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문제 정의
- 따라서 본 연구는 산양유를 섭취한 성인 여성의 분변 내 bifidobacteria의 증식 효과 및 분변에서 분리된 bifidobacteria와 lactobacilli의 당 발효 능력을 조사하였다.
제안 방법
- 산양유 시유를 30~50대 중년여성 20명(처리군 10명, 대조군 10명)에게 1인당 1일 2회(아침, 저녁) 250 mL씩 3달간 섭취시킨 후 8주, 10주 및 12주에 분변을 채취하여 bifidobacteria, lactobacilli, clostridia를 측정하였으며, 산양유의 bifidobacteria증식, 분리하여 특성을 조사하였다.
- 처리군과 대조군 사람들의 분변에서 bifidobacteria를 각각 13균주와 12균주를 0.5% cysteine을 함유하는 MRS agar에 배양하여 분리하였으며, -70℃ 냉동고에 보존하였다. 분리 균주의 16S rRNA 염기서열은 Solgent 회사에 의뢰하여 수행하였다.
- PCR 반응액제조에 사용한 primer는 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3')와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACT T-3')였으며, Bigdyeterminator cycle sequencing ready reaction kit(Perkin-Elmer,USA)를 사용하였다. PCR 조건은 96℃에서 10초, 50℃에서 5초 그리고 60℃에서 4분의 cycle로 총 30회 반복 진행하였다. ABI PRISM 3730Xl DNA analyzer로 PCR 반응액을 분석하여16s rRNA의 염기서열을 결정하였다.
- PCR 조건은 96℃에서 10초, 50℃에서 5초 그리고 60℃에서 4분의 cycle로 총 30회 반복 진행하였다. ABI PRISM 3730Xl DNA analyzer로 PCR 반응액을 분석하여16s rRNA의 염기서열을 결정하였다. 이 염기서열을 미국생명공학정보센터(NCBI)의 Blast 프로그램을 이용하여 동정하였다.
- ABI PRISM 3730Xl DNA analyzer로 PCR 반응액을 분석하여16s rRNA의 염기서열을 결정하였다. 이 염기서열을 미국생명공학정보센터(NCBI)의 Blast 프로그램을 이용하여 동정하였다.
- Bifidobacteria를 당이 첨가된 배지에 접종한 후 37℃에서 48시간 혐기 배양하였다. 배지의 색이 적색이 황색으로 변한 균주를 양성으로 결정하였다.
- 여과된 상등액을 5 mM NaCl로 평형화 된 SephadexG-25 column(5 cm×93 cm)에 주입하여 chromatography 하였다.
- 그리고 여과액15 kg을 추가로 얻은 후 다시 증류수 15 kg을 가하고, 농축액이 15 kg될 때까지 여과하였으며, 총 여과액의 양은 62 kg이 되었다. Nanofiltration membrane(DL4040F, Osmonics, USA)을 사용하여 여과액을 12 kg이 될 때까지 농축하였으며, 12 kg의 증류수를 5회 농축액에 가하여 농축을 반복하였다. 최종적으로 농축액 15 kg을 제조하였다.
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6. 박층크로마토그래피 분석
분획된 oligosaccharide 시료를 전개하여 TLC로 분석하였다. 전개용매는 n-butylalchol : 증류수(85 : 15)를 사용하였다.
- 산양유를 섭취한 여성들의 처리군과 섭취하지 않은 대조군의 분변의 bifidobacteria 세균을 계수하기 위하여 배양한 Beernesagar로부터 세균을 분리하였다. 이 세균들의 16S rRNA 유전자의 염기서열로 동정하였다.
- 분변에서 분리한 균주들의 ribose, arabinose, lactose, cellobiose, melezitose, raffinose, sorbitol, gluconate 및 xylose의 당발효 능력을 조사하였다(Table 2). 이 당들의 발효 능력에 따라 bifido- bacteria를 동정할 수 있다.
- 처리된 산양유를 ultrafiltration을 하여 올리고당, 포도당, 갈락토오스, 염류를 비롯한 저분자물질이 함유된 여과액을 얻었다. 여과액을 nanofiltration으로 농축하였으며, 증류수를 가하여 농축을 여러번 반복하여서 포도당과 갈락토오스의 농도를 감소시킨 농축액을 얻어 동결건조하였다. 동결건조된 농축액 시료를 Sephadex G-25 칼럼에 주입하여 크로마토그래피하였다.
- 여과액을 nanofiltration으로 농축하였으며, 증류수를 가하여 농축을 여러번 반복하여서 포도당과 갈락토오스의 농도를 감소시킨 농축액을 얻어 동결건조하였다. 동결건조된 농축액 시료를 Sephadex G-25 칼럼에 주입하여 크로마토그래피하였다. 분획된 시료 내 당을 페닐-황산법으로 측정한 결과, 2개의 peak로 분리되었다(Fig.
