[논문]탱자 (Poncirus trifoliata)의 lipoprotein lipase 억제메커니즘

이성미; 강윤환; 김경곤; 김태우; 최면

doi:10.4163/jnh.2015.48.1.9

탱자 (Poncirus trifoliata)의 lipoprotein lipase 억제메커니즘
A study of the lipoprotein lipase inhibitory mechanism of Poncirus trifoliata water extracts 원문보기

Journal of nutrition and health, v.48 no.1, 2015년, pp.9 - 18

이성미 (강원대학교 생명건강공학과) , 강윤환 (강원대학교 강원웰빙특산물산업화지역혁신센터) , 김경곤 (강원대학교 생명건강공학과) , 김태우 (강원대학교 강원웰빙특산물산업화지역혁신센터) , 최면 (강원대학교 생명건강공학과)

초록
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본 연구에는 최근 항비만 소재로 연구되고 있는 건조, 미숙탱자의 물 추출물 (PF-W) 소재를 대상으로 폴리페놀 ($52.15{\pm}4.02mg/g$)과 플라보노이드 ($6.56{\pm}0.47mg/g$) 함량을 측정하고 항산화 활성과 세포독성을 시험한 후, 지방 흡수 제어 가능성을 확인하고자 lipoprotein lipase (LPL)의 억제효능을 배양배지와 세포 내의 LPL 함량, LPL mRNA 발현 그리고 LPL 효소활성측정을 통해 검토하였다. 그 결과 PF-W은 3T3-L1 adipocyte에서 LPL mRNA의 발현과 활성에는 영향이 없었으며, LPL의 분비를 억제하는 것을 알 수 있었다. PF-W의 LPL 분비억제기작을 확인하기 위해 다양한 단백질 이동 관련 유전자의 발현을 확인하였고, 그 결과 LPL의 이동과 분해에 관여하여 세포내 LPL의 활성을 조절하는 것으로 알려진 SorLA의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 조절하는 transcription factor의 발현과 세포핵으로의 이동에 PF-W가 미치는 영향을 검토한 결과 PF-W를 처리함으로써 SorLA promoter 에 작용하는 $C/EBP{\beta}$의 단백질양이 세포핵에서 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통해 PF-W가 SorLA 유전자의 transcription factor인 $C/EBP{\beta}$의 단백질 발현을 세포핵에서 증가시킴으로써 SorLA의 발현이 증가되어 LPL의 분비억제가 가능함을 확인할 수 있었으며 이는 PF-W의 항비만 효과기전을 설명하는 기초자료를 제공하는 것이라 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Purpose: Poncirus trifoliata has been reported to have anti-inflammatory, antioxidant, and immune activities. However, its anti-obesity activity and the mechanism by which the water extract of dried, immature fruit of Poncirus trifoliata (PF-W) acts are not clear. This study suggests a potential mechanism associated with the anti-obesity activity of PF-W. Methods: We measured the effect of PF-W on lipoprotein lipase (LPL) regulation using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and an activity assay. The LPL regulation mechanism was examined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) to measure the mRNA expression of biomarkers related to protein transport and by western blot for analysis of the protein expression of the transcription factor CCAAT-enhancer-binding protein ($C/EBP{\beta}$). Results: The total polyphenol and flavonoid content of PF-W was $52.15{\pm}4.02$ and $6.56{\pm}0.47mg/g$, respectively. PF-W treatment decreased LPL content in media to $58{\pm}5%$ of that in control adipocyte media, and increased LPL content to $117{\pm}3.5%$ of that in control adipocytes, but did not affect the mRNA expression of LPL. PF-W also increased the mRNA expression of sortilin-related receptor (SorLA), a receptor that induces endocytosis and intracellular trafficking of LPL, in a concentration- and time-dependent manner. Finally, cell fractionation revealed that PF-W treatment induced the expression of $C/EBP{\beta}$, a SorLA transcription factor, in the nuclei of 3T3-L1 adipocytes. Conclusion: The LPL secretion and activity assay showed PF-W to be an LPL secretion inhibitor, and these results suggest the potential mechanism of PF-W involving inhibition of LPL secretion through $C/EBP{\beta}$-mediated induction of SorLA expression.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

