[논문]아라키돈산과 철 유도성 산화적 스트레스에 대한 금앵자(金櫻子) 열수 추출물의 간세포 보호 효능

고해리; 제갈경환; 송시연; 김난이; 강지원; 변성희; 김영우; 조일제; 김상찬

doi:10.6116/kjh.2015.30.6.7.

아라키돈산과 철 유도성 산화적 스트레스에 대한 금앵자(金櫻子) 열수 추출물의 간세포 보호 효능
Water Extract of Rosa laevigata Michx. Protects Hepatocytes from Arachidonic Acid and Iron-mediated Oxidative Stress 원문보기

大韓本草學會誌 = The Korea journal of herbology, v.30 no.6, 2015년, pp.7 - 15

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : Rosa laevigata Michx. has been used for the treatment of renal disease in traditional Korean medicine. In this study, we investigated cytoprotective effect of R. laevigata water extract (RLE) against oxidative stress induced by arachidonic acid (AA) + iron.Methods : To evaluate the protective effects of RLE against AA + iron-induced oxidative stress in HepG2 cell, cell viability and changes on apoptosis-related proteins were assessed by MTT and immunoblot analyses. The effects of RLE on reduced glutathione level, production of reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential were also monitored. Furthermore, to verify underlying molecular mechanism, NF-E2-related factor 2 (Nrf2) was examined by immunoblot analysis. Additionally, Nrf2 transactivation and its downstream target genes expression were also determined by reporter gene and realtime RT-PCR analyses.Results : RLE pretreatment (30-300 μg/ml) prevented cells from AA + iron-mediated cell death in a concentration dependent manner. In addition, 100 μg/ml RLE inhibited AA + iron-induced glutathione depletion, reactive oxygen species production and mitochondrial dysfunction. RLE accumulated nuclear Nrf2 and also transactivated Nrf2, which was evidenced by antioxidant response element- and glutathione S-transferase A2-driven luciferase activities and mRNA level of glutamate-cysteine ligase catalytic subunit, NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 and sestrin 2. Moreover, protective effect of RLE against AA + iron was abolished in Nrf2 knockout cells.Conclusions : These results indicate that RLE has the ability to protect hepatocyte against oxidative stress through Nrf2 activation.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

RLE에 의한 세포 보호 효과에 Nrf2 활성화의 관련성을 연구하기 위하여 Nrf2가 결손된 MEF cell (Nrf2 -/-)에서의 RLE의 세포 보호 효능을 연구하였다. Nrf2 -/- cell에서는 Nrf2의 발현이 관찰되지 않음을 immunoblot 분석을 통하여 확인하였다(Fig.
RLE의 세포 보호 효능에 관련된 분자기전을 규명하기 위하여 산화적 스트레스의 억제에 관여하는 핵심 전사인자 중 하나로 보고된 Nrf2의 활성화에 미치는 RLE의 영향을 연구하였다. 우선, HepG2 cell에 100 µg/ml RLE를 1시간에서 24시간까지 처치하고 핵 분획 단백질을 분리하여 Nrf2 발현을 immunoblot 분석을 통해 관찰한 결과, RLE에 의해 Nrf2의핵 내 축적이 RLE 처치 1시간 이후부터 증가하기 시작하였고, 3시간 이후부터 통계적으로 유의하게 증가하여 24시간까지 유지되었다(Fig.
그러나 金櫻구가 급만성 간질환의 핵심 기전 중 하나인 산화적 스트레스에 의한 간실질세포의 사멸에 미치는 영향 및 항산화 능 증가와 관련된 분자기전에 대한 연구는 부족하였다. 따라서 본 연구에서는 金櫻子 열수 추출물 (R. laevigata water extract, RLE)을 급만성 간질환 치료 및 예방의 후보 소재로 발굴하고자, HepG2 cell을 이용하여 AA와 iron의 병용 처치를 통해 산화적 스트레스를 유발하는 세포 독성 모델에서 RLE의 세포 보호 효능과 이에 관여하는 분자기전을 규명하고자 하였다.
본 연구에서는 金櫻子 열수 추출물 (RLE)이 HepG2 cell 에서 AA+iron으로 유도된 산화적 스트레스에 대한 세포 보호 효능을 연구하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
이와 더불어 AMPK의 활성화는 하위신호분자인 glycogen synthase kinase 3β의 불활성형 인산화의 촉진을 통하여 세포 보호 효능을 가지며, glycogen synthase kinase 3β 화학적 억제제 (예, SB216763) 처치만으로도 AA+iron에 의한 세포 독성이 상쇄되었다³⁷⁾. 본 연구에서는 예비연구로서 RLE가 AMPK의 활성화를 통하여 세포 보호 효능을 가지는지 확인하기 위하여 compound C를 전처치 후 RLE와 AA+iron을 처치한 결과, RLE에 의한 세포 보호 효능이 그대로 유지되었다 (Data not shown). 따라서 이전 보고한 本草 추출물과 달리 RLE에 의한 세포 보호 작용에는 AMPK의 활성화가 관련이 없을 것으로 추정된다.

