신약 개발의 주요 표적이 되는 G-protein coupled receptor (GPCR)은 대부분의 생리적 활동에 관여하며 다양한 질병과 질환들에 관련되어 있다. GPCR을 타겟으로 하는 의약개발 연구에서 필수적인 실험방법으로 많이 활용되고 있는 세포기반 스크리닝 기술들은 사용되는 세포의 상태에 따라 데이터의 질이 좌우되는데 최근, 실험에 사용할 세포를 매번 배양하면서 소모되는 비용과 데이터의 변동을 줄이기 위해 냉동보관 세포를 적용하는 추세이다. 이에 본 연구에서는 단일 세포를 많은 양으로 배양하고 냉동 보관한 다음 사용되는 세포의 반응을 최적화하기 위하여 칼슘 검출을 위한 광 단백질이 포함된 세포주에 calcium sensing receptor와 urotensin II receptor가 안정적으로 발현되는 안정화 세포를 제작하고 $-80^{\circ}C$에서 보관한 다음 7 일 간격으로 실험했을 때 효능제와 길항제 반응을 비교하였다. 실험결과 보관기간이 증가함에 따라 세포 신호 값이 감소하였지만 $EC_{50}$와 $IC_{50}$ 값의 변화는 나타나지 않았다($EC_{50}:3.46{\pm}1.36mM$, $IC_{50}:0.49{\pm}0.15{\mu}M$). 그러나 액체질소에서 보관한 세포의 경우에서는 비냉동 세포와 비교하여 세포 신호 값이 감소했지만 보존기간에 따른 변화가 나타나지 않았으며 기간에 따른 $IC_{50}:0.49{\pm}0.15{\mu}M$와 $IC_{50}$의 변화도 없었다. 보관기간이 경과 될수록 세포의 신호 값이 감소하는 것은 세포 손상도 증가가 원인인 것으로 판단되며, 이러한 결과들로부터 장기간 냉동 보관을 위해서는 액체질소를 이용하는 것이 가장 효과적이고 한 달 이내 단기간 사용의 목적으로는 $-80^{\circ}C$ 보관조건도 가능할 것으로 판단된다. 이와 같이 냉동세포의 적극적인 활용을 통하여 초기 스크리닝 과정에서 나타나는 실험 유동성을 감소시킬 수 있을 것으로 예상된다.
신약 개발의 주요 표적이 되는 G-protein coupled receptor (GPCR)은 대부분의 생리적 활동에 관여하며 다양한 질병과 질환들에 관련되어 있다. GPCR을 타겟으로 하는 의약개발 연구에서 필수적인 실험방법으로 많이 활용되고 있는 세포기반 스크리닝 기술들은 사용되는 세포의 상태에 따라 데이터의 질이 좌우되는데 최근, 실험에 사용할 세포를 매번 배양하면서 소모되는 비용과 데이터의 변동을 줄이기 위해 냉동보관 세포를 적용하는 추세이다. 이에 본 연구에서는 단일 세포를 많은 양으로 배양하고 냉동 보관한 다음 사용되는 세포의 반응을 최적화하기 위하여 칼슘 검출을 위한 광 단백질이 포함된 세포주에 calcium sensing receptor와 urotensin II receptor가 안정적으로 발현되는 안정화 세포를 제작하고 $-80^{\circ}C$에서 보관한 다음 7 일 간격으로 실험했을 때 효능제와 길항제 반응을 비교하였다. 실험결과 보관기간이 증가함에 따라 세포 신호 값이 감소하였지만 $EC_{50}$와 $IC_{50}$ 값의 변화는 나타나지 않았다($EC_{50}:3.46{\pm}1.36mM$, $IC_{50}:0.49{\pm}0.15{\mu}M$). 그러나 액체질소에서 보관한 세포의 경우에서는 비냉동 세포와 비교하여 세포 신호 값이 감소했지만 보존기간에 따른 변화가 나타나지 않았으며 기간에 따른 $IC_{50}:0.49{\pm}0.15{\mu}M$와 $IC_{50}$의 변화도 없었다. 보관기간이 경과 될수록 세포의 신호 값이 감소하는 것은 세포 손상도 증가가 원인인 것으로 판단되며, 이러한 결과들로부터 장기간 냉동 보관을 위해서는 액체질소를 이용하는 것이 가장 효과적이고 한 달 이내 단기간 사용의 목적으로는 $-80^{\circ}C$ 보관조건도 가능할 것으로 판단된다. 이와 같이 냉동세포의 적극적인 활용을 통하여 초기 스크리닝 과정에서 나타나는 실험 유동성을 감소시킬 수 있을 것으로 예상된다.
