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문제 정의
- 또한, 국내에서는 인체 혈청시료에서의 분석법 및 한국인을 대상으로 한 혈중 이세파마이신의 pharmacokinetic parameter에 대한 보고가 없다. 따라서, 본 연구에서는 본 연구에서 확립한 분석조건을 검증하여 건강한 한국인 지원자 8인의 혈중 이세파마이신의 혈중 농도변화를 측정하여 약물동태학적 파라메타를 구하고자 하였다.
- 본 연구에서는 chromophore가 없어 흡광광도계로 측정하기 어려운 이세파마이신의 정량분석을 위해 phenylisocyanate(PIC)를 탐침으로 사용하여16,17) 이세파마이신-PIC 유도체를 합성한 후 HPLC-UV를 이용하여 분석할 수 있는 방법으로 혈중 이세파마이신의 낮은 농도까지 분석하여 체내 약물동태를 측정할 수 있는 방법을 검토하고자 하였다. 이 방법은 비용 면에서 LC/MS/MS(tandem mass spectroscopy)나 형광 검출기 혹은 RIA 등에 비해 저렴하게 이용 할 수 있고 조작이 간편하다.
- 이세파마이신(Fig. 1)은 chromophore를 가지고 있지 않으므로 UV 흡광분석법을 이용하기 어려워 본 연구에서는 PIC를 이용한 유도체를 만들고 이세파마이신-PIC 유도체의 형성 및 그 분자량을 확인할 목적으로 유도체의 질량분석을 행한 결과는 Fig. 2에 나타내었다. 김 등16,17)은 아미노글라이코사이드인 겐타마이신, 카나마이신, 네오마이신 등과 PIC와 결합하여 얻어진 유도체의 특성을 보고하였다.
제안 방법
- 02 M hexanesulfonic acid 함유)(B 용액) 두 용액을 gradient method로 사용하였다. 10분까지 A 용액 100%를, 10분부터 30분까지는 A 용액 100%에서 B용액 100%로 직선적으로 변화시켜 분석에 이용하였다. 유속은 1.
- 검량선 작성 시와 동일한 농도로 작성하여 얻어진 크로마토그램으로부터 이세파마이신과 내부표준물질의 피크면적비를 구하여 검량선을 작성하고 직선성을 검증하였다.
- 검량선 작성 시와 동일한 농도를 작성하여 5일간 연속 실험하였으며, 일내 5회 연속 실험하여 얻어진 크로마토그램으로부터 이세파마이신과 내부표준물질의 피크면적 비를 구하였다.
- 이 분석 조건은 직선성, 정확성 및 정밀성 등의 validation 조건을 만족하였다. 또한, 확립한 분석 방법으로 이세파마이신 800 mg을 건강한 한국인 지원자 8명에게 정맥 내점적투여한 후 약물동력학적 파라메타를 구하였다. 따라서, 본 HPLC-UV 분석방법은 혈중 이세파마이신 분석에 간단하고 편리하여 이세파마이신의 생체이용율 연구에 효율적으로 적용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 2 cm이었다. 본 시험에 참여하는 지원자는 피험자에 대한 설명회를 통하여 이 시험의 목적, 시험약의 특성, 시험내용, 주의사항 및 보상내용에 대한 설명과 질의응답을 거쳐 시험에 대해 충분히 숙지한 후 자발적인 의사에 따라 서면동의절차를 거쳐 본 실험에 참가하였다. 모든 지원자는 시험 10일 전부터 항생제 및 진통제를 포함한 일체의 약물 복용을 금지하였을 뿐만 아니라 흡연 및 xanthine계 음료 등을 제한 관리하였다.
- 분석조건에서 설정된 분석방법에 대한 검증을 국립독성 연구원 생체시료분석법 validation에 의하여 아래와 같이 특이성, 직선성, 정밀성 및 정확성을 평가하였다.
- 상기에서 확립된 HPLC 분석 조건으로 각 피험자들의 혈청을 분석하여 얻어진 피크 면적 비를 검량선에 대입하여 계산함으로, 각 피험자들의 혈청 중 이세파마이신의 농도 추이를 알 수 있었다. Fig.