제안 방법

본 연구실에서는 선행 연구를 통하여 AA+iron에 의한 세포 독성에 세포자멸사 (apoptosis)가 관여함을 보고한 바 있다^{27, 29)}. AA+ iron에 의한 세포 독성에 대한 RLE의 세포 보호 효능에 세포자멸사 관련 단백질의 억제가 관여하는지 알아보기 위하여 immunoblot 분석을 실시하였다. HepG2 cell에서 AA+iron 의 처치는 기존에 보고된 바와 같이 세포자멸사 관련 단백질 (PARP, procaspase-3, Bcl2)의 발현을 억제하였다.
. AA+iron에 의해 유도된 세포자멸사에 대한 RLE의 억제에 산화적 스트레스의 저하가 수반되는지 확인하기 위하여, 세포 내 산화적 스트레스의 억제에 관여하는 환원형 GSH의 함량 변화를 측정하였다. Control cell에서 환원형 GSH의 함량은 83.
HepG2 cell에서 AA+iron으로 유도된 세포 독성에 대한 RLE의 보호 효능을 MTT assay를 통하여 연구하였다. HepG2 cell에 10-300 µg/ml RLE를 한 시간 전처치하고 AA (10 µM, 12시간)와 iron (5 µM, 1시간)을 순차적으로 처치한 결과, AA+iron 처치에 의해 감소한 세포생존율 (43.
Immunoblot을 위해 8-10%의 sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel에서 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane으로 전이하고, 5% skim milk로 2시간 이상 blocking하였다. Membrane을 일차항체 및 이차항체와 반응시킨 후, enhanced chemiluminescence solution (Amersham, Buckinghamshire, UK)로 발광시켜 X-ray 필름 또는 Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Freiburg, Germany)을 사용하여 감광하였다. 각 단백질의 발현 정도는 β-actin (전 세포추출액) 및 Lamin A/C (핵 분획)에 대한 immunoblot을 통해 보정하였고, Image J를 이용하여 densitometric analysis를 실시하였다.
AA+iron에 의한 산화적스트레스는 미토콘드리아 막 전위의 저하를 수반하여 rhodamine123 에 대한 형광강도가 저하된 세포의 수 (RN₁ fraction)를 증가시킨다29, 30). RLE에 의한 세포 보호에 미토콘드리아 막 전위 회복이 관여하는지 알아보기 위하여 flow cytometry 분석을 통하여 미토콘드리아 막 전위를 측정하였다. AA+iron 의 처치는 rhodamine123 염색을 통한 RN₁ fraction에 해당되는 세포의 수를 control cell (3.
추출된 total RNA (2 µg)는 d(T)₁₆ primer와 Accupower RT premix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 역전사하여 cDNA를 얻었다. Realtime PCRe SyBr Green premix (Takara Bio, Shiga, Japan)와 CFX96TM thermalcycler (Biorad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 증폭하였다. 본 연구에 사용한 primer 는 Bioneer에서 합성하였으며, 염기서열 정보는 Table 1과 같다.
세포는 24-well plate에 5×10⁴ cells/well 농도로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. Serum이 없는 배지에서 12시간 동안 배양하여 증식을 억제시킨 뒤, 10-300 µg/ml RLE를 1시간 전 처치 후, 순차적으로 10 µM AA (12시간)와 5 µM iron (1시간)을 처치하였다. MEF cell의 경우, 15 µM AA를 3시간 처치한 후 5 µM iron (1시간)을 처치하였다.
Membrane을 일차항체 및 이차항체와 반응시킨 후, enhanced chemiluminescence solution (Amersham, Buckinghamshire, UK)로 발광시켜 X-ray 필름 또는 Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Freiburg, Germany)을 사용하여 감광하였다. 각 단백질의 발현 정도는 β-actin (전 세포추출액) 및 Lamin A/C (핵 분획)에 대한 immunoblot을 통해 보정하였고, Image J를 이용하여 densitometric analysis를 실시하였다.
본 연구에 사용한 primer 는 Bioneer에서 합성하였으며, 염기서열 정보는 Table 1과 같다. 각 유전자의 C_T 값은 GAPDH 유전자의 C_T 값으로 보정하여 상대 정량하였으며, melting curve 분석을 통해 증폭된 PCR 산물의 특이성을 확인하였다.