- 4). Sephadex G-25 크로마토그래피에서 얻은 분획 89~112번들을 동결건조한 후, Sephadex G-25 크로마토그래피를 반복하여 정제하였다. 정제된 올리고당을 박층크로마토그래피로 분석한 결과, 포도당, 갈락토오스, 유당이 없는 올리고당임을 알 수 있었다(Fig.
- 분변에서 분리한 bifidobacteria와 lactobacilli 균주를 이용하여 산양유 올리고당, lactulose 및 fructooligosaccharide에 대한발효 능력을 조사하였다(Table 3). 산양유 올리고당과 lactulose는모든 bifidobacteria와 lactobacilli가 발효하였으나, fructooligo- saccharide는 B.
- 산양유을 섭취한 성인의 분변 내 bifidobacteria의 증식 효과 및 분변에서 분리된 bifidobacteria와 lactobacilli의 당 발효능력을 조사하였다.
- adolescentis7 균주 모두 발효하였다. 조사한 B. pseudocatenulatum 4 균주, L. sakei 3 균주, B. longum 7 균주 중에서 각각 3, 2, 1 균주가 fructooligosaccharide를 발효하였다.
대상 데이터
- PCR 반응액제조에 사용한 primer는 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3')와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACT T-3')였으며, Bigdyeterminator cycle sequencing ready reaction kit(Perkin-Elmer,USA)를 사용하였다.
- 사람의 분변을 1% peptone에 희석한 후 각 한천 평판에 도포하여 37℃에서 48시간 배양하였다. Bifidobacteria, lactobacilli 및 clostridia는 각각 Beerens agar(BD, USA), MRS(deMan, Rogosaand Sharpe) agar(BD, USA, 0.02% NaN3 첨가) 및 TSC(TryptoseSulfite Cycloserine) agar(BD, USA)를 사용하였다. Bifidobacteria와 clostridia는 혐기 배양하였으며, 유산균은 호기 배양하였다.
- 산양유 50 kg에 Ha-lactase 36 μL를 가하여 4℃에서 2일간 반응하였다. Ultrafiltration membrane(UE4040-PF, Saehan, Korea)으로 여과하여 여과액을 수집하였다. 여과액 35 kg을 받은 후 농축된 산양유에 증류수 12 kg을 가하였다.
- 분획된 oligosaccharide 시료를 전개하여 TLC로 분석하였다. 전개용매는 n-butylalchol : 증류수(85 : 15)를 사용하였다. 발색시약으로는 diphenylamine : aniline : phosphoric acid(5 :10 : 85)를 사용하였다.
- 전개용매는 n-butylalchol : 증류수(85 : 15)를 사용하였다. 발색시약으로는 diphenylamine : aniline : phosphoric acid(5 :10 : 85)를 사용하였다. 표준물질은 glucose, galactose, lactose, siallyllactose를 사용하였다.
- 발색시약으로는 diphenylamine : aniline : phosphoric acid(5 :10 : 85)를 사용하였다. 표준물질은 glucose, galactose, lactose, siallyllactose를 사용하였다.
- sakei 순으로분리되었다. 대조군의 12 균주는 B. adolescentis, B. longum, L.ruminis, L. sakei, B. pseudocatenulatum 순으로 분리되었다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복하였으며, 통계분석은 5% 유의수준에서 student’s t-test를 행하였다.
이론/모형
- 5% cysteine을 함유하는 MRS agar에 배양하여 분리하였으며, -70℃ 냉동고에 보존하였다. 분리 균주의 16S rRNA 염기서열은 Solgent 회사에 의뢰하여 수행하였다. 염기서열 방법을 요약하면 다음과 같다.
- 여과된 상등액을 5 mM NaCl로 평형화 된 SephadexG-25 column(5 cm×93 cm)에 주입하여 chromatography 하였다. 분획된 시료를 페닐-황산법을 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 1은 산양유 250 mL를 1일 2회 섭취한 10명의 여성들로 구성된 처리군과 섭취하지 않은 대조군의 분변 내 bifido- bacteria, lactobacilli, clostridia의 Log 세균수를 보여주고 있다. Bifidobacteria는 처리군과 대조군 간에 세균수(log CFU/mL)가 0.64 차이가 나며, 95% 신뢰한계에서 유의성이 있었다. 한편, lactobacilli와 clostridia는 각각 0.
- 43으로 처리군과 대조군 간 상대적으로 차이가 8주보다 적었으며, 95% 신뢰한계에서 유의성이 없었다. Fig. 1과 Fig.2를 볼 때 bifidobacteria 세균수가 전체적으로 처리군이 대조군에 비해서 상대적으로 많이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
- 이 세균들의 16S rRNA 유전자의 염기서열로 동정하였다. 처리군에서는 전체 13 균주 중bifidobacteria가 12 균주로 B. adolescentis(40%), B. longum(40%), B. pseudocatenulatum(30%), B. dentium(10%)이었으며, 1 균주는 lactobacilli로 L. sake(10%)이었다. 반면에, 대조군에서는 전체 12 균주 중 bifidobacteria가 7 균주로 B.