The major target for drug discovery, G-protein coupled receptor (GPCR) is involved in many physiological activities and related to various diseases and disorders. Among experimental techniques relating to the GPCR drug discovery process, various cell-based screening methods are influenced by cell co...
The major target for drug discovery, G-protein coupled receptor (GPCR) is involved in many physiological activities and related to various diseases and disorders. Among experimental techniques relating to the GPCR drug discovery process, various cell-based screening methods are influenced by cell conditions used in the overall process. Recently, the utilization of frozen cells is suggested in terms of reducing data variation and cost-effectiveness. The aim of this study is to evaluate various conditions in cell freezing such as temperature conditions and storage terms. The stable cell lines for calcium sensing receptor and urotensin receptor were established followed by storing cultured cells at $-80^{\circ}C$ up to 4 weeks. To compare with cell stored at liquid nitrogen, agonist and antagonist responses were recorded based on the luminescence detection by the calcium induced photoprotein activation. Cell signals were reduced as the storage period was increased without the changes in $EC_{50}$ and $IC_{50}$ values $EC_{50}:3.46{\pm}1.36mM$, $IC_{50}:0.49{\pm}0.15{\mu}M$). In case of cells stored in liquid nitrogen, cell responses were decreased comparing to those in live cells, however changes by storage periods and significant variations of $EC_{50}/IC_{50}$ values were not detected. The decrease of cell signals in various frozen cells may be due to the increase of cell damages. From these results, the best way for a long-term cryopreservation is the use of liquid nitrogen condition, and for the purpose of short-term storage within a month, $-80^{\circ}C$ storage condition can be possible to adopt. As a conclusion, the active implementation of frozen cells may contribute to decrease variations of experimental data during the initial cell-based screening process.
The major target for drug discovery, G-protein coupled receptor (GPCR) is involved in many physiological activities and related to various diseases and disorders. Among experimental techniques relating to the GPCR drug discovery process, various cell-based screening methods are influenced by cell conditions used in the overall process. Recently, the utilization of frozen cells is suggested in terms of reducing data variation and cost-effectiveness. The aim of this study is to evaluate various conditions in cell freezing such as temperature conditions and storage terms. The stable cell lines for calcium sensing receptor and urotensin receptor were established followed by storing cultured cells at $-80^{\circ}C$ up to 4 weeks. To compare with cell stored at liquid nitrogen, agonist and antagonist responses were recorded based on the luminescence detection by the calcium induced photoprotein activation. Cell signals were reduced as the storage period was increased without the changes in $EC_{50}$ and $IC_{50}$ values $EC_{50}:3.46{\pm}1.36mM$, $IC_{50}:0.49{\pm}0.15{\mu}M$). In case of cells stored in liquid nitrogen, cell responses were decreased comparing to those in live cells, however changes by storage periods and significant variations of $EC_{50}/IC_{50}$ values were not detected. The decrease of cell signals in various frozen cells may be due to the increase of cell damages. From these results, the best way for a long-term cryopreservation is the use of liquid nitrogen condition, and for the purpose of short-term storage within a month, $-80^{\circ}C$ storage condition can be possible to adopt. As a conclusion, the active implementation of frozen cells may contribute to decrease variations of experimental data during the initial cell-based screening process.
따라서 스크리닝에 필요한 냉동보관 세포를 직접 제작하여 사용하는 것이 대안으로 제시되고 있으며 냉동 및 해동 속도, 냉동 보관제의 선택, 냉동보관 온도 등의 일반적인 조건들이 실험실의 고유 환경에 따라 적절히 고려되어져야 한다[14]. 본 논문에서는 냉동 세포주의 안정성에 대한 연구를 위하여 칼슘 감지 수용체(calcium-sensing receptor, CaS)와 유로텐신 Ⅱ 수용체(urotensin Ⅱ receptor, UT)가 발현된 세포주를 구현하고 냉동보관을 위해 고려되는 여러 변수들을 비교분석해 보고자 하였다.