28 그러므로 LPL의 억제를 통해 지방의 세포 내 흡입을 저해함으로서 항비만 효과를 나타내는 천연소재를 탐색하고 그 기전을 규명하는 것은 효과적인 항비만 기능성 소재를 확보하는 유효한 방법이라 판단되어 본 실험을 수행하였다.
본 연구에는 최근 항비만 소재로 연구되고 있는 건조, 미숙탱자의 물 추출물 (PF-W) 소재를 대상으로 폴리페놀 (52.15 ± 4.02 mg/g)과 플라보노이드 (6.56 ± 0.47 mg/g) 함량을 측정하고 항산화 활성과 세포독성을 시험한 후, 지방 흡수 제어 가능성을 확인하고자 lipoprotein lipase (LPL)의 억제효능을 배양배지와 세포 내의 LPL 함량, LPL mRNA 발현 그리고 LPL 효소활성측정을 통해 검토하였다.
본 연구에서는 항비만효능이 알려진 탱자의 혈중지질감소를 근거로 지방의 체내 흡수에 중요한 기능을 하는 LPL의 작용에 탱자가 영향을 미칠 것이라는 가설 하에 LPL 억제효능을 평가하고 그 기전을 규명하고자 하였으며, 이를 통해 특유의 신맛 때문에 식용으로 사용이 어려운 탱자의 항비만 기능성 식품소재로의 개발을 위한 기초자료를 제공하고자 한다.

가설 설정

Effect of a water extract of the dried, immature fruit of Poncirus trifoliata (PF-W) on the lipoprotein lipase (LPL) expression and activity in 3T3-L1 adipocytes. A: LPL content of 3T3-L1 cell culture medium. B: Comparison of LPL activities in cell extract with and without 0.

