December 2014]

저자의 다른 논문 :

LOADING...

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증