- 5 ml에 내부표준물질인 카나마이신(100 µg/ml) 용액 100 µl를 첨가하여 시료로 사용하였다. 위의 HPLC 분석조건에 따라 얻어진 크로마토그램으로부터 이세파마이신 피크면적과 내부표준물질 피크면적의 비를 구하여 검량선을 작성하였다.
- 이로부터 검량선 최소 농도인 1 µg/ml를 최소정량한계농도 (lower limit of quantification, LLOQ)로 설정하여 이세파마이신 농도를 정량하였다.
- 이로부터 일간 및 일내 정밀성 및 정확성을 각각 평가하였으며, 변동계수는 최저정량한계농도(LLOQ)에서는 20% 이내, 나머지 농도에서는 15% 이내의 값을 나타내어야 한다.
- 이를 공 혈청으로 희석하여 최종 약물농도가 1, 2, 5, 10, 50 및 100 µg/ml가 되도록 하여 검량선 작성 시료로 하였다.
- 이액에 김 등16,17)의 방법에 따라 TEA(5 mg/ml in acetonitrile)와 PIC(5 mg/ml in acetonitrile)를 각각 100 µl를 첨가하여 혼합한 후 상온에서 10분간 방치하여 유도체를 만들었다. 이를 원심분리 한 후 상등액을 취하여 위의 HPLC 분석조건에 따라 분석하였다.
- 이세파마이신 800 mg을 건강한 한국인 지원자 8명에게 15분간 정맥으로 점적투여 하여 얻은 혈청 중 약물농도-시간 곡선으로부터 최고혈청중농도(Cmax)와 최고 혈청중농도 도달시간(Tmax), 혈청중약물농도-시간곡선하 면적 (AUC), 소실속도정수(Ke), 및 소실반감기(t1/2)는 식품의약품안전청이 제공한 K-BE test를 이용하여 산출하였다.18) 모든 측정치와 계산치는 평균±표준편차로 나타내었다.
- 이세파마이신-PIC 유도체16,17)의 분자량을 확인하기 위하여 질량분석을 행하였으며, 본 분석에 사용한 mass 범위는 m/z 400~2,000이었다.
- 혈청 이세파마이신 농도를 측정하기 위하여 UV 검출기를 이용한 HPLC의 이세파마이신 분석 조건을 확립하였다. 이세파마이신은 chromophore를 가지고 있지 않으므로 UV 흡광분석법을 이용하기 어려워 본 연구에서는 phenylisocyanate(PIC)를 이용한 유도체 즉, 이세파마이신-PIC 유도체를 만들어 HPLC-UV를 이용하여 측정하였다. 이 분석 조건은 직선성, 정확성 및 정밀성 등의 validation 조건을 만족하였다.
- 김 등16,17)은 아미노글라이코사이드인 겐타마이신, 카나마이신, 네오마이신 등과 PIC와 결합하여 얻어진 유도체의 특성을 보고하였다. 이와 유사하게 이세파마이신의 분자구조에서 볼 수 있듯이 PIC와 결합 할 수 있는 4개의 amino group과 PIC와 결합하여 얻어진 유도체의 분자량[M+H+]이 1,046을 나타내어 이세파마이신-PIC 유도체를 확인하였다.
- 1(정량한계 농도), 2, 5, 10, 50 및 100 µg/ ml 등 6단계 농도의 이세파마이신 혈청 표준액을 상기의 검체 처리 방법으로 처리하여 분석한 결과는 Table I과 같았다. 정밀성은 이세파마이신의 피크면적 비의 표준편차를 피크면적 비의 평균값의 백분율(%)로서 구하였다. 하루에 5번 시행하여 일내 정밀성(CV, %)을 구하였고, 5일간 실험을 반복 시행하여 일간 정밀성(CV, %)을 구하였다.
- 채혈 시간은 약물의 혈중소실반감기(2~3시간)을 토대로 반감기의 3배 이상, 또는 AUCt가 AUC∞의 80%에 해당되는 시점인 12시간 동안으로 하였으며, 채혈 횟수는 투여직전, infusion 시작 후 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 2, 4, 6, 8 및 12시간으로 하여 총 12회에 걸쳐 각각 5ml씩 채혈하였다.