제안 방법

1과 같다. 0.01~1 mg/mL의 처리농도에서 독성이 관찰되지 않았으며, 본 결과를 바탕으로 세포생존률이 감소경향을 보이기 전인 0.25 mg/mL 이하에서 향후의 활성 및 기전 연구를 진행하였다. 전통의약소재로 사용되어온 PF-W는 동물실험에서 독성이 나타나지 않아 Shim 등¹⁶의 연구에서 장기투여 연구가 진행된 바 있어 본 실험결과를 뒷받침하고 있다.
이는 앞선 많은 연구에서 제시한 LPL 단백질의 exocytosis와 endocytosis에 작용하는 여러 인자에 F-W가 작용할 가능성이 있음을 의미한다.^22,29이를 증명하기 위해 세포내 단백질 운반에 관련되는 여러 단백질들의 발현을 RT-PCR을 통해 확인하였다. SNARE는 수송소포를 선별적으로 표적 막에 융합시키는 과정에 관여하는 단백질로서 v-SNARE (vesicle SNARE)와 t-SNARE (target SNARE)로 나눌 수 있으며 v-SNARE는 수송소포에, t-SNARE는 표적의 막에 존재하며 이들은 서로 docking하여 fusion하는 역할을 함으로서 세포의 분비과정을 조절한다.
3T3-L1 세포의 분화유도는 Oh 등¹⁷의 연구에서 사용된 방법을 응용하였다. 3T3-L1세포는 10% calf serum을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지에 100 U/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 첨가하여 5% CO₂, 37°C에서 배양, 유지하였다.
3T3-L1 지방세포에 6시간, 12시간 동안 0.05, 0.1, 0.25mg/mL 농도의 소재를 처리한 후 배양배지를 제거하고 QIAzol lysis reagent (Qiagen, Maryland, USA)를 이용하여 제조사에서 제공하는 방법에 따라 total RNA를 분리하였다. Nuclease free water에 녹인 후 RNA 5 μL에 0.
3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 위해 6 well plate에 5 × 105 cell/well의 세포를 분주하여 세포가 완전히 밀집되게 배양하고, 2일을 더 배양한 후 MDI (0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 0.5 μM dexamethasone, 10 μg/ mL insulin) solution 및 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 3일 동안 배양함으로써 분화를 개시하였다.
First strand cDNA를 합성하기 위하여 mfiRiert Platinum cDNA snythesis Master Mix (GenDEPOT, Barker, TX, USA)를 이용하였으며 제공된 방법에 따라 추출한 RNA (2 μg)와 RNase free water로 9 μL을 맞추고 70℃에서 5분간 반응시킨 후 2×cDNA synthesis buffer 10 μL, cDNA synthsis Enzyme Mix 1 μL를 각 PCR tube에 더한 후 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
세척 후 well 당 50 μL의 lipase assay buffer을 첨가하여 반응에 필요한 volume을 맞춘 후 lipase activity assay kit제조사에서 제공하는 방법에 따라 실험을 수행하였다. Lipase activity는 milliunit/mL 단위로 계산한 후 활성비교를 위해 대조군을 기준으로 백분율(%)로 계산하였다.
Lipase 활성은 mouse LPL antibody가 pre-coating된 96 well plate와 lipase activity assay kit (Sigma-aldrich, St. Louis, USA)를 이용하여 측정하였다. 실험에 사용된 단백질 추출액은, 7일 동안 3T3-L1 지방세포 분화를 유도하고 DMEM배지에서 추가 2일간 배양한 세포를 PBS로 2회 세척 후 activity assay kit 제품에서 제공하는 ice-cold lipase assay buffer를 4 volume 가하여 4℃에서 homogenizing한 후 4℃, 13,000×g에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 분리하여 준비하였다.
중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)은 Go Tag Green Master (Promega, Madison, WI, USA) 10μL, forward primer (10 pmole)와 reverse primer (10 pmole)를 각각 1 μL, nuclease free water 7 μL, 합성한 first-stand cDNA 1 μL를 첨가하여 잘 섞은 후 실행하였으며 각각의 primer는 Table 1과 같으며, PCR조건은 Table 2와 같다. PCR 산물은 0.002% ethidium bromide가 첨가한 1% agarose gel에 100 V에서 20분간 전기영동 후 UV 광으로 유전자 발현 정도를 알아보았다. 그 밴드는 imageJ(National institutes of health, Bethesda, MD, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석 정량하였다.
PF-W의 항산화활성을 확인하기 위해 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거능, 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium (ABTS) 라디칼 소거능, 환원력, superoxide dismutase (SOD) 유사활성을 측정하였다.
SorLA의 발현에 PF-W가 미치는 영향을 확인하기 위해 SorLA의 promoter 정보를 검토하였다. 그 결과 Hirayama등²³의 연구에서 transcription factor인 activator protein 1 (AP-1), CCAAT-enhancer-binding proteins (C/EBP)β, Hepatocyte nuclear factor (HNF)-5가 SorLA promoter에 작용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
건조된 미숙탱자의 물 추출물 (PF-W)이 3T3-L1 preadipocyte에 미치는 세포독성은 Cell Counting Kit (CCK)-8(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 통해 확인하였다.¹⁸ 3T3-L1세포는 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 각각 96 well에 1.
그 다음 10 μg/mL insulin 및 10% FBS를 포함하는DMEM 배지로 교환하여 4일 동안 분화를 진행시켰다.
그 후 C/EBPβ (500 : 1), ERK1/2 (1,000 : 1), Vimentin(1,000 : 1) 1차 antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)가 첨가된 4% skim milk buffer에서 3시간동안 반응하고 TBS-T (TBS containing 0.1% tween-20)로 5분 단위로 3회 세척하였다.
그중 간세포에서 작용하는 HNF-5를 제외한 PEA-1, C/EBPβ의 mRNA발현을 RT-PCR을 통해 확인하였다 (data not shown).
24시간 후 배양중인 배지 (100 μL)에 CCK-8 reagent를 10 μL씩 가해주고 3시간 동안 37℃에서 배양한 후 microplate reader (EL808; BioTek, Winooski, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군 (control)의 흡광도 값을 기준 (100%)으로 세포독성을 비교 하였다.
세척 후 well 당 50 μL의 lipase assay buffer을 첨가하여 반응에 필요한 volume을 맞춘 후 lipase activity assay kit제조사에서 제공하는 방법에 따라 실험을 수행하였다.
그 다음 10 μg/mL insulin 및 10% FBS를 포함하는DMEM 배지로 교환하여 4일 동안 분화를 진행시켰다. 소재는 분화가 완료된 7일째부터 6, 12, 24시간동안 처리하였다.
실온에서 방냉한 뒤 추출한 소재는 3,000×g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 Whatman filter paper(Whatman International, Maidstone, UK)로 여과한 후, 감압농축기 (Eyela SB-1000, Tokyo, Japan)로 농축하고 동결건조기 (FD 8508, Ilshin, Korea)를 이용하여 건조한 후 필요한 농도로 증류수에 희석하여 실험에 사용하였다.

