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문제 정의
- 본 총설에서는 국립산림과학원에 보존되어 있는 다양한 외생균근균 자원의 2010~2015년 최근까지 수행한 기초적인 배양특성을 조사한 결과를 소개하고자 한다. 아울러 여기에 소개된 내용들은 다른 연구자들이 균근성 버섯을 연구하고자 할 때 기본 정보로 활용하기를 기대한다.
- 국립산림과학원에서는 이러한 균근성 버섯류의 인공재배뿐만 아니라 이들의 순수분리 배양과 보존, 기초 배양 특성 조사 등에 집중하여 연구를 진행하고 있다. 본 총설은 국립산림과학원에 보존된 많은 균근성 버섯들의 배양특성을 소개한 것으로 차후 균근성 버섯을 연구하고자 하는 이들이 유용한 산림자원을 발굴하는 데에 도움이 되는 기본 정보가 되길 바란다.
제안 방법
- 각 시험 배지는 121°C에서 20분간 고압증기멸균한 후 멸균 petri dish (bottom 85 × height 15 mm)에 25 mL씩 분주하여 응고시켰다.
- 곰보버섯을 포함한 모든 균주는 60일간 배양하였다. 균 생장력을 조사하기 위해 정성 원형 여과지(직경 110 mm, No.5A; Advantec, Tokyo, Japan)에 60일 배양체를 부어 균사체만을 회수한 후 균사체가 함유된 여과지를 70oC 건조기에 넣어 2일간 건조하였다. 삼각 플라스크 한 개에서 생장한 균사체의 건중량을 측정하여 mg/flask 단위로 기록한 후 배양 조건에 따른 균 생장력을 비교하였다.
- 다섯 종류의 시험배지를 유리 삼각플라스크에 20 mL씩 분주한 후 121°C에서 20분간 고압증기멸균한 다음 상온에서 냉각시켰다.
- 대부분의 외생균근균은 고체배지 상에서 생장이 매우 느리기 때문에 배지와 온도별 균사 생장 특성은 배양 60일 후 조사하였다[17]. 단, 곰보버섯(Morchella esculenta) 네 개 균주는 예비 실험을 통해 고체배지에서 균사 생장이 매우 빠른 특성이 관찰되어 60일이 아닌 5일간 배양한 후 조사하였다. 디지털 버어니어 캘리퍼스를 이용하여 접종원의 직경을 제외한 균총의 크기를 mm 단위로 측정한 후 배양 조건에 따른 균 생장력을 비교하였다.
- 단, 곰보버섯을 포함한 모든 균주들은 56일간 배양하였으며 M1과 M2 배지에서 각각 생장한 균사체의 건중량(mg/flask)을 비교하여 질소원 선호도를 조사하였다(t-test, p < 0.05, n = 3).
- 단, 곰보버섯(Morchella esculenta) 네 개 균주는 예비 실험을 통해 고체배지에서 균사 생장이 매우 빠른 특성이 관찰되어 60일이 아닌 5일간 배양한 후 조사하였다. 디지털 버어니어 캘리퍼스를 이용하여 접종원의 직경을 제외한 균총의 크기를 mm 단위로 측정한 후 배양 조건에 따른 균 생장력을 비교하였다.
- 특히 액체배지 내 pH(수소이온농도)의 변화는 균사체 증식에 가장 큰 영향을 줄 수 있는 인자로 여겨지며, 인공배지에서 배양 시 실험자가 액체배지 내 화학적 환경을 인위적으로 변화시켜 균의 생장 특성을 간접적으로 조사할 수 있는 가장 간단한 방법이기도 하다. 따라서 본 총설에서는 구입이 용이한 상용 액체배지(PDB)를 기본으로 하여 pH 변화에 따른 최적 생장 pH 범위를 조사하여 그 결과를 Table 1에 제시하였다.
- 05, n = 3). 또한 두 종류의 질소원에 대한 선호도 차이를 조사하기 위해 각 배지에서의 평균 건중량을 토대로 M1/M2 ratio를 산출하였다.