1 mM EDTA, 25% glycerol과 protease inhibitor cocktail (GenDEPOT)을 혼합한 hypertonic buffer 50 µl를 첨가하여 1시간 용해 후, 14, 000×g에서 15분간 원심분리하여 얻은 상층액을 이용하였다. 단백질 추출액은 bicinchoninic acid protein assay kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)를 이용하여 단백질 함량을 측정하였다. Immunoblot을 위해 8-10%의 sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel에서 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane으로 전이하고, 5% skim milk로 2시간 이상 blocking하였다.
. 따라서 RLE에 의한 Nrf2의 활성화가 Nrf2 표적 유전자군 (예, 항산화 유전자)의 발현을 증가시킬 수 있는지 리포터 유전자 및 realtime RT-PCR 분석을 통해 연구하였다. GSTA2-luciferase를 안정적으로 발현하는 재조합 HepG2 cell에 30-300 µg/ml RLE를 24시간 처치하였을 때 luciferase 활성이 증가하는 경향을 나타내었으며, 100 및 300 µg/ml의 RLE 처치에 의해 리포터 유전자 활성이 2.
본 연구에서도 RLE가 농도, 시간 의존적으로 Nrf2의 핵 내 축적을 증가시키고, ARE와의 결합 증가를 통한 표적 유전자 전사를 활성화시킬 수 있음을 immunoblot 분석 및 ARE를 포함한 리포터 유전자 분석을 통해 규명하였다. 또한 Nrf2 활성화에 의해 발현이 증가되어 산화적 스트레스를 억제하는데 관여하는 GSTA2, GCLC, NQO-1, SESN2의 전사가 활성화됨을 리포터 유전자 분석 및 realtime RT-PCR 분석을 통해 확인하였다. 이와 더불어 RLE의 AA +iron에 대한 세포 보호 효능이 Nrf2 -/- cell에서 상쇄되었다.
본 연구에서는 RLE의 세포 보호 효능의 분자기전으로서 Nrf2의 활성화를 제시하였다. Nrf2는 산화적 스트레스에 대한 세포 및 조직의 적응반응에 관여하는 인자 중 하나로서, 급만성 간질환 병태동물 모델에서 Nrf2 유전자의 결손이 간 질환을 심화시킬 수 있음이 규명되어 다양한 독성자극에 대한 간 조직 보호 역할을 담당하는 핵심 전사인자로 보고되었다 13, 16, 17).
14, 15). 본 연구에서도 RLE가 농도, 시간 의존적으로 Nrf2의 핵 내 축적을 증가시키고, ARE와의 결합 증가를 통한 표적 유전자 전사를 활성화시킬 수 있음을 immunoblot 분석 및 ARE를 포함한 리포터 유전자 분석을 통해 규명하였다. 또한 Nrf2 활성화에 의해 발현이 증가되어 산화적 스트레스를 억제하는데 관여하는 GSTA2, GCLC, NQO-1, SESN2의 전사가 활성화됨을 리포터 유전자 분석 및 realtime RT-PCR 분석을 통해 확인하였다.
25 mg/ml의 MTT (4시간)와 반응하여 생성된 formazan을 dimethylsulfoxide로 용해하여 Titertek Multiskan automatic microplate reader (Model MCC/340, Tecan, Huntsville, AL, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 control cell에 대한 백분율로 다음과 같이 계산하였다 [Relative cell viability(%)=100× (absorbance of treated cell)/(absorbance of control cell)].
24-well plate에 배양된 재조합세포에 30-300 µg/ml RLE를 24시간 동안 처치한 후, Passive lysis buffer (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 용해하였다. 세포 용해액 내의 luciferase 활성을 Luciferase Reporter Assay System^TM (Pr omega)을 이용하여 Infinite M200 automatic microplate reader (Tecan)로 측정하였다. 각 샘플의 발광 강도는 단백질 함량으로 보정하였다.
약물 처치가 완료된 세포에 0.05 µg/ml rhodamine123 로 30분간 염색한 후, 1% FBS가 포함된 PBS에 부유시켜 각 샘플당 20, 000개의 세포를 Partec GmbH FACS Calibur flow cytometer (Münster, Germany)를 이용하여 측정하였다.
. 처치된 세포를 10 µM DCFH-DA로 1시간 동안 37℃에서 반응하여 형성된 DCF의형광강도를 excitation (485 nm), emission (530 nm)의 파장에서 Infinite M200 automatic microplate reader (Tecan)를 이용하여 측정하였다.
추출된 total RNA (2 µg)는 d(T)₁₆ primer와 Accupower RT premix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 역전사하여 cDNA를 얻었다. Realtime PCRe SyBr Green premix (Takara Bio, Shiga, Japan)와 CFX96TM thermalcycler (Biorad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 증폭하였다.