- 컬럼은 Synergi 4µ Fusion-RP 80A(Phenomenex U.S.A., 4.6×250 mm)를 사용하였으며, 이동상은 아세토니트릴 : 증류수=35 : 65(0.02 M hexanesulfonic acid 함유)(A 용액)와 아세토니트릴 : 증류수=70 : 30(0.02 M hexanesulfonic acid 함유)(B 용액) 두 용액을 gradient method로 사용하였다.
- 피험자로부터 각 시간별로 채취하여 −70℃에 보관했던 혈청시료를 실온에 방치하여 녹인 후 1분간 진탕한 다음 이 혈청 0.5 ml를 취하여 시험관에 옮기고 내부표준물질로 카나마이신(100 µg/ml)를 100 µl 첨가한 후 혼합한 용액을 분석용 시료로 하였다.
- 피험자에 대한 투약은 이세파마이신 800 mg(8 ml, 이세파신 주®)을 정맥으로 15분간 점적주사 하였다.
- 정밀성은 이세파마이신의 피크면적 비의 표준편차를 피크면적 비의 평균값의 백분율(%)로서 구하였다. 하루에 5번 시행하여 일내 정밀성(CV, %)을 구하였고, 5일간 실험을 반복 시행하여 일간 정밀성(CV, %)을 구하였다. 본 분석방법의 정밀성 CV%는 일내 정밀성, 일간 정밀성 모두 15% 이내였다.
- 혈청 이세파마이신 농도를 측정하기 위하여 UV 검출기를 이용한 HPLC의 이세파마이신 분석 조건을 확립하였다. 이세파마이신은 chromophore를 가지고 있지 않으므로 UV 흡광분석법을 이용하기 어려워 본 연구에서는 phenylisocyanate(PIC)를 이용한 유도체 즉, 이세파마이신-PIC 유도체를 만들어 HPLC-UV를 이용하여 측정하였다.
- 혈청 중 이세파마이신 및 내부표준물질인 카나마이신의 분석방법을 검토할 때 생체 시료내 다른 물질의 공존 시 이세파마이신과 내부표준물질의 분리 및 정량 분석 능력을 검토하였다.
대상 데이터
- 내부표준물질로 사용한 kanamicin sulfate, hexanesulfonic acid, triethylamine(TEA), 및 phenylisocyanate(PIC)는 Sigma Chemical Co.(St Louis, Mo, U.S.A.)에서, 아세토니트릴(acetonitrile)과 메탄올(methanol)은 HPLC grade(Merck, Germany)를, solid phase extraction 용 카트리지는 SPE Strata-X(Phenomenex, U.S.A.)을 구입하여 사용하였다. Autosampler vial, autosampler vial cap, line filter는 Shiseido 사(Tokyo, Japan)에서 각각 구입하여 사용하였다.
- )을 구입하여 사용하였다. Autosampler vial, autosampler vial cap, line filter는 Shiseido 사(Tokyo, Japan)에서 각각 구입하여 사용하였다. 컬럼은 Synergi 4µ Fusion-RP 80A(Phenomenex U.
- 하루에 5번 시행하여 일내 정밀성(CV, %)을 구하였고, 5일간 실험을 반복 시행하여 일간 정밀성(CV, %)을 구하였다. 본 분석방법의 정밀성 CV%는 일내 정밀성, 일간 정밀성 모두 15% 이내였다. 따라서, 이 결과로부터 혈청 중 이세파마이신에 대한 본 HPLC 분석법은 인체에 대한 생체이용률 시험에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 가지고 있음을 알 수 있었다.
- 본 시험에 최종 선정된 지원자는 모두 남성으로 평균체중은 63.78±5.73 kg, 평균나이는 29.0±2.5세, 및 평균 신장은 172.7±4.2 cm이었다.
