[논문]포도껍질 추출물이 인체유방암세포 사멸에 미치는 영향

박민아; 강금지

doi:10.17495/easdl.2015.2.25.1.87

포도껍질 추출물이 인체유방암세포 사멸에 미치는 영향
Effect of Grape Skin Extract on Apoptosis in MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells 원문보기

東아시아食生活學會誌 = Journal of the East Asian Society of Dietary Life, v.25 no.1, 2015년, pp.87 - 98

박민아 (덕성여자대학교 자연과학대학 식품영양학과) , 강금지 (덕성여자대학교 자연과학대학 식품영양학과)

Abstract ▼ AI-Helper

We investigated the apoptotic effects of grape skin extracts (GSE) and related gene expressions in human breast cancer MDA-MB-231 cells cultured in the presence of 0, 0.5, 1 and 1.5 mg/mL of GSE for 72 hours. MTT assay, trypan blue and nuclei staining showed lower cellular mitochondrial activities and increased cell deaths with a higher concentration of GSE (p<0.05). Increased cell number with fragmentated DNA of sub-G1 phase was calculated as a measure of apoptotic cell death by FACS analysis (p<0.05). In particular, apoptotic cell death caused markedly increased in the 1 and 1.5 mg/mL of GSE groups, as revealed by flow cytometry (Annexin V-FITC). RT-PCR analysis was performed on apoptotic and preapoptotic genes. Expression of the apoptosis suppressor gene bcl-2 significantly decreased, proapoptotic gene bax was significantly increased and procaspase-3 showing the presence of caspase-3 significantly decreased (p<0.05). Furthermore, bcl-2/bax ratio which is considered to be an important indicator of apoptosis, significantly decreased in a concentration-dependent manner (p<0.05). These results indicated that GSE induces apoptosis in MDA-MB-231 human breast cancer cells.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

이에 본 연구는 70% ethanol 추출법을 이용하여 다양한 생리활성물질이 농축되어 있는 포도껍질 추출물의 처리 농도에 따라 유방암세포 MDA-MB-231의 활성, 막 투과성, 사멸, 자멸사 및 괴사구분, 세포주기 등을 분석하고, apoptosis 기전에 관여하는 bcl-2와 bax, procaspase-3 유전자를 mRNA 수준에서 분석하여 포도껍질의 항암효과를 확인하고자 하였다.