대상 데이터

Anti-Nrf2 항체는 Santacruz Biotechnology (Santacruz, CA, USA)에서 구입하였다. AA, rhodamine123는 Calbiochem (San Diego, CA, USA) 에서 구입하였고, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycine Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)은 Hyclone laboratories (Logan, UT, USA)에서 구입하였다.
Dimethylsulfoxide는 Junsei Chemical (Tokyo, Japan)에서 구입하였다. Anti-Lamin A/C 항체는 BD Biosciences (San Jose, CA, USA)에서 구입하였으며, 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA), ferric nitrate, nitrilotriacetic acid (NTA), anti-β -actin 항체 및 기타 분석용 시약은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
USA)에서 구입하였다. Anti-Nrf2 항체는 Santacruz Biotechnology (Santacruz, CA, USA)에서 구입하였다. AA, rhodamine123는 Calbiochem (San Diego, CA, USA) 에서 구입하였고, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycine Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다.
Anti-caspase-3, anti-poly(ADP-ribose)polymerase (PARP), Anti-Bcl2, HRP-conjugated anti-rabbit IgG, HRP-conjugated anti-mouse IgG 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. Anti-Nrf2 항체는 Santacruz Biotechnology (Santacruz, CA, USA)에서 구입하였다.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)은 Hyclone laboratories (Logan, UT, USA)에서 구입하였다. Dimethylsulfoxide는 Junsei Chemical (Tokyo, Japan)에서 구입하였다. Anti-Lamin A/C 항체는 BD Biosciences (San Jose, CA, USA)에서 구입하였으며, 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA), ferric nitrate, nitrilotriacetic acid (NTA), anti-β -actin 항체 및 기타 분석용 시약은 Sigma (St.
HepG2 celle American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하여 10% FBS, 100 units/ml penicillin과 100 µg/ml streptomycin을 포함한 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. Wild type (Nrf2 +/+) 및 Nrf2 knockout (Nrf2 -/-) murine embryonic fibroblast (MEF) celle 가톨릭대학교 약학대학곽미경 교수로부터 분양받아 10% FBS가 포함된 IMDM에서 배양하였다26).