- 또한 외생균근균의 균사 생장이 가능한 온도 범위와 균사 생장에 가장 적합한 온도를 찾기 위해 PDA를 기본 배지로 하여 각각의 시험균을 접종하고, 다섯 종류의 온도 조건(10°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C)에서 암배양하였다.
- 배지의 pH 변화에 따른 균 생장력과 최적 생장 pH를 조사하기 위해 제조사(Difco)의 권장 방법에 따라 potato dextrose broth (PDB)를 제조한 후 여기에 1M HCl 또는 1M NaOH 등을 가하여 시험배지의 최종 pH가 4, 5, 6, 7, 8이 되도록 하였다[17]. 다섯 종류의 시험배지를 유리 삼각플라스크에 20 mL씩 분주한 후 121°C에서 20분간 고압증기멸균한 다음 상온에서 냉각시켰다.
- 온도는 균류의 생존과 생장에 중요한 영향을 미치며, 특히 상업적으로 활용 가치가 있는 외생균근균인 경우에는 순수배양체의 증식과 보존 효율을 높이기 위해 기본생장 온도(cardinal temperature)를 조사하는 일이 필요하다. 본 총설에서는 외생균근균의 균사체가 생장할 수 있는 최저온도(minimum temperature), 최적 온도(optimum temperature) 및 최고 온도(maximum temperature)를 조사한 후, 총 151개 균주에 대한 최적 균사생장 온도를 Table 1에 제시하였다. 조사 결과 대부분의 외생균근균들은 20~25°C 범위에서 균 생장력이 우수하였으며, 10°C 저온 또는 30°C 고온에서는 균이 전혀 생장하지 못하거나 생장력이 미약한 특성을 보였다(Table 1, Table 3).
- 국립산림과학원은 우리나라 산림에 분포하는 외생균근균의 수집과 순수배양체의 분리, 균사 생장 특성과 효소 활성에 관한 균류의 기초적인 배양 특성을 조사하고 있다[15, 16]. 본 총설은 배지의 종류, 온도의 변화, pH의 변화 및 질소원의 종류에 따른 외생균근균의 배양 특성을 조사한 것으로 다음과 같은 방법을 이용하여 각 균주별로 균 생장력을 측정하였다. 외생균근균의 균사 생장이 가능한 기본 배지와 균사 생장에 가장 적합한 고체배지를 알기 위해 네 종류의 배지를 준비하였다.
- 5A; Advantec, Tokyo, Japan)에 60일 배양체를 부어 균사체만을 회수한 후 균사체가 함유된 여과지를 70oC 건조기에 넣어 2일간 건조하였다. 삼각 플라스크 한 개에서 생장한 균사체의 건중량을 측정하여 mg/flask 단위로 기록한 후 배양 조건에 따른 균 생장력을 비교하였다. 외생균근균의 균사 생장에 무기 질소원이 끼치는 영향을 알기 위해 MMN 배지[19]의 일부 조성을 변경한 두 종류의 MMN 변형 액체배지 M1과 M2를 제조하였다.
- 시험배지가 들어 있는 삼각플라스크 한 개당 시험균(직경 6 mm)을 한 개씩 접종하고, 25±2°C에서 정치 상태로 암배양하였다.
- 삼각 플라스크 한 개에서 생장한 균사체의 건중량을 측정하여 mg/flask 단위로 기록한 후 배양 조건에 따른 균 생장력을 비교하였다. 외생균근균의 균사 생장에 무기 질소원이 끼치는 영향을 알기 위해 MMN 배지[19]의 일부 조성을 변경한 두 종류의 MMN 변형 액체배지 M1과 M2를 제조하였다. M1 배지(glucose 10 g, NH4Cl 0.
- 우리나라 산림에서 수집한 외생균근균의 온도별 균사 생장 특성을 부후균과도 비교하였다. 외생균근균과 부후균 모두 대부분의 균주에서 최적 생장 온도 범위는 20~25°C로 크게 다르지 않았다[18].