대상 데이터

18 3T3-L1세포는 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 각각 96 well에 1.5 × 105 cell/well로 분주한 후 24시간 부착시킨다.
본 실험에 사용된 건조된 미숙탱자는 춘천시 소재 건재 상에서 국내산 재료로 구입하여 수세한 후 건조와 분쇄를 거치고 10배 증류수를 가하여 60℃에서 24시간 교반하여 추출하였다. 실온에서 방냉한 뒤 추출한 소재는 3,000×g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 Whatman filter paper(Whatman International, Maidstone, UK)로 여과한 후, 감압농축기 (Eyela SB-1000, Tokyo, Japan)로 농축하고 동결건조기 (FD 8508, Ilshin, Korea)를 이용하여 건조한 후 필요한 농도로 증류수에 희석하여 실험에 사용하였다.
실험에 사용된 단백질 추출액은, 7일 동안 3T3-L1 지방세포 분화를 유도하고 DMEM배지에서 추가 2일간 배양한 세포를 PBS로 2회 세척 후 activity assay kit 제품에서 제공하는 ice-cold lipase assay buffer를 4 volume 가하여 4℃에서 homogenizing한 후 4℃, 13,000×g에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 분리하여 준비하였다.

데이터처리

002% ethidium bromide가 첨가한 1% agarose gel에 100 V에서 20분간 전기영동 후 UV 광으로 유전자 발현 정도를 알아보았다. 그 밴드는 imageJ(National institutes of health, Bethesda, MD, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석 정량하였다.
002% ethidium bromide가 첨가한 1% agarose gel에 100 V에서 20분간 전기영동 후 UV 광으로 유전자 발현 정도를 알아보았다. 그 밴드는 imageJ(National institutes of health, Bethesda, MD, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석 정량하였다.
실험에서 얻어진 결과의 통계적 유의성은 SPSS (Statitical Package for Social Sciences) program을 이용하여 Mean ± SD로 표시하였고, unpaired Student's t-test에 의해 p < 0.05 수준에서 두 실험군 간의 유의성을 검증하였다.