AA, rhodamine123는 Calbiochem (San Diego, CA, USA) 에서 구입하였고, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycine Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)은 Hyclone laboratories (Logan, UT, USA)에서 구입하였다. Dimethylsulfoxide는 Junsei Chemical (Tokyo, Japan)에서 구입하였다.
Wild type (Nrf2 +/+) 및 Nrf2 knockout (Nrf2 -/-) murine embryonic fibroblast (MEF) celle 가톨릭대학교 약학대학곽미경 교수로부터 분양받아 10% FBS가 포함된 IMDM에서 배양하였다26). 각 세포는 100 mm 배양접시에서 80% confluency에 도달하도록 배양한 후 multiwell plate에 계대 배양하여 실험에 사용하였다.
金櫻子 (나눔제약; 원산지, 중국; 규격, 생약규격; 수입원, 동경종합상사(주); 품질검사연월일, 2009년 10월 20일; 품질 검사기관, 한국의약품수출입협회)는 대원약업사 (Daegu, Korea) 에서 구입하였다. 증류수 세척 후 음건한 건조중량 200 g의 金櫻구에 물 1.
Realtime PCRe SyBr Green premix (Takara Bio, Shiga, Japan)와 CFX96TM thermalcycler (Biorad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 증폭하였다. 본 연구에 사용한 primer 는 Bioneer에서 합성하였으며, 염기서열 정보는 Table 1과 같다. 각 유전자의 C_T 값은 GAPDH 유전자의 C_T 값으로 보정하여 상대 정량하였으며, melting curve 분석을 통해 증폭된 PCR 산물의 특이성을 확인하였다.

데이터처리

본 연구의 각 처리군은 one way analysis of variance 분석을 사용하여 통계적 유의성을 검정하였다 (p<0.05 또는 p<0.01). 사후검정은 등분산 가정이 성립 하였을 때에는 Tukey HSD test를 이용하였고, 등분산 가정이 성립하지 않았을 경우에는 Tamhane test를 실시하였다.
01). 사후검정은 등분산 가정이 성립 하였을 때에는 Tukey HSD test를 이용하였고, 등분산 가정이 성립하지 않았을 경우에는 Tamhane test를 실시하였다. 모든 실험 결과는 mean±S.

이론/모형

미토콘드리아 막 전위의 변화는 막투과성 양이온 형광염료인 rhodamine123을 이용하여 이전 보고한 방법에 따라 수행하였다27). 약물 처치가 완료된 세포에 0.
세포 내 활성산소종의 측정은 DCFH-DA를 이용하여 이전 보고한 방법에 따라 수행하였다²⁷⁾. 처치된 세포를 10 µM DCFH-DA로 1시간 동안 37℃에서 반응하여 형성된 DCF의형광강도를 excitation (485 nm), emission (530 nm)의 파장에서 Infinite M200 automatic microplate reader (Tecan)를 이용하여 측정하였다.
세포 생존율은 MTT assay를 통해 측정하였다. 세포는 24-well plate에 5×10⁴ cells/well 농도로 분주하여 24시간 동안 배양하였다.