제안 방법
효능제 활성을 확인하기 위해서 50 μl/well의 효능제가 담긴 96-well Optiplate에 미리 준비한 세포를 50 μ l/well (10,000 cells/well)로 가한 후 결과 신호 값을 측정하였다. 길항제 활성을 확인하기 위하여 준비된 세포를 50 μl/well의 길항제가 담긴 96-well Optiplate에 Multipipette Plus (Eppendorf, 독일)를 사용해 50 μl/well로 첨가한 후 15 분간 길항제와 반응시키고 50 μl/well의 효능제를 주입하여 반응을 확인하였다. 세포의 활성으로 인해 방출되는 빛은 EnVision Xcite MultiLabel Reader를 사용하여 측정되는 수치로 기록되었다.
안정화 세포를 제작하는데 보통 6 - 9 개월이 소요되는 것에 비해 일시적 유전자 삽입을 할 경우 요구되는 시간이 1 - 2 주 이내로 적다는 장점이 있지만 세포 배양 및 유전자 삽입과정에서 수반되는 변화 요인들이 이미 보고된 바와 같이[19] 데이터의 질에 영향을 주기 때문에 타겟 유전자가 안정적으로 발현되는 안정화 세포를 제작하여 실험에 사용하는 것이 일반적이다. 본 연구에서는 세포를 냉동 보관하기 위한 세포 보관액의 조성으로 DMEM/ F12와 10% DMSO, 20% FBS를 사용하였으며 냉동보관 시 -80℃에서 최대 28일까지 보관기간에 따른 세포 반응의 결과를 액체질소 보관조건과 함께 비교하였다. HEK293-aeq/hCaS 세포에서 칼슘의 최저 농도에 대한 신호 값은 보관 기간에 따른 영향을 받지 않았지만 보관 기간이 7 일씩 증가할수록 칼슘의 최대 농도에 대한 신호 값은 37%, 50%, 79%의 감소로 나타났다.
효능제 활성을 확인하기 위해서 50 μl/well의 효능제가 담긴 96-well Optiplate에 미리 준비한 세포를 50 μ l/well (10,000 cells/well)로 가한 후 결과 신호 값을 측정하였다. 길항제 활성을 확인하기 위하여 준비된 세포를 50 μl/well의 길항제가 담긴 96-well Optiplate에 Multipipette Plus (Eppendorf, 독일)를 사용해 50 μl/well로 첨가한 후 15 분간 길항제와 반응시키고 50 μl/well의 효능제를 주입하여 반응을 확인하였다.
대상 데이터
에쿼린 모체 세포주 (HEK293-aeq)[15]는 Perkinelmer life and analytical science (미국)사에 허가를 받아 사용하였다. CaS (GenBank Acc#, NM_000388.2)의 cDNA는 ORIGENE (미국)으로부터 받았으며, CaS의 효능제인 calcium chloride는 바이오세상 (한국)사의 제품을 사용하였다. 유로텐신 수용체 (UT : GenBank Acc#, NM_018949)의 cDNA는 Missouri S&T cDNA resource center (미국)사의 제품이며, UT의 효능제인 urotensin Ⅱ는 SIGMA (미국)사의 제품을 사용하였다.
2)의 cDNA는 ORIGENE (미국)으로부터 받았으며, CaS의 효능제인 calcium chloride는 바이오세상 (한국)사의 제품을 사용하였다. 유로텐신 수용체 (UT : GenBank Acc#, NM_018949)의 cDNA는 Missouri S&T cDNA resource center (미국)사의 제품이며, UT의 효능제인 urotensin Ⅱ는 SIGMA (미국)사의 제품을 사용하였다. 96-well white Optiplate는 Perkinelmer life and analytical science사의 제품이며, chromophore 보조인자로 세포 내 칼슘 변동 측정에 사용되는 coelenterazine h는 Promega Corporation (미국)사의 제품을 사용하였다.
데이터처리
농도 별 반응 실험으로부터 얻은 데이터는 PRISM version 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, 미국)의 non-linear curve fitting functions을 사용하여 EC50, IC50, R2, HillSlope 변수 값을 얻어 그래프를 평가하였다. 유의 수준을 평가하기 위해 Student t test와 One way ANOVA 방법을 사용하여 그룹 간 데이터를 기존 데이터와 상호 비교하였다.
, San Diego, 미국)의 non-linear curve fitting functions을 사용하여 EC50, IC50, R2, HillSlope 변수 값을 얻어 그래프를 평가하였다. 유의 수준을 평가하기 위해 Student t test와 One way ANOVA 방법을 사용하여 그룹 간 데이터를 기존 데이터와 상호 비교하였다. 다른 통계적 데이터는 Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, 미국)을 사용하여 분석하고 mean ± SD로 나타내었다.