제안 방법

1,000 ng으로 정량한 각 농도별 RNA template 2.5 μL와 one-step RT-PCR kit(Legene Biosciences Inc., San Diego, CA, USA)의 1.25× reaction mix 20 μL, enzyme mix 0.5 μL를 분주하였으며, 세포사멸에 관여하는 유전자인 bcl-2, bax, prcaspase-3의 10 pmol/μL sense와 antisense primer pair(COSMO Genetech Co., Ltd., Seoul, Korea)를 각각 1 μL씩 첨가하여 총 volume이 25 μL가 되도록 하였다.
1.0% agarose(Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA) gel(1× TBE buffer, DNA dye, 1.0% agar)에서 20분 동안 100 voltage에서 전기영동(Mupid-2 plus, Advance, Tokyo, Japan)을 한 후 gel documentation system(ChemiDoc XRS, Biorad, Hercules, CA, USA)으로 촬영하여 시각화하였다.
, Tokyo, Japan)으로 관찰 후 fluorescence filed 200배와 100배 배율에서 세포단층촬영을 하였다. 200배 배율의 영상을 기록하고, 시료 처리에 따른 MDA-MB-231의 apoptosis 및 necrosis를 계상하였다. 모든 실험 분석은 3개의 반복 군을 설정하였고, 각 처리군별 Hoechst 33342와 PI가 염색된 세포를 총 600개 이상 계상하여 그 비율을 구하였다.
72시간 동안 GSE 농도 0.5, 1, 1.5 mg/mL를 처리한 세포 pellet에 75% ethanol을 이용하여 —4℃에서 12시간 동안 고정시켰다.
72시간 후, 2 mg/mL 농도의 MTT assay 50μL를 각 well에 첨가하여 2시간 동안 incubator에서 배양시킨 후, 각 well의 배지를 조심스레 suction한 다음 DMSO 150 μL를 첨가하였다.
Apoptosis와 necrosis를 구분하고 수치화하기 위하여 apoptotic 세포(early and late) 및 necrotic 세포를 3회 수행하여 평균값을 내었다(Fig. 3B). 그 결과, 대조군에서는 2%였으며, 농도 0.
GSE 0.5, 1, 1.5 mg/mL 72시간 처리에 따른 유방암 세포 MDA-MB-231세포의 사멸유도에 관여하는 유전자의 mRNA수준 변화를 관찰하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다.
GSE 0.5, 1, 1.5 mg/mL를 72시간 처리 후, 각 농도별로 dish에서 세포를 분리하여 모은 후 DPBS 50 μL를 첨가하여 pipetting으로 세포를 풀어준 다음, Hoechst 33342(HO342)를 10 μg/mL의 농도로 첨가하여 incubator에서 25분간 방치한 후 다시 꺼내어 PI를 2.5 μg/mL의 농도로 첨가하여 incubator에서 5분간 방치하였다.
GSE 0.5, 1, 1.5 mg/mL를 72시간 처리한 pellet에 DPBS를 첨가하여 총 세포수를 일정하게 맞추었다. 각 농도별로 E-tube에 1 mL를 옮긴 후 centrifuge 4℃, 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다.
GSE를 0.5, 1, 1.5 mg/mL로 처리하고 72시간 지속 후 Hoechst 33342와 PI를 염색하여 형광현미경에서 200배 배율로 사진을 촬영하였으며, 이중염색을 통해 분석하기 위해 adobe photoshop CS6 프로그램으로 merge하였다(Fig. 3A). 추출물 처리를 하지 않은 대조군에서는 대부분의 세포가 둥근 모양의 정상적인 핵과 손상없는 원형질막을 가지고 있으면서 파란색을 띄고 있었다.
GSE에 의한 MDA-MB-231 세포 증식 억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지 알아보기 위해 apoptosis를 정량적으로 분석하는 flow cytometry를 이용하여 Sub-G1 phase의 DNA fragmentation 및 DNA content 변화를 관찰하였다(Lee et al 2002).
GSE의 농도별 처리가 인체 유방암 세포 MDA-MB-231의 세포사멸에 미치는 영향을 확인하기 위하여 탈수소효소반응을 이용한 MTT 분석, 세포막투과성을 이용한 trypan blue 염색 분석, Hoechst 33342/PI 형광염료의 이중 핵 염색분석, FACS 기기를 이용한 cell cycle 분석과 annexin V-FITC/PI 염색분석을 통하여 세포사멸을 관찰하였다. MTT 분석 결과, 1 mg/mL 와 1.
GSE의 처리에 따른 MDA-MB-231 세포의 사멸이 일어나고 있는 세포막과 핵의 상태를 명확하게 분석하기 위하여 Hoechst 33342(blue)와 PI(red) 이중염색을 이용하여 apoptosis 및 necrosis를 구별하였다. 두 염료로 세포를 염색할 경우, 살아있는 세포는 온전한 핵을 가지며 파란색을 보이며, early apoptosis 세포는 응축한 핵을 가지며 파란색을 나타낸다.
GSE의 처리에 따른 MDA-MB-231 세포의 생존율을 확인 하기 위하여 MTT분석을 하였다.
MTT 분석 GSE의 처리에 따른 MDA-MB-231 세포의 생존율을 확인하기 위하여 MTT분석을 하였다. MDA-MB-231 세포에 GSE 농도 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75, 2 mg/mL를 첨가하고, 72시간 지속시킨 후 MTT시약을 첨가하고, 흡광도를 측정하였다(Fig. 1). 96well plate를 보면 대조군은 진한 보라색을 띄는 침상의 formazan crystal을 형성하였으나, GSE 처리 농도가 높아질수록 탈수소효소반응이 나타나지 않아 formazan crystal을 형성하는 세포가 줄어드는 동시에 연한 보라색을 띄는 것을 볼 수 있었다.
MDA-MB-231 세포에 GSE 농도 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 동안 하였다. 또한, PCR amplification은 94℃에서 15초, 55∼65℃(primer마다 annealing 온도가 다름)에서 30초, 68℃에서 1분 동안 40 cycles 반응시킨 후, 72℃에서 10분 동안 post extension(Table 1)시켰다.
MDA-MB-231 세포에 GSE를 처리하였을 때, apoptosis의 초기 및 후기를 확실하게 구분하기 위하여 annexin V-FITC와 PI형광염료로 염색시킨 후 유세포분석기(FACS)를 이용하였다.
MDA-MB-231세포를 96 well plate에 2×104 cells/well 밀도로 계대하고, 200 μL 배지를 첨가하여 24시간 배양한 후, 포도껍질 추출물을 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75, 2 mg/mL 의 농도로 처리하여 다시 72시간 동안 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양시켰다.
1. MTT 분석