이론/모형

3T3-L1 지방세포의 LPL 단백질 함량은 Feng 등¹⁹의 연구를 참고하여 mouse LPL ELISA kit (Cusabio, Wuhan, China)를 이용하였으며 추출소재 0.25 mg/mL을 24시간 처리한 세포의 배양배지와 단백질 추출액에서 측정하였다. 배양배지는 3T3-L1 지방세포를 분화완료한 후 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에 소재 (0.
3T3-L1 지방세포의 분획단백질은 소재처리가 완료된 세포를 cooling된 PBS로 3회 세척하고 trypsinize한 후 튜브로 세포를 옮기고 PBS로 추가 1회 세척한 후 원심분리 (5,000 rpm, 5 min)를 통해 세포를 모은 후 cell fractionation kit (Cell signaling technology, Tokyo, Japan)의 사용방법에 따라 세포 분획을 진행하였다. 즉, 세포가 담긴 tube에 250μL의 cytoplasm isolation buffer를 넣고 5초 동안 vortexing 한 후 ice에 5분 동안 정치하였다.
3T3-L1세포를 분화하여 adipocyte를 생성한 후 PF-W를 처리하였을 때 배양배지에 분비되는 LPL의 단백질함량을 ELISA방법을 이용하여 측정하였다. 그 결과 Fig.
5% deoxycholic acid (m/v), 1% Triton X-100 (v/v), 1 mM PMSF, protease inhibitor coctail)를 가하여 4℃, 30분간 반응시킨 후 2분 동안 vortexing하고 4℃, 12,000×g에서 15분 동안 원심분리하여 상등액을 새튜브로 옮겨 준비하였다. LPL ELISA assay 방법은 commercial kit에서 제공하는 ELISA protocol을 따랐다. 즉, mouse LPL antibody가 precoating처리된 96 well plate에 배지 sample 100 μL 또는 추출단백질 sample 50 μg/100 μL을 넣어 2시간동안 정치하였다.
PF-W의 실험농도를 결정하기 위해 3T3-L1 세포에 대한 세포독성을 CCK-8 assay kit를 이용하여 평가하였다. 평가결과 세포의 생존율은 Fig.
그런 다음 membrane은 2차 anti-rabbit IgG conjugates horseradish peroxidase antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 가 첨가된 4% skim milk buffer (2,000 : 1)를 넣고 상온에서 1시간 동안 반응한 후 다시 TBS-T를 이용하여 5분 단위로 3회 세척하였다. 발색은 enhanced chemiluminescence method를 이용하여 x-ray 필름에 감광시켰다. 그 밴드는 imageJ (National institutes of health, Bethesda, MD, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석 정량하였다.
소재의 항산화활성은 Lee 등¹⁸이 사용한 동일한 조건과 방법으로 수행하였다.
총 polyphenol 및 flavonoid의 함량은 Lee 등¹⁸이 사용한 동일한 조건에서 수행하였다.