성능/효과

1. RLE는 HepG2 cell에서 AA+iron에 의한 세포 독성을 농도 의존적으로 억제하였고, 이 과정에서 세포자멸사 관련 단백질들의 변화를 억제하였다.
2. RLE는 HepG2 cell에서 AA+iron에 의한 GSH 고갈, 활성산소의 축적, 미토콘드리아 막 전위 저하를 억제하였다.
3. RLE는 Nrf2의 핵 내 축적을 증가시켰고, ARE 결합을 통한 Nrf2의 전사 활성화와 항산화 유전자군(GSTA2, GCLC, NQO-1 및 SESN₂)의 전사를 증가시켰다.
RLE에 의한 세포 보호에 미토콘드리아 막 전위 회복이 관여하는지 알아보기 위하여 flow cytometry 분석을 통하여 미토콘드리아 막 전위를 측정하였다. AA+iron 의 처치는 rhodamine123 염색을 통한 RN₁ fraction에 해당되는 세포의 수를 control cell (3.93±0.76%) 대비 약 77.06±1.89%로 증가시켰으며, 100 µg/ml RLE 전처치는 AA+iron에 의해 증가한 RN₁ fraction을 4.58±1.28%로 통계적으로 유의하게 감소시켰다. 이와 더불어 RLE 100 µg/ml 단독 처치시 RN₁ fraction의 비율은 6.
따라서 RLE에 의한 Nrf2의 활성화가 Nrf2 표적 유전자군 (예, 항산화 유전자)의 발현을 증가시킬 수 있는지 리포터 유전자 및 realtime RT-PCR 분석을 통해 연구하였다. GSTA2-luciferase를 안정적으로 발현하는 재조합 HepG2 cell에 30-300 µg/ml RLE를 24시간 처치하였을 때 luciferase 활성이 증가하는 경향을 나타내었으며, 100 및 300 µg/ml의 RLE 처치에 의해 리포터 유전자 활성이 2.07±0.11, 2.35±0.07배로 통계적으로 유의하게 증가하였다. 이와 더불어 realtime RT-PCR 분석 결과, 100 µg/ml RLE (24시간)의 처치는 GCLC, NQO-1, SESN2 mRNA 양을 통계적으로 유의하게 증가시켰다(Fig.
5A). HepG2 cell과 동일하게 wild type MEF cell (Nrf2 +/+)에서도 AA+iron에 의한 세포독성이 나타났으며, 100 µg/ml RLE의 전처치는 AA+iron 에 의한 세포 독성을 통계적으로 유의하게 억제하였다. 그러나, AA+iron에 대한 RLE의 세포 보호 효과가 Nrf2 -/-cell에서는 나타나지 않았다(Fig.
연구하였다. HepG2 cell에 10-300 µg/ml RLE를 한 시간 전처치하고 AA (10 µM, 12시간)와 iron (5 µM, 1시간)을 순차적으로 처치한 결과, AA+iron 처치에 의해 감소한 세포생존율 (43.72±8.86%)이 RLE 농도 의존적으로 증가하였다. 특히 30, 100 및 300 µg/ml RLE는 AA+iron에 의해 감소한 세포 생존율을 98.
산화적 스트레스 또한 스트레스에 대한 세포의 적응반응의 하나로서 Nrf2를 활성화시킬 수 있다¹³⁾. HepG2 cell에 100 µg/ml RLE 단독처치 시 세포 내 GSH 함량이 증가하는 경향을 보인 결과와 더불어 세포 내 활성산소 및 미토콘드리아 막 전위의 저하가 관찰되지 않은 결과를 종합한다면 RLE가 세포 내 산화적 스트레스를 유발하여 Nrf2를 활성화시키는 것은 아닌 것으로 생각된다.
AA+ iron에 의한 세포 독성에 대한 RLE의 세포 보호 효능에 세포자멸사 관련 단백질의 억제가 관여하는지 알아보기 위하여 immunoblot 분석을 실시하였다. HepG2 cell에서 AA+iron 의 처치는 기존에 보고된 바와 같이 세포자멸사 관련 단백질 (PARP, procaspase-3, Bcl2)의 발현을 억제하였다. 그러나, 100 µg/ml RLE 전처치는 AA+iron에 의한 세포자멸사 관련 단백질들의 발현 감소를 억제하여 이들 단백질들의 발현을 control cell 수준으로 회복시켰다(Fig.