GSE의 처리에 따른 MDA-MB-231 세포의 생존율을 확인 하기 위하여 MTT분석을 하였다.
, Seoul, Korea)를 각각 1 μL씩 첨가하여 총 volume이 25 μL가 되도록 하였다. PCR 기기(Takara PCR thermal cycler, Seta 3-4-1, Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, 520-2193, Japan)를 사용하여 먼저 cDNA합성을 40℃에서 20분 동안 시켰으며, denaturation 반응은 94℃에서 2분 동안 하였다. 또한, PCR amplification은 94℃에서 15초, 55∼65℃(primer마다 annealing 온도가 다름)에서 30초, 68℃에서 1분 동안 40 cycles 반응시킨 후, 72℃에서 10분 동안 post extension(Table 1)시켰다.
PCR산물의 발현 정도를 수치화하기 위하여 Image J 프로그램(http://rsb.info.nih.gov/ij NIH, Bethesda, MD, U.S.A)을 이용하였으며, 이를 통해 세포사멸 유전자의 대조군으로 사용되는 유전자 β-actin 수치에 대한 상대적인 유전자 bcl-2, bax, procaspase-3 수치의 비율(%)을 결정하고, 세포사멸지수인 bcl-2/bax의 비율을 산출하였다.
72시간 후, 2 mg/mL 농도의 MTT assay 50μL를 각 well에 첨가하여 2시간 동안 incubator에서 배양시킨 후, 각 well의 배지를 조심스레 suction한 다음 DMSO 150 μL를 첨가하였다. Rotator(C-SKS, Chang Shin Science Co., Ulsan, Korea)를 이용하여 shaking한 후, ELISA reader(Spectra max M2, molecular devices, CA, USA)를 이용하여 570 nm의 파장에서 흡광도(OD)를 측정하였다. 세포생존율은 대조군의 흡광도를 100%로 하여 각 처리군의 흡광도를 상대적인 백분율로 나타내었으며, 이를 바탕으로 흡광도를 50%로 감소시킬 수 있는 시료의 농도(IC₅₀, half maximal inhibitory concentration)와 앞으로 수행될 실험에 사용될 농도 0.
그리고 PBS 480 μL 를 넣어 tapping한 후 FACS용 tube에 옮겨 담아 PI 2 mg/mL와 RNase를 각각 10 μL씩 넣어 최종 volume이 500 μL가 되도록 하였다. 그리고 FACS Canto II flow cytometer(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 이용하여 DNA함량에 따른 histogram을 측정하였으며, 모든 분석은 3반복하였다.
그리고 GSE 0.5, 1, 1.5 mg/mL를 72시간 처리 후, 0.1% trypan blue solution([C.I. 23850, Direct Blue 14, Niagraa Blue 3B] T1708, Samchun Chemical Co., Ltd, Seoul, Korea) 50 μL를 첨가하고 실온에서 10분간 방치하였다.
이 때 각 tube의 최종 volume은 500 μL가 되도록 하였다. 그리고 flow cytometer(FACS Canto II, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)기기를 이용하여 10,000개의 단일세포를 측정하여 viable, early apoptotic, late apoptotic 및 necrotic 세포의 수를 분석하였다.
, Ltd, Seoul, Korea) 50 μL를 첨가하고 실온에서 10분간 방치하였다. 그리고 광학현미경(IX71S8F-2, Olympus Optical Co., ltd., Tokyo, Japan)으로 Bright filed 200배와 100배 배율에서 각 농도마다 3곳을 무작위로 선정하였으며, 현미경 디지털 카메라시스템(DP50-CU, Olympus Optical Co., ltd.,Tokyo, Japan)을 사용하여 세포단층촬영을 하였다. 염색된 세포(dead/dying cell)와 염색되지 않은 세포(viable cell)를 각 처리군별 600개 이상 계상하였으며, 모든 실험은 3회 수행하였다.