성능/효과

^20,24,25 플라보노이드는 식물에 널리 분포하는 노란색 또는 담황색 계통의 색소로 항균, 항암, 항바이러스 및 항염증 등 다양한 생리활성을 가지는 것으로 보고되어 있다.^20,26,27 PF-W는 gallic acid와 quercetin을 폴리페놀과 플라보노이드의 표준물질로 사용하여 측정하였을 때 약 52 mg/g의 폴리페놀과 6.6 mg/g의 플라보노이드가 확인되었으며 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼소거능, 환원력, SOD 유사활성을 확인한 결과 IC₅₀ 농도가 Table 4와 같이 확인되었다. 이는 약용식물의 페놀화합물 함량과 항산화 활성을 탐색한 Kim 등²⁴의 연구논문을 바탕으로 PF-W의 폴리페놀과 플라보노이드의 함량 및 항산화 활성에 대해 평가한 결과 폴리페놀의 함량은 칡 (59.
22 Fig. 3D에서 관찰한 바와 같이 SorLA mRNA는 PF-W 0.05, 0.1, 0.25 mg/mL을 6시간동안 처리한 경우 80.6 ± 4.7%, 102.2 ± 0.3%, 118 ± 1.4%의 발현을 나타내었으며, PF-W 0.05, 0.1, 0.25 mg/mL을 12시간동안 처리한 경우 103.3 ± 2.6%, 128.1 ± 7.3%, 136.2 ± 4.6%의 발현을 나타내었다.
^32,33 SorLA (sortilinrelated receptor)도 sortilin과 같은 family에 속하는 receptor로서 endocytic activity와 세포내 vesicle들의 이동에 관여하는 것이^22,32알려져 있을 뿐만 아니라 LPL의 세포내 분포를 변화시키고, lysosome으로 운반하여 분해를 유도함으로써 LPL의 활성을 조절한다고 보고되어있다.²² 이러한 연구결과들을 바탕으로 v-SNARE, Rab3A, Sortilin 및 SorLA의 발현변화에 PF-W가 미치는 영향을 확인한 결과 Fig. 3에 정리된 바와 같이 v-SNARE, Rab3A, Sortilin는 PF-W의 농도별, 시간별 처리에 따라 변화가 관찰되지 않은 반면 SorLA는 PF-W의 처리농도 및 처리시간에 따라 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 이를 통해 PF-W의 처리가 SorLA의 발현을 유도하여 endocytic activity 증가를 통한 LPL의 분비감소와 세포내 LPL의 분해에 관여함을 유추할 수 있었다.
6%의 발현을 나타내었다. PF-W 0.05 mg/mL PF-W를 6시간 처리하였을 때 감소하는 경향을 보이지만 향후 농도의존적, 시간의존적인 형태로 발현이 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있다.
그 결과 PF-W은 3T3-L1 adipocyte에서 LPL mRNA의 발현과 활성에는 영향이 없었으며, LPL의 분비를 억제하는 것을 알 수 있었다. PF-W의 LPL 분비억제기작을 확인하기 위해 다양한 단백질 이동 관련 유전자의 발현을 확인하였고, 그 결과 LPL의 이동과 분해에 관여하여 세포내 LPL의 활성을 조절하는 것으로 알려진 SorLA의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 조절하는 transcription factor의 발현과 세포핵으로의 이동에 PF-W가 미치는 영향을 검토한 결과 PF-W를 처리함으로써 SorLA promoter에 작용하는 C/EBPβ의 단백질양이 세포핵에서 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
25 mg/mL 처리농도와 6시간 또는 12시간 처리시간에서 유의한 변화를 유도하지 못하는 것을 확인하였다. Rab3A는 Ca²⁺의존성 exocytosis를 조절하는 단백질로서 v-SNARE와 마찬가지로 PF-W의 처리가 영향을 미치지 못하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 3B). Sortilin은 endocytic receptor로서 골지체, 세포막에 주로 존재하며 LPL과 결합 후 분해에 관여하는 것으로 알려져 있지만 앞선 실험과 같이 PF-W의 처리가 아무런 영향을 미치지 못하는 것이 관찰되었다 (Fig.
그 결과 Fig. 2A에 정리된 바와 같이 preadipocyte 배양배지에서 64.2 ± 7.2% 수준이던 LPL의 단백질함량이 adipocyte에서 100% 수준으로 증가하였으며 0.25 mg/mL PF-W를 24시간 처리하자 다시 58 ± 5% 수준으로 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
그 결과 Fig. 4A에 정리한 바와 같이 C/EBPβ만이 PF-W 0.25 mg/mL 처리한 시간에 따라 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
47 mg/g) 함량을 측정하고 항산화 활성과 세포독성을 시험한 후, 지방 흡수 제어 가능성을 확인하고자 lipoprotein lipase (LPL)의 억제효능을 배양배지와 세포 내의 LPL 함량, LPL mRNA 발현 그리고 LPL 효소활성측정을 통해 검토하였다. 그 결과 PF-W은 3T3-L1 adipocyte에서 LPL mRNA의 발현과 활성에는 영향이 없었으며, LPL의 분비를 억제하는 것을 알 수 있었다. PF-W의 LPL 분비억제기작을 확인하기 위해 다양한 단백질 이동 관련 유전자의 발현을 확인하였고, 그 결과 LPL의 이동과 분해에 관여하여 세포내 LPL의 활성을 조절하는 것으로 알려진 SorLA의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