- 산림에는 무기 형태의 질소원이 풍부하며 많은 균근균들은 암모늄이나 질산염 형태의 무기 질소원을 이용할 수 있는 능력이 있으며, 버섯을 형성하는 대부분의 균류들은 질산염보다 암모늄 형태의 무기 질소원을 더 선호하는 경향이 있다[27]. 이러한 특성들이 우리나라 산림에서 수집한 균주들에게도 적용되는지 알기 위해 질산염과 암모늄 형태의 무기 질소원이 각각 함유된 MMN 변형 배지(M1과 M2)에 배양하여 외생균근균들의 질소원 선호도를 조사하였다.
대상 데이터
- 연기싸리버섯(R. fumigata KFRI 2368)은 15~20°C에서, 일본연지그물버섯(H. japonicus KFRI 1224), 꾀꼬리그물버섯(B. laetissimus KFRI 1489), 그물버섯(B. edulis KFRI 1191), 그물버섯속(Boletus sp. KFRI 1462) 등은 20~25°C에서 생장하였다.
- 본 총설은 배지의 종류, 온도의 변화, pH의 변화 및 질소원의 종류에 따른 외생균근균의 배양 특성을 조사한 것으로 다음과 같은 방법을 이용하여 각 균주별로 균 생장력을 측정하였다. 외생균근균의 균사 생장이 가능한 기본 배지와 균사 생장에 가장 적합한 고체배지를 알기 위해 네 종류의 배지를 준비하였다. 상용 가능한 세 종류의 배지 즉 potato dextrose agar (PDA), malt extract agar (MEA), Sabouraud dextrose agar (SDA)는 제조사(Difco, Detroit, MI, USA)의 권장 방법에 따라 제조하였다[17, 18].
이론/모형
- 외생균근균의 균사 생장이 가능한 기본 배지와 균사 생장에 가장 적합한 고체배지를 알기 위해 네 종류의 배지를 준비하였다. 상용 가능한 세 종류의 배지 즉 potato dextrose agar (PDA), malt extract agar (MEA), Sabouraud dextrose agar (SDA)는 제조사(Difco, Detroit, MI, USA)의 권장 방법에 따라 제조하였다[17, 18]. 또 다른 한 종류는 비상용 배지로, 반합성 배지인 modified Melin-Norkrans (MMN; glucose 10 g, malt extract 3 g, (NH4)2 HPO4 0.
성능/효과
- 0 이상으로 나타나 질산염보다 암모늄 형태의 질소원을 선호하는 경향이 더 뚜렷했다. M1/M2 ratio 분석 결과 비단그물버섯과(Suillaceae)에 속하는 균주들 중 황금비단그물버섯(S. cavipes KFRI 1980)은 3.0배, 큰비단그물버섯(S. grevillei KFRI 1211)은 2.5배, 붉은비단그물버섯(S. pictus KFRI 2021, 2238)은 2.1배, 흰거스러미광대버섯(Amanita cokei f. reseotinta KFRI 1974)은 2.4배, B. griseus var. fuscus (KFRI 1362)는 2.
- 송이류는 한국, 일본, 중국에서 상업적으로 중요하게 취급되어 왔는데 우리나라 산림에서 수집한 송이와 근연종인 가송이의 배양 특성을 비교한 결과 두 균종 모두 MEA에서는 전혀 생장하지 못했으며, SDA에서는 가송이보다 송이가 생장하지 못하는 빈도가 높았다. PDA와 MMN에서는 두 균종 모두 생장하였는데 송이의 최적 생장배지는 PDA, 가송이의 최적 생장배지는 PDA 또는 MMN이었다. 전반적으로 가송이의 균 생장력은 송이에 비해 약했는데, PDA, SDA, MMN에서 가송이의 균 생장대의 크기는 송이에 비해 각각 2~10배, 2.
- griseus var. fuscus (KFRI 1362)는 2.5배, 다발방패버섯(Albatrellus confluens KFRI 837)은 2.6배, 독송이(T. muscarium KFRI 1991)는 2.9배, 그리고 꾀꼬리큰버섯(H. aurantiaca KFRI 1824)은 3.5배 더 암모늄염 형태의 무기 질소원에 대한 선호도가 높았다.
- griseus var. fuscus KFRI 2382와 꾀꼬리버섯속(Cantharellus sp. KFRI 2033)은 pH 8.0에서 각각 균 생장이 우수하였다.