농도별 총 10,000개의 세포 early apoptosis, late apoptosis 및 necrosis의 정도는 annexin V+/PI−, annexin V+/PI+ 및 annexin V−/PI+의 염료반응비율로 결정한다.
200배 배율의 영상을 기록하고, 시료 처리에 따른 MDA-MB-231의 apoptosis 및 necrosis를 계상하였다. 모든 실험 분석은 3개의 반복 군을 설정하였고, 각 처리군별 Hoechst 33342와 PI가 염색된 세포를 총 600개 이상 계상하여 그 비율을 구하였다.
세포가 부착 후 dish 면적의 70∼80% 정도로 증식한 때에, DPBS(Welgene, Daegu, Korea)로 2회 세척한 후 0.25% trypsin-EDTA(Gibco, Grand Island, NY, USA)로 부착된 세포를 분리시켜 계대 배양하였다.
, Ulsan, Korea)를 이용하여 shaking한 후, ELISA reader(Spectra max M2, molecular devices, CA, USA)를 이용하여 570 nm의 파장에서 흡광도(OD)를 측정하였다. 세포생존율은 대조군의 흡광도를 100%로 하여 각 처리군의 흡광도를 상대적인 백분율로 나타내었으며, 이를 바탕으로 흡광도를 50%로 감소시킬 수 있는 시료의 농도(IC₅₀, half maximal inhibitory concentration)와 앞으로 수행될 실험에 사용될 농도 0.5, 1, 1.5 mg/mL을 산출하였다.
,Tokyo, Japan)을 사용하여 세포단층촬영을 하였다. 염색된 세포(dead/dying cell)와 염색되지 않은 세포(viable cell)를 각 처리군별 600개 이상 계상하였으며, 모든 실험은 3회 수행하였다. 이는 Venkateswaran et al(2013)이 보고한 세포생존율 공식을 이용하여 세포사멸율을 결정하였다.
GSE의 처리에 따른 MDA-MB-231 세포의 사멸을 분석하기 위하여 세포막 투과성의 원리를 이용한 trypan blue 염색 법을 사용하였다. 온전한 세포막을 가진 생존한 세포는 염색되지 않으며, 손상된 세포막을 가진 사멸된 세포는 염색되지 않는 원리를 통해 세포생존 및 사멸을 구분하였다.
조심스레 pipetting한 후 chamlide microscope slides에 각 농도별로 10 μL씩 분주하였고, 그 위에 cover glass를 덮어 광학현미경(IX71S8F-2, Olympus Optical Co., ltd., Tokyo, Japan)으로 관찰 후 fluorescence filed 200배와 100배 배율에서 세포단층촬영을 하였다.
8%)을 얻어내었다. 포도껍질 94.31g에 용질의 10배인 943 mL의 70% ethyl alcohol을 첨가하여 80℃ water bath(CA-1112, Tokyo Rikakikai Co., Ltd, Tokyo, Japan)에서 3시간마다 추출액을 얻었으며, 총 9시간동안 환류추출을 하였다. 그 후 감압농축(EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co.
포도껍질 추출물 처리에 따른 유방암 세포 MDA-MB-231의 mRNA 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 apoptosis유도 신호전달 기전에 중요한 유전자 bcl-2, bax, procaspase-3를 통해 세포사멸효과를 확인하였으며, 대조군으로 housekeepingene인 β-actin을 이용하여 비교하였다.
포도껍질 추출물(grape skin extracts, GSE)의 농도별 처리에 따른 MDA-MB-231 세포의 증식억제 및 사멸을 알아보기 위해 MTT(3-[4,5-Dimethyl-2-thiazolyl]-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide, Alfa Aesar®, Karlsruhe, Germany)로 측정하였다.
포도껍질 추출물의 처리에 따른 MDA-MB-231 세포막의 투과성 여부를 trypan blue로 확인하였다면 더 나아가 실제적으로 사멸(death; apoptosis or necrosis)을 유도하는지 조사하기 위해 DNA 결합염료인 Hoechst 33342(Sigma, St Louis, MO, USA)와 핵산염료인 propidium iodide(Sigma, St Louis, MO, USA)를 사용하여 분석하였다.