3B). RLE에 의한 Nrf2의 핵 내 축적이 ARE 와의 결합을 통한 표적 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있는지 규명하기 위하여 ARE-luciferase를 안정적으로 발현하는 재조합 HepG2 cell에서 리포터 유전자 활성을 관찰한 결과, 30-300 µg/ml RLE 처치에 의하여 ARE 의존적 luciferase 활성이 통계적으로 유의하게 증가하였다(Fig. 3C). 이상의 결과는 RLE에 의한 산화적 스트레스의 억제에 Nrf2의 활성화가 관여할 수 있음을 시사한다.
2A). 다음으로 세포 내 활성산소종 축적을 DCFH-DA를 이용한 형광 강도로서 측정한 결과, 100 µg/ml RLE의 전처치는 AA+iron에 의하여 증가된 활성산소종을 통계적으로 유의한 수준으로 감소시켰으며, RLE 단독 처치에 의해서는 세포 내 활성 산소 종의 증가가 관찰되지 않았다(Fig. 2B). AA+iron에 의한 산화적스트레스는 미토콘드리아 막 전위의 저하를 수반하여 rhodamine123 에 대한 형광강도가 저하된 세포의 수 (RN₁ fraction)를 증가시킨다29, 30).
이와 더불어 RLE의 AA +iron에 대한 세포 보호 효능이 Nrf2 -/- cell에서 상쇄되었다. 따라서 RLE는 Nrf2의 활성화를 매개로 항산화 유전자들의 발현을 유도하여 세포 내 GSH의 증가, 활성산소의 억제 및 미토콘드리아 기능 회복을 통하여 세포 보호 효능을 가지는 것으로 생각된다.
본 연구그룹에서는 AA+iron 독성 모델을 활용하여 皂角子, 紅蔘, 木通, 艾葉 등의 다양한 本草 추출물 및 本草 유래 활성 성분이 세포 보호 효능이 있음을 보고하였으며 27, 29, 30, 35-37), 간질환 치료에 활용 가능한 方劑를 구성하는 100여 종의 本草들에 대한 효능 탐색 연구를 통하여 金櫻子 가 산화적 스트레스에 대한 억제 효능을 가질 수 있음을 도출하였다. 본 연구에서 金櫻子 열수 추출물, RLE가 처치 농도 의존적으로 AA+iron에 의한 세포 독성을 억제하였으며, 최대 세포 보호 효과를 나타내었던 100 µg/ml RLE의 전처치가 AA+iron에 의한 활성산소의 증가, GSH의 고갈, 미토콘드리아 막 전위의 저하 및 세포자멸사 관련 단백질들의 변화를 통계적으로 유의하게 억제하였다.
Irone 대표적 산화적 스트레스 유발물질로서 세포 내에서 Fenton 반응 (Harbor-Weiss 반응)을 통하여 hydroxyl radical과 (per) ferry radical의 생성을 촉진하며, 세포 내 다양한 분자의 과산화를 통하여 세포 손상을 가속화시킨다³⁴⁾. 본 연구그룹에서는 선행보고를 통하여 HepG2 cell에서 AA와 iron 병용 처치 시 활성산소의 증가, GSH의 고갈, 미토콘드리아 막 전위의 저하 및 세포자멸사 신호회로의 활성화에 의한 세포 독성이 촉진됨을 보고하였고, 본 연구에서도 선행 연구 결과와 동일하게 10 µM AA (12시간)와 5 µM iron (1시간)의 병용 처치에 의해 세포 내 활성산소의 증가, GSH의 고갈, 미토콘드리아 막 전위의 저하 및 세포자멸사의 활성화에 의한 세포 독성이 나타남을 확인하였다. 따라서, AA와 iron 처치 모델은 산화적 스트레스에 의한 세포 사멸의 과정을 분자 수준에서 연구할 수 있는 모델일 뿐 아니라, 더불어 산화적 스트레스를 억제할 수 있는 다양한 후보 소재를 발굴하는데 활용가치가 높은 세포 모델이다.