- 이로부터 검량선 최소 농도인 1 µg/ml를 최소정량한계농도 (lower limit of quantification, LLOQ)로 설정하여 이세파마이신 농도를 정량하였다. 본 실험에 사용한 검량선은 y=3.2804x+0.897(r2=0.9998)(n=9)이었으며, 이 식에서 y 및 x는 각각 이세파마이신의 피크면적 비 및 이세파마이신의 농도를 나타낸다.
- 이세파마이신 주사제로는 이세파신 주®(황산 이세파마이신 200 mg(역가)/2 ml)와 표준품으로 사용한 황산 이세파마이신 표준품은 유한양행(Seoul, South Korea)에서 제공받아 사용하였다.
- 피험자는 식품의약품 안전청이 고시한 생물학적동등성시험기준에 따라 지원자 모집공고를 통하여 19~55세의 건강한 성인으로 현재 타 약물을 복용하고 있지 않은 지원자를 공고하여 모집하였다. 본 시험에 최종 선정된 지원자는 모두 남성으로 평균체중은 63.
데이터처리
- 18) 모든 측정치와 계산치는 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- 6 hr로 보고되었다. 본 연구에서는 non-compartment model을 이용하여 t1/2 값 1.55 hr를 산출하였다. 이상의 결과로 혈청 이세파마이신의 분석조건이 확립되었으며, 또한 건강한 한국인에서의 이세파마이신 약물동태에 관한 연구는 아직까지 보고된 바 없으므로 이 보고가 처음인 것으로 사료된다.
- 분석용 시료는 solid phase extraction 방법에 의하여 처리한 후 PIC 유도체16,17)를 만들어 HPLC로 분석하였다. 즉, solid phase extraction 추출은 우선 Strata-X cartridge(Phenomenex strata-X 3 ml, 60 mg packing)를 메탄올 2ml로 세척한 후 차례로 0.
- 이액에 김 등16,17)의 방법에 따라 TEA(5 mg/ml in acetonitrile)와 PIC(5 mg/ml in acetonitrile)를 각각 100 µl를 첨가하여 혼합한 후 상온에서 10분간 방치하여 유도체를 만들었다.
성능/효과
- 1) 아미카신과 아주 유사한 활성, 독성 및 PK/PD(약물동태학/약물동력학적) 특징을 가지고 있지만, 아미노글라이코사이드 항생제의 내성에 관여하는 acetyltransferase(AAC(6')-I)를 생성하는 균주에 대해서 resistance하여 여러 가지 아미노글라이코사이드 불활성화효소에 특히 안전한 특징을 지니고 있다.
- 본 분석방법의 정밀성 CV%는 일내 정밀성, 일간 정밀성 모두 15% 이내였다. 따라서, 이 결과로부터 혈청 중 이세파마이신에 대한 본 HPLC 분석법은 인체에 대한 생체이용률 시험에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 가지고 있음을 알 수 있었다.
- 시험방법과 같이 검체를 처리하여 HPLC로 분석하였을 때 얻어진 크로마토그램은 Fig. 3과 같았으며, 이세파마이신의 피크의 유지시간은 약 9.7분, 내부표준물질 피크의 유지시간은 약 18.7분으로 크로마토그램 상에서 나타난 바와 같이 신호 대 잡음 비(S/N ratio)를 10 이상으로 한 분석조건에서 이세파마이신과 내부표준물질은 기타 혈청 성분들과 잘 분리되었다.
- 55 hr를 산출하였다. 이상의 결과로 혈청 이세파마이신의 분석조건이 확립되었으며, 또한 건강한 한국인에서의 이세파마이신 약물동태에 관한 연구는 아직까지 보고된 바 없으므로 이 보고가 처음인 것으로 사료된다.
후속연구
- 또한, 확립한 분석 방법으로 이세파마이신 800 mg을 건강한 한국인 지원자 8명에게 정맥 내점적투여한 후 약물동력학적 파라메타를 구하였다. 따라서, 본 HPLC-UV 분석방법은 혈중 이세파마이신 분석에 간단하고 편리하여 이세파마이신의 생체이용율 연구에 효율적으로 적용할 수 있을 것으로 사료된다.
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