대상 데이터

MDA-MB-231세포의 배양액은 먼저 Dulbeco's modified eagle's medium(DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)에 10% Fetal bovine serum(FBS, Welgene, Seoul, Korea)와 1% penicillin-streptomysin(GIBCO, Grand Island, NY, USA)을 혼합한 후 여과시켜 사용하였다.
인체 유방암 MDA-MB-231세포는 51세 caucasian female의 세포로 한국 세포주 은행(KCLB, Korean Cell Line Bank)에서 구입하여 사용하였다. MDA-MB-231세포의 배양액은 먼저 Dulbeco's modified eagle's medium(DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)에 10% Fetal bovine serum(FBS, Welgene, Seoul, Korea)와 1% penicillin-streptomysin(GIBCO, Grand Island, NY, USA)을 혼합한 후 여과시켜 사용하였다.
포도의 품종은 스튜벤(Vitis labrusca)이며, 2013년 10월에 충남 아산시 배방읍 회룡리 포도 농장에서 비가림 재배와 봉지 씌우기 및 친환경 재배를 통하여 수확한 후, 저온 저장 시킨 것을 2014년 2월에 구입하여 사용하였다.

데이터처리

또한, 각각의 값은 SPSS statistics 20.0 (IBM, Seoul, Korea) 프로그램을 이용하여 ANOVA분석 후 Duncan's multiple range test와 Scheffe's multiple range test로 p<0.05 수준에서 처리군 간의 유의성을 검증하였다.
본 연구의 모든 실험은 독립적으로 3회 이상 실시하였으며, 얻어진 결과는 평균(mean)과 표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다. 또한, 각각의 값은 SPSS statistics 20.
10. 통계처리

본 연구의 모든 실험은 독립적으로 3회 이상 실시하였으며, 얻어진 결과는 평균(mean)과 표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다. 또한, 각각의 값은 SPSS statistics 20.

이론/모형

GSE에 영향을 받은 MDA-MB-231 세포의 세포주기 분포및 배수성상태를 유동세포계수법(flow cytometry)의 DNA content분석을 통해 관찰하였다.
GSE의 처리에 따른 MDA-MB-231 세포의 사멸을 분석하기 위하여 세포막 투과성의 원리를 이용한 trypan blue 염색 법을 사용하였다. 온전한 세포막을 가진 생존한 세포는 염색되지 않으며, 손상된 세포막을 가진 사멸된 세포는 염색되지 않는 원리를 통해 세포생존 및 사멸을 구분하였다.
GSE에 의한 MDA-MB-231세포의 정량분석을 통해 apoptosis의 유도를 확인하였지만, sub-G1 phase는 핵의 변화가 나타나야 측정이 가능한 상태로 annexin V-FITC 방법보다 세포의 표시가 적게 나타날 수 있다. 그래서 초기 단계의 세포도 반응을 잘 보이며, early apoptosis, late apoptosis 및 necrosis가 농도에 따라 의미있게 증가되는지 구분하기 위하여 fluorescein isothiocyanate(FITC)-labeled annexin V(Annexin V-FITC)와 PI 이중염색법을 이용하였다. 농도별 총 10,000개의 세포 early apoptosis, late apoptosis 및 necrosis의 정도는 annexin V+/PI−, annexin V+/PI+ 및 annexin V−/PI+의 염료반응비율로 결정한다.
세포생존율을 확인하는 가장 일반적인 방법 중 하나로, 세포막의 투과성을 보기 위해 trypan blue 염색법을 사용하였다. 온전한 세포막을 가지고 있는 생존한 세포는 trypan blue 시약이 투과하지 못해 염색되지 않지만, 손상된 세포막을 가지고 있는 사멸되거나 괴사된 세포는 trypan blue시약이 투과하여 염색된다.
염색된 세포(dead/dying cell)와 염색되지 않은 세포(viable cell)를 각 처리군별 600개 이상 계상하였으며, 모든 실험은 3회 수행하였다. 이는 Venkateswaran et al(2013)이 보고한 세포생존율 공식을 이용하여 세포사멸율을 결정하였다.