성능/효과
본 연구에서는 세포를 냉동 보관하기 위한 세포 보관액의 조성으로 DMEM/ F12와 10% DMSO, 20% FBS를 사용하였으며 냉동보관 시 -80℃에서 최대 28일까지 보관기간에 따른 세포 반응의 결과를 액체질소 보관조건과 함께 비교하였다. HEK293-aeq/hCaS 세포에서 칼슘의 최저 농도에 대한 신호 값은 보관 기간에 따른 영향을 받지 않았지만 보관 기간이 7 일씩 증가할수록 칼슘의 최대 농도에 대한 신호 값은 37%, 50%, 79%의 감소로 나타났다. 반면 동일조건에서의 EC50 수치와 NPS-1의 IC50 값은 냉동 보관기간에 상관없이 동일한 수치를 얻었다.
HEK293-aeq/hCaS 세포에서 칼슘의 최저 농도에 대한 신호 값은 보관 기간에 따른 영향을 받지 않았지만 보관 기간이 7 일씩 증가할수록 칼슘의 최대 농도에 대한 신호 값은 37%, 50%, 79%의 감소로 나타났다. 반면 동일조건에서의 EC50 수치와 NPS-1의 IC50 값은 냉동 보관기간에 상관없이 동일한 수치를 얻었다.
한편 액체질소에 세포를 보관했을 때는 HEK 293-aeq/hCaS와 HEK293-aeq/hUT에서 모두 기간에 따른 신호 값의 차이가 없었는데 이것은 액체질소 보관조건에서 세포의 손상이 최소화된 것으로 판단된다. 따라서 6 개월 이상의 장기간 보관이 필요할 경우 액체질소에 보관하는 것이 바람직할 것으로 예상된다.
후속연구
한편 액체질소에 세포를 보관했을 때는 HEK 293-aeq/hCaS와 HEK293-aeq/hUT에서 모두 기간에 따른 신호 값의 차이가 없었는데 이것은 액체질소 보관조건에서 세포의 손상이 최소화된 것으로 판단된다. 따라서 6 개월 이상의 장기간 보관이 필요할 경우 액체질소에 보관하는 것이 바람직할 것으로 예상된다. 이와 같이 세포의 배양 조건과 여러 변동성을 최소화하기 위해서 단기간에 대용량의 세포를 배양한 다음 냉동 보관하여 사용하는 방법을 선택할 때 본 논문에서 실험한 냉동조건 및 기간에 대한 실험결과가 참고자료로 활용 가능할 것으로 판단된다.
따라서 6 개월 이상의 장기간 보관이 필요할 경우 액체질소에 보관하는 것이 바람직할 것으로 예상된다. 이와 같이 세포의 배양 조건과 여러 변동성을 최소화하기 위해서 단기간에 대용량의 세포를 배양한 다음 냉동 보관하여 사용하는 방법을 선택할 때 본 논문에서 실험한 냉동조건 및 기간에 대한 실험결과가 참고자료로 활용 가능할 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
신약개발은 어떤 과정인가?
신약개발은 일반적으로 10년 이상의 기간과 많은 자본이 필요한 선진국형의 전략적 개발 과정이다. 또한 이를 수행하기 위해서는 많은 사회적 인프라가 요구된다.
신약개발 과정 중 초기과정인 스크리닝 방법은 어떻게 구분되는가?
신약개발 과정은 크게 기초연구에 의한 작용점 도출 및 선정으로 화합물 스크리닝에 의한 유효물질 및 선도물질 선정, 후보물질의 확정, 전임상/임상1상의 임상화 연구과정, 임상2, 3상의 상품화 과정이 있다. 신약개발의 초기과정으로 스크리닝 방법은 일반적으로 시험관에서 수행하는 다양한 생화학적인 방법들과 실제 세포를 이용하는 cell-based assay 방법으로 구분될 수 있다[1-3].
G-protein coupled receptor은 무엇과 관련되어 있는가?
신약 개발의 주요 표적이 되는 G-protein coupled receptor (GPCR)은 대부분의 생리적 활동에 관여하며 다양한 질병과 질환들에 관련되어 있다. GPCR을 타겟으로 하는 의약개발 연구에서 필수적인 실험방법으로 많이 활용되고 있는 세포기반 스크리닝 기술들은 사용되는 세포의 상태에 따라 데이터의 질이 좌우되는데 최근, 실험에 사용할 세포를 매번 배양하면서 소모되는 비용과 데이터의 변동을 줄이기 위해 냉동보관 세포를 적용하는 추세이다.
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