- sake(10%)이었다. 반면에, 대조군에서는 전체 12 균주 중 bifidobacteria가 7 균주로 B. adolescentis(30%), B. longum(30%), B. pseudocatenulatum(10%), B. dentium(0%)이고, lactobacilli가 5 균주로 L. sake(20%), L. ruminis(30%)로 나타났다(Table 1). 이런 결과는 성인의 분변에서는 B.
- Sephadex G-25 크로마토그래피에서 분획을 박막 크로마토그래피로 분석한 Fig. 4를 보면 첫 번째 peek를 구성하는 분획 89, 94, 99에서는 표준물질 sialyllactose와 유사하였으며, 두 번째 peak를 구성하는 분획 104, 105, 107, 109, 112는 주로 glucose와 galactose를 함유하고 있음을 알 수 있었다(Fig.4). Sephadex G-25 크로마토그래피에서 얻은 분획 89~112번들을 동결건조한 후, Sephadex G-25 크로마토그래피를 반복하여 정제하였다.
- Sephadex G-25 크로마토그래피에서 얻은 분획 89~112번들을 동결건조한 후, Sephadex G-25 크로마토그래피를 반복하여 정제하였다. 정제된 올리고당을 박층크로마토그래피로 분석한 결과, 포도당, 갈락토오스, 유당이 없는 올리고당임을 알 수 있었다(Fig. 5).
- 올리고당에 존재하는 sialicacid는 탄수화물그룹의 재배치, 세균독소와의 mediate 상호작용, 식물과 동물의 lectin, 인터페론, 어떤 암의 특이성 항체를형성하는데 관여한다(Higa and Paulson, 1985). Fig. 1과 Fig.2에서 볼 때 bifidobacteria 세균수가 전체적으로 처리군이 대조군에 비해서 상대적으로 많이 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 이런 결과는 Raynal-Ljutovac 등(2008)은 산양유의 올리고당은 프리바이오틱의 속성을 갖고 있어 장내 유익균인 비피도박테리아의 성장을 촉진한다는 보고와 Kleessen 등(2003)이 쥐에 oligofructose/inulin을 섞어 먹인 후 bifidobacteria가 증가한다고 보고에 비추어 볼 때 산양유에 존재하는 올리고당이 bifidobacteria의 성장을 증가시킨 것으로 사료된다.
- 분변에서 분리한 bifidobacteria와 lactobacilli 균주를 이용하여 산양유 올리고당, lactulose 및 fructooligosaccharide에 대한발효 능력을 조사하였다(Table 3). 산양유 올리고당과 lactulose는모든 bifidobacteria와 lactobacilli가 발효하였으나, fructooligo- saccharide는 B. adolescentis 7 균주 모두와 B. pseudocatenulatum3 균주, B. longum 1 균주 및 L. sakei 2 균주만이 발효한 것으로 나타났다. Perrin 등(2001)에 의하면 probiotics 균주들은 단당류를 섭취하기 전에 세포에 결합된 glycosidase을 이용하여 올리고당을 미리 가수분해하는 능력을 갖고 있으며, 특히 fructofuranosidase을 갖고 있는 경우 fructooligosaccharide을 분해할 수 있다(Imamuraet al.
- Bezkorovainy(1989)에 의하면 같은 bifidobacreria 종 내에서도 효소를 발현하지않고, 속간 내에서도 탄수화물에 대한 선호도의 차이가 있다고 보고하고 있다. 본 연구에서도 B. longum의 경우 분리된 7개 균 중 1개만이 fructooligosaccharide을 분해한 결과를 보면, 같은 균주 내에서도 fructofuranosidase 효소가 발현하지않은 것으로 사료된다.
- 1. 산양유를 섭취한 처리군이 대조군보다 bifidobacteria 세균수가 상대적으로 높았으며, 8주에서 95% 신뢰한계에서 유의성이 있었다.
- 2. 분변에서 분리한 균주들을 13 균주의 16S rRNA 염기서열로 동정한 결과, 산양유를 섭취한 처리구는 B. adolescentis, B. longum, B. pseudocatenulatum, B. dentium, L. sakei 순으로분리되었다. 대조군의 12 균주는 B.
- 3. 산양유 올리고당과 lactulose는 모든 bifidobacteria 및 lacto- bacilli 균주가 발효하였다. Fructooligosaccaride는 B.
후속연구
- hamnosus는단지 삼당류와 사당류만을 대사하며 오당류는 대사하지 못하고, 단지 삼당류와 사당류을 위한 특별한 전달시스템을 가지고 있다고 제안했다. 본 연구에서 L. sakei의 경우, 분리된 3균주 중 2개만이 fructooligosaccharide을 분해한 결과는 종내에서도 왜 이런 차이를 내는지를 더 연구할 필요가 있다고 생각된다.
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