성능/효과

1). 96well plate를 보면 대조군은 진한 보라색을 띄는 침상의 formazan crystal을 형성하였으나, GSE 처리 농도가 높아질수록 탈수소효소반응이 나타나지 않아 formazan crystal을 형성하는 세포가 줄어드는 동시에 연한 보라색을 띄는 것을 볼 수 있었다. 대조군 대비 백분율로 표시하여 나타낸 결과, 0.
Apoptosis를 촉진 및 유도하는 유전자인 bax의 발현은 농도 0.5와 1 mg/mL 처리군에서 1.82와 1.94 비율로증가하였으며, 농도 1.5 mg/mL 처리군에서는 2.70 비율로 약 3배 정도 증가하여 농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가하였다(p<0.05)(Fig. 6A, 6B).
Apoptosis의 지표인 bcl-2/bax의 비율은 농도 의존적인 감소를 나타내었으며(p<0.05), 세포사멸유도의 주요 매개자인 procaspase-3는 caspase-3로 활성화되면서 농도 의존적인 감소를 나타냈다(p<0.05).
FACS를 이용한 또 다른 annexinⅤ-FITC/PI 염색분석으로 apoptosis를 명확히 구분하였는데, early apoptosis보다는 late apoptosis가 농도 의존적으로 급격히 증가하였고(p<0.05), 특히 1.5 mg/mL 에서 약 60%의 late apoptosis를 보였다.
5%로 viable 세포가 많았다. GSE 0.5 mg/mL 처리군에서는 79.6%, 7.0%, 11.9%, 1.3%로 대조군에 비하여 viable 세포는 약 10%가 더 줄었으나, annexin V 양성, PI 음성반응인 세포 early apoptosis와 모두 양성반응을 나타내는 세포 late apoptosis의 밀도가 조금 높아지는 것으로 보아 apoptosis가 진행되기 시작한 것을 알 수 있었다. 또한, GSE 1 mg/mL 처리군에서는 60.
0%로 viable 세포가 줄어들고, early apoptosis와 late apoptosis 세포가 증가하였으며, necrosis 세포가 2%로 약간 증가하는 것으로 보아 apoptosis와 necrosis세포가 공존하는 것으로 사료되었다. GSE 1.5 mg/mL 처리군에서는 32.9%, 4.4%, 58.5%, 4.2%로 viable 세포는 급격히 줄어든 모습을 보였으며, early apoptosis의 밀도는 4.4%로 1 mg/mL 처리군 8.8%보다 낮아졌지만, late apoptosis는 58.5%로 급격히 증가하였다. 이러한 결과를 바탕으로 GSE를 처리한 MDA-MB-231세포는 농도가 증가할수록 DNA 손상과 apoptosis 진행이 초기와 후기 모두 증가하지만 1.
GSE 처리농도에 따른 세포 사멸을 정량 수치화하기 위하여 trypan blue 염료로 염색된 세포와 전체 세포 수를 기록하여 세포사멸율을 나타낸 결과(Fig. 2B), 추출물을 처리하지 않은 대조군은 0.1% 미만으로 대부분 생존한 세포였고, 농도 0.5 mg/mL 처리군은 13%로 사멸이 시작되어 1, 1.5 mg/mL 의 처리군에서는 34%, 59%의 현저한 증가율을 보이며, 세포사멸율이 농도 의존적으로 증가하였다(p<0.05).
5). GSE 투여 72시간 후의대조군과 처리군에서 발생한 세포사멸의 변화는 viable cell/ early apoptotic cell/ late apooptotic cell/ necrotic cell(%)로 진행 중인 세포의 구성 결과, 대조군은 annexin V와 PI 음성반응 밀도가 높으며, 89.6%, 3.9%, 6.0%, 0.5%로 viable 세포가 많았다. GSE 0.
GSE를 처리한 72시간 후 MDA-MB-231세포의 apoptosis 유도 기전 결과(Fig. 4A), 추출물을 처리하지 않은 대조군은 sub-G1 phase의 응축된 핵과 DNA content는 낮았지만, GSE 0.5 mg/mL 농도를 첨가하였을 때 DNA fragmentation 및 content가 16.1%로 증가하였다. 또한 1 mg/mL와 1.
GSE를 처리한 MDA-MB-231세포에 procaspase-3로 처리한 결과, 농도 0.5 mg/mL 처리군에서 0.73 비율이 나왔으며, 1, 1.5 mg/mL 처리군에서는 0.11, 0.02 비율로 급격하게 감소하며, 농도 의존적으로 유의적 차이를 보였다(p<0.05)(Fig. 6A, 6B).
MDA-MB-231 세포에 GSE 0.5, 1, 1.5 mg/mL의 농도로 처리하고, 72시간 후 0.1%의 trypan blue 염료를 첨가한 후 현미경 명시야에서 사진을 촬영한 결과, 농도 의존적으로 세포사멸이 관찰되었다(Fig. 2A). 추출물을 처리하지 않은 대조 군에서는 대부분의 세포가 trypan blue로 염색되지 않은 생존한 모습을 관찰할 수 있었다.