본 연구에서 金櫻子 열수 추출물, RLE가 처치 농도 의존적으로 AA+iron에 의한 세포 독성을 억제하였으며, 최대 세포 보호 효과를 나타내었던 100 µg/ml RLE의 전처치가 AA+iron에 의한 활성산소의 증가, GSH의 고갈, 미토콘드리아 막 전위의 저하 및 세포자멸사 관련 단백질들의 변화를 통계적으로 유의하게 억제하였다.
우선, HepG2 cell에 100 µg/ml RLE를 1시간에서 24시간까지 처치하고 핵 분획 단백질을 분리하여 Nrf2 발현을 immunoblot 분석을 통해 관찰한 결과, RLE에 의해 Nrf2의핵 내 축적이 RLE 처치 1시간 이후부터 증가하기 시작하였고, 3시간 이후부터 통계적으로 유의하게 증가하여 24시간까지 유지되었다(Fig. 3A). 이와 더불어 최대 축적을 보였던 6시간을 기준으로 RLE 처치 농도에 따른 Nrf2의 핵 내 축적을 관찰한 결과, 30-300 µg/ml RLE 처치에 의하여 Nrf2의 핵 내 축적이 control cell과 비교하여 통계적으로 유의하게 증가하였다(Fig.
4). 이상의 결과는 RLE가 Nrf2의 활성화에 의해 항산화 유전자의 발현을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
3C). 이상의 결과는 RLE에 의한 산화적 스트레스의 억제에 Nrf2의 활성화가 관여할 수 있음을 시사한다.
5B). 이상의 결과는 RLE의세포 보호 효능에 Nrf2의 활성화가 기여하는 것을 시사한다.
1B). 이상의 결과는, RLE가 HepG2 cell에서 AA+iron에 의해 유도된 세포자멸사에 대한 세포 보호 효능이 있음을 나타낸다.
07배로 통계적으로 유의하게 증가하였다. 이와 더불어 realtime RT-PCR 분석 결과, 100 µg/ml RLE (24시간)의 처치는 GCLC, NQO-1, SESN2 mRNA 양을 통계적으로 유의하게 증가시켰다(Fig. 4). 이상의 결과는 RLE가 Nrf2의 활성화에 의해 항산화 유전자의 발현을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
3A). 이와 더불어 최대 축적을 보였던 6시간을 기준으로 RLE 처치 농도에 따른 Nrf2의 핵 내 축적을 관찰한 결과, 30-300 µg/ml RLE 처치에 의하여 Nrf2의 핵 내 축적이 control cell과 비교하여 통계적으로 유의하게 증가하였다(Fig. 3B). RLE에 의한 Nrf2의 핵 내 축적이 ARE 와의 결합을 통한 표적 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있는지 규명하기 위하여 ARE-luciferase를 안정적으로 발현하는 재조합 HepG2 cell에서 리포터 유전자 활성을 관찰한 결과, 30-300 µg/ml RLE 처치에 의하여 ARE 의존적 luciferase 활성이 통계적으로 유의하게 증가하였다(Fig.

후속연구

향후 金櫻구의 Nrf2 활성화와 관련된 세포 내 신호 네트워크의 규명과 추가적인 후속 연구가 진행된다면, 급만성 간질환 치료약물로서 金櫻구를 활용할 수 있을 것으로 기대된다. 아울러, 金櫻구를 포함한 方劑를 급만성 간질환 치료에 활용할 수 있는 학문적 기반이 마련될 수 있을 것으로 생각된다.
있다. 향후 金櫻구의 Nrf2 활성화와 관련된 세포 내 신호 네트워크의 규명과 추가적인 후속 연구가 진행된다면, 급만성 간질환 치료약물로서 金櫻구를 활용할 수 있을 것으로 기대된다. 아울러, 金櫻구를 포함한 方劑를 급만성 간질환 치료에 활용할 수 있는 학문적 기반이 마련될 수 있을 것으로 생각된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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