또한 PF-W 0.25 mg/mL 처리에 의한 3T3-L1 세포내 LPL 단백질함량의 변화를 측정한 결과 preadipocyte (59 ± 1.3%)보다 adipocyte (100%)에서 유의하게 증가된 LPL 단백질함량이 PF-W 처리 (117 ± 3.5%)로 더욱 증가하는 것이 확인되었다.
91 mg/g)과 비슷한 수준이었다. 또한, 페놀화합물의 함량에 비해 PF-W항산화 활성은 산수유 (IC₅₀: DPPH 0.74 mg/mL, SOD 4.57 mg/mL), 오갈피나무 (IC₅₀: DPPH 0.70 mg/mL, SOD 2.92 mg/mL), 삼지구엽초 (IC₅₀: DPPH 0.79 mg/mL, SOD 4.59 mg/mL)보다 2배 이상 낮은 것으로 확인되었으며 해동피의 DPPH 1.27 mg/mL와 유사한 값을 나타내었다.²⁴ 그러나 Shim 등¹⁶의 연구에서 설명한 바와 같이 항비만 효과와 함께 독성이 없어 장기간 섭취가 가능하므로 PW-F의 항비만 메커니즘을 규명하는 것은 향후 소재의 산업화를 위해 필요한 기초과정이라 판단된다.
반면 배지에 분비된 LPL의 단백질함량은 활성을 측정하기에는 미량이어서 3T3-L1 adipocyte 추출단백질을 이용하여 LPL 활성을 측정한 결과 Fig. 2B와 같이 adipocyte (100%)와 PF-W 처리군 (95.1 ± 5.8%)간에 유의한 수준의 변화는 관찰되지 않았다.
본 실험에서는 galic acid와 quercetin을 폴리페놀과 플라보노이드의 표준물질로 각각 사용하여 PF-W의 총 폴리페놀과 총 플라보노이드의 함량을 측정한 결과 Table 3에 정리한 바와 같이 52.15 ± 4.02 mg/g, 6.56 ± 0.47 mg/g의 함량이 확인되었다.
이를 조절하는 transcription factor의 발현과 세포핵으로의 이동에 PF-W가 미치는 영향을 검토한 결과 PF-W를 처리함으로써 SorLA promoter에 작용하는 C/EBPβ의 단백질양이 세포핵에서 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통해 PF-W가 SorLA 유전자의 transcription factor인 C/EBPβ의 단백질 발현을 세포핵에서 증가시킴으로써 SorLA의 발현이 증가되어 LPL의 분비억제가 가능함을 확인할 수 있었으며 이는 PF-W의 항비만 효과기전을 설명하는 기초자료를 제공하는 것이라 사료된다.
세포의 분비작용에 관여하는 단백질인 v-SNARE의 mRNA 발현을 확인한 결과 Fig. 3A에 나타난 바와 같이 PF-W의 0.05, 0.1, 0.25 mg/mL 처리농도와 6시간 또는 12시간 처리시간에서 유의한 변화를 유도하지 못하는 것을 확인하였다. Rab3A는 Ca²⁺의존성 exocytosis를 조절하는 단백질로서 v-SNARE와 마찬가지로 PF-W의 처리가 영향을 미치지 못하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig.
이를 바탕으로 C/EBPβ 단백질 발현을 확인한 결과 Fig. 4B에 정리된 바와 같이 PF-W 처리 전·후의 세포질단백질 (Cyto)과 핵단백질 (Nuc)을 비교한 결과 PF-W 0.25 mg/mL 처리 전 (0.99 ± 0.1) 보다 6시간 처리한 후 (2.64 ± 0.8)의 핵단백질에서 더 많은 양의 C/EBPβ 단백질이 확인되었다.
PF-W의 LPL 분비억제기작을 확인하기 위해 다양한 단백질 이동 관련 유전자의 발현을 확인하였고, 그 결과 LPL의 이동과 분해에 관여하여 세포내 LPL의 활성을 조절하는 것으로 알려진 SorLA의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 조절하는 transcription factor의 발현과 세포핵으로의 이동에 PF-W가 미치는 영향을 검토한 결과 PF-W를 처리함으로써 SorLA promoter에 작용하는 C/EBPβ의 단백질양이 세포핵에서 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통해 PF-W가 SorLA 유전자의 transcription factor인 C/EBPβ의 단백질 발현을 세포핵에서 증가시킴으로써 SorLA의 발현이 증가되어 LPL의 분비억제가 가능함을 확인할 수 있었으며 이는 PF-W의 항비만 효과기전을 설명하는 기초자료를 제공하는 것이라 사료된다.
이를 통해 PF-W의 처리가 SorLA promoter에 작용이 가능한 C/EBPβ 단백질을 핵으로 유도하여 SorLA의 mRNA 발현을 유도함으로써 증가된 SorLA가 LPL과 결합하여 endocytic activity 증가 또는 lysosome으로의 운반을 유도하여 LPL을 분해함으로써 LPL의 분비 및 활성감소를 유도하는 것으로 유추할 수 있었다.
3에 정리된 바와 같이 v-SNARE, Rab3A, Sortilin는 PF-W의 농도별, 시간별 처리에 따라 변화가 관찰되지 않은 반면 SorLA는 PF-W의 처리농도 및 처리시간에 따라 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 이를 통해 PF-W의 처리가 SorLA의 발현을 유도하여 endocytic activity 증가를 통한 LPL의 분비감소와 세포내 LPL의 분해에 관여함을 유추할 수 있었다. 그러나 SorLA 단백질과 LPL의 상호결합과 세포내 이동에 PF-W가 미치는 영향에 대한 구체적인 연구가 진행되어야할 것으로 판단된다.
실온에서 방냉한 뒤 추출한 소재는 3,000×g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 Whatman filter paper(Whatman International, Maidstone, UK)로 여과한 후, 감압농축기 (Eyela SB-1000, Tokyo, Japan)로 농축하고 동결건조기 (FD 8508, Ilshin, Korea)를 이용하여 건조한 후 필요한 농도로 증류수에 희석하여 실험에 사용하였다. 추출분말은 미숙탱자 원재료 무게대비 10.6%의 추출률을 나타내었다.