MTT 분석 결과, 1 mg/mL 와 1.5 mg/mL 처리군 사이에서 약 50%의 세포사멸을 나타내었으며, 세포사멸이 농도 의존적으로 증가되었고(p<0.05), trypan blue 염색법을 이용한 세포사멸 분석에서는 1.5 mg/mL 처리군에서 약 60%의 현저한 증가율을 나타내며, 농도 의존적으로 증가되었다(p<0.05).
05). Necrotic 세포는 대조군과 농도 0.5, 1 mg/mL 처리군에서는 1%, 3%, 12% 으로 유의적인 차이를 보였으나, 농도 1.5 mg/mL 처리군에서는 1 mg/mL 처리군과 같은 12%로 유의적인 차이를 보이지 않았다.
4B)하는 것을 보아, apoptosis가 농도 의존적으로 유도되는 것을 확인하였다. 결과적으로 세포주기의 G0/G1 arrest 발생으로 S기로의 진행에 영향을 주어 DNA 합성이 저해되었으며, sub-G1 phase에 apoptotic 세포의 점진적인 축적이 일어나 apoptosis 를 유도한다고 사료된다.
05). 결론적으로 포도껍질 추출물은 유방암 세포 MDA-MB-231의 세포 증식 억제 및 세포사멸을 유도하는 것으로 사료되어 천연항암물질의 가능성을 제시해 주었다.
그 결과, 대조군에서는 2%였으며, 농도 0.5, 1, 1.5 mg/mL 처리군의 apoptotic 세포는 12%, 33%, 55%로 apoptosis가 농도 의존적으로 증가하며, 유의적인 차이를 보였다(p<0.05).
대조군 대비 백분율로 표시하여 나타낸 결과, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75 및 2.0 mg/mL 처리군에서 세포 생존율이 82%, 75%, 61%, 56%, 50%, 39%, 30% 및 28%로 농도 의존적으로 감소하였다(p<0.05)(Fig. 1).
또한 1 mg/mL와 1.5 mg/mL 농도에서는 58.1%와 74.3%로 S phase의 세포가 빠져나가면서 sub-G1 phrase의 DNA content가 증가(p<0.05)(Fig. 4B)하는 것을 보아, apoptosis가 농도 의존적으로 유도되는 것을 확인하였다.
3%로 대조군에 비하여 viable 세포는 약 10%가 더 줄었으나, annexin V 양성, PI 음성반응인 세포 early apoptosis와 모두 양성반응을 나타내는 세포 late apoptosis의 밀도가 조금 높아지는 것으로 보아 apoptosis가 진행되기 시작한 것을 알 수 있었다. 또한, GSE 1 mg/mL 처리군에서는 60.3%, 8.8%, 28.9%, 2.0%로 viable 세포가 줄어들고, early apoptosis와 late apoptosis 세포가 증가하였으며, necrosis 세포가 2%로 약간 증가하는 것으로 보아 apoptosis와 necrosis세포가 공존하는 것으로 사료되었다. GSE 1.
5 mg/mL부터는 오히려 early apoptosis 는 감소하고, late apoptosis가 많이 일어나는 것으로 보아 GSE는 전체세포의 초기보다 후기의 apoptosis에 미치는 영향이 크다는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, Hoechst/PI 이중 염색 결과와 같이 necrosis는 미세하게 증가하였는데, 이는 농도 증가로 인한 독성이 영향을 미치는 것으로 사료된다.
또한, 이러한 연구들은 본 실험과 같이 flow cytometry를 통하여 sub-G1 phase의 DNA-hypodiploid 형태가 농도 의존적으로 증가하는 동일한 결과를 나타내는 것으로 보아 GSE에 의해 apoptosis가 유도되는 것을 확인할 수 있었다.
보다 더 명확한 세포사멸을 확인하기 위하여 FACS를 이용해 cell cycle sub-G1 phase의 DNA content를 확인한 결과, apoptosis가 1 mg/mL에서 약 60%로 급격히 증가하였고, 농도 의존적으로 증가되었다(p<0.05).
세포 증식을 촉진시키기보다는 apoptosis를 차단 및 억제 시키는 유전자인 Bcl-2의 발현은 농도 0.5 mg/mL 처리군에서부터 대조군 대비 비율 0.60으로 감소하였으며, 1 mg/mL과 1.5 mg/mL 처리군에서는 0.31과 0.17로 급격한 감소율을 보임으로서 농도 의존적으로 유의적인 감소를 나타내었다(p<0.05) (Fig. 6A, 6B).
세포사멸 중에서도 세포자멸사(apoptosis)와 괴사(necrosis)를 구분하기 위하여 이중 핵 염색 분석을 한 결과, 예정세포사인 apoptosis가 농도 의존적으로 급격히 증가되었다(p<0.05).
세포사멸관련 mRNA유전자 발현을 관찰한 결과, 세포사멸 억제 유전자 bcl-2는 처리농도가 증가할수록 유의적 감소를 보였으며(p<0.05), 세포사멸 유도 유전자인 bax는 농도 의존적으로 유의적 증가를 보였다(p<0.05).
실험 결과, 농도가 증가함에 따라 점차적으로 형광밀도가 높아지는 것이 관찰되었다(Fig. 5). GSE 투여 72시간 후의대조군과 처리군에서 발생한 세포사멸의 변화는 viable cell/ early apoptotic cell/ late apooptotic cell/ necrotic cell(%)로 진행 중인 세포의 구성 결과, 대조군은 annexin V와 PI 음성반응 밀도가 높으며, 89.
1). 이 중 흡광도를 50%로 감소시킬 수 있는 시료의 농도(IC₅₀) 0.5, 1, 1.5 mg/mL로 산출하였고, GSE 0.5 mg/mL 처리군은 약 20%의 세포사멸을 보였고, 1 mg/mL 처리군은 약 40%로 세포활성이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 1.
5%로 급격히 증가하였다. 이러한 결과를 바탕으로 GSE를 처리한 MDA-MB-231세포는 농도가 증가할수록 DNA 손상과 apoptosis 진행이 초기와 후기 모두 증가하지만 1.5 mg/mL부터는 오히려 early apoptosis 는 감소하고, late apoptosis가 많이 일어나는 것으로 보아 GSE는 전체세포의 초기보다 후기의 apoptosis에 미치는 영향이 크다는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, Hoechst/PI 이중 염색 결과와 같이 necrosis는 미세하게 증가하였는데, 이는 농도 증가로 인한 독성이 영향을 미치는 것으로 사료된다.
6A, 6B). 이러한 결과를 바탕으로 proapoptotic인 bax의 과발현은 세포사멸을 촉진하나, 반대로 antiapoptotic인 bcl-2의 과발현은 bax의 기능을 억제함으로써 apoptosis를 억제한다고 사료된다. Takako et al(2010)은 유방암세포 MCF-7에 에스트로겐수용체로 세포사멸에 대해 연구하였는데, bcl-2/ bax의 비율이 0.
포도에서 껍질만 얻기 위해 생포도 595g 중 껍질을 핀셋으로 수작업하여 분리한 결과, 94.31g(포도 전체 중 약 15.8%)을 얻어내었다. 포도껍질 94.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	포도껍질은 어떤 효과를 갖는가?	포도는 항산화(Jeong et al 2007; Jayaprakasha et al 2001; Rockenbach et al 2011; Hudson et al 2007; Moura et al 2002), 항돌연변이(God et al 2007) 및 항암(God et al 2007; Morré et al2006), 혈소판 기능억제 및 항염증, 활성산소방출억제 (Vitseva et al 2005) 효과를 가진다. 이 중 포도껍질은 전립선 (Hudson et al 2007) 및 자궁경부암 항암효과(Morré et al2006), 혈관확장 및 항고혈압(Moura et al 2002) 효과를 가지고 있다.
	apoptosis와 necrosis는 각각 무엇인가?	세포의 사멸은 apoptosis와 necrosis로 구분되며, apoptosis는 내재된 자살 기전의 결과로 예정세포사(programmed cell death)라고도 불리며, necrosis는 물리적 외상이나 다양한 종류의 독성물질에 의해 사멸하는 것이다(Kim et al 2000). Apoptosis는 정상적인 현상으로 우리 몸의 항상성 유지에 중요한 역할을 하고 있지만, 사멸해야 하는 세포가 사멸하지 않으면 apoptosis와 관련된 몇몇 세포들의 돌연변이가 암으로 이어질 수 있다.
	세포의 사멸 중에서 Apoptosis는 어떤 역할을 하는가?	세포의 사멸은 apoptosis와 necrosis로 구분되며, apoptosis는 내재된 자살 기전의 결과로 예정세포사(programmed cell death)라고도 불리며, necrosis는 물리적 외상이나 다양한 종류의 독성물질에 의해 사멸하는 것이다(Kim et al 2000). Apoptosis는 정상적인 현상으로 우리 몸의 항상성 유지에 중요한 역할을 하고 있지만, 사멸해야 하는 세포가 사멸하지 않으면 apoptosis와 관련된 몇몇 세포들의 돌연변이가 암으로 이어질 수 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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