후속연구

이를 통해 PF-W의 처리가 SorLA의 발현을 유도하여 endocytic activity 증가를 통한 LPL의 분비감소와 세포내 LPL의 분해에 관여함을 유추할 수 있었다. 그러나 SorLA 단백질과 LPL의 상호결합과 세포내 이동에 PF-W가 미치는 영향에 대한 구체적인 연구가 진행되어야할 것으로 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	한방에서 탱자는 어디에 이용되는가?	탱자 (Poncirus trifoliata)는 한방에서 흉통, 복통 및 염증을 다스리는데 응용되고 있으며, 최근연구에서는 비만유도 쥐의 체중증가를 억제하고 혈중지질개선효과와 항산화효과를 나타낸다는 결과가 보고되었다.15 또한 Shim 등16의 연구에서는 pancreatic lipase 활성에는 영향을 미치지 못하지만 장기간의 복용이 독성 없이 체중증가를 억제한다고 보고하였다.
	미국 식품의약국에서 항비만제로 승인된 orlistat의 부작용은?	지금까지 미국 식품의약국 (FDA)에서 항비만제로 승인되어 주로 사용되고 있는 의약품은 sibutramine과 orlistat 2종이 있으며, sibutramine은 식욕억제와 포만감 증가를 통해 체중감소를 유도하며, orlistat는 췌장과 위장관의 lipase 활성을 억제하여 지방의 흡수를 제어함으로써 체중감소에 효과를 나타낸다.4 그 중 orlistat는 위장장애, 과민증, 담즙분비장애, 지용성 비타민 흡수억제 등의 부작용이 보고되어 있으며5 장기간 사용 시 약효가 감소하는 것으로 알려져 있다.6 이 때문에 orlistat와 함께 사용하여 부작용을 감소시킬 수 있거나 단독으로 지질대사 개선 및 지질합성 억제의 효능이 있는 소재 및 식품에 대한 연구가 활발하게 진행 중이다.
	Lipoprotein lipase에 포함되는 것은?	Lipoprotein lipase (LPL)는 간, 심장, 지방조직, 뇌 등 신체의 다양한 조직 및 세포에서 발현되는 lipase family에 속하는 효소이며 pancreatic lipase, hepatic lipase 및 endothelial lipase가 포함된다.10 또한 세포막, 세포외부 및 혈관 내피세포로 분비되어 chylomicron이나 very low-density lipoprotein에 함유된 triglyceride를 fatty acid와 glycerol로 분해하여 fatty acid를 세포내로 흡수할 수 있게 하는 기능을 한다.

참고문헌 (33)

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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