- hatsudake KFRI 1164) 등은 pH 4~7의 넓은 범위에서도 균체량이 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않아 PDB를 기본 배지로 액체배양하는 경우, 그들의 균사 생장에 배지의 pH가 끼치는 영향력이 적음을 알 수 있었다. 곰보버섯(M. esculenta KFRI 2075)과 젖비단그물버섯(S. granulatus KFRI 2240) 역시 pH 5~8에서 균체량에 유의한 차이가 없었으며, 이러한 양상은 모래밭버섯(P. arhizus KFRI 1403)이나 황금씨그물버섯(X. affine KFRI 1421)에서도 유사한 것으로 조사되었다.
- laeticolorus, 모래밭버섯, 밤색망그물버섯, 향버섯 등은 PDA 배지에서 균 생장력이 가장 높았다. 광대버섯속(Amanita sp. KFRI 1220), 외대버섯속(Entoloma sp. KFRI 1839), 다색벚꽃버섯(H. russula KFRI 1488, 1987), 황소비단그물버섯(Suillus bovinus KFRI 1231), 비단그물버섯(S. luteus KFRI 1458) 등은 SDA 배지에서 균 생장력이 가장 높았다. 긴대밤그물버섯(Boletellus elatus), 흑자색그물버섯(Boletus violaceofuscus), 일본연지그물버섯, 접시껄껄이그물버섯, 끈적쓴맛그물버섯(Tylopilus castaneiceps), 황금씨그물버섯 등 그물버섯과(Boletaceae)에 속하는 여러 균주들을 비롯하여 파리버섯, 싸리버섯속(Ramaria sp.
- 균사 생장이 가능한 온도 범위(cardinal temperature) 중 최적 생장온도(optimal termperature)를 조사한 결과 외대버섯속(Entoloma sp. KFRI 1575)은 10~25°C, 알버섯속(Rhizopogon sp. KFRI 1425)은 15~30°C로 나타나 최적 생장 온도 범위가 매우 넓은 것을 알 수 있다(Table 1).
- luteus KFRI 1458) 등은 SDA 배지에서 균 생장력이 가장 높았다. 긴대밤그물버섯(Boletellus elatus), 흑자색그물버섯(Boletus violaceofuscus), 일본연지그물버섯, 접시껄껄이그물버섯, 끈적쓴맛그물버섯(Tylopilus castaneiceps), 황금씨그물버섯 등 그물버섯과(Boletaceae)에 속하는 여러 균주들을 비롯하여 파리버섯, 싸리버섯속(Ramaria sp. KFRI 1670, 1679, 1680, 1825)의 균주들은 MMN 배지에서 균 생장력이 가장 높았다.
- 달걀버섯(Amanita hemibapha KFRI 1674)과 산속그물버섯아재비(B. pseudocalopus KFRI 1973)는 한 종류의 온도(25°C)에서만 균이 생장하여 온도 변화에 매우 민감한 균주임을 알 수 있었다.
- 배양 온도 변화에 대한 민감도를 외생균근균의 과별로 조사한 결과 비단그물버섯과(Suillaceae)에 속하는 균종들은 저온보다 고온에서 배양 시 균 생장력이 약했으며, 그물버섯과(Boletaceae)는 다른 과에 비해 저온과 고온 모두에서 균 생장력이 취약한 것으로 분석되었다.
- 송이류는 한국, 일본, 중국에서 상업적으로 중요하게 취급되어 왔는데 우리나라 산림에서 수집한 송이와 근연종인 가송이의 배양 특성을 비교한 결과 두 균종 모두 MEA에서는 전혀 생장하지 못했으며, SDA에서는 가송이보다 송이가 생장하지 못하는 빈도가 높았다. PDA와 MMN에서는 두 균종 모두 생장하였는데 송이의 최적 생장배지는 PDA, 가송이의 최적 생장배지는 PDA 또는 MMN이었다.
- 송이와 가송이의 질소원 선호도를 비교한 결과 송이에 속하는 모든 시험 균주들과 가송이의 일부 균주들은 질산염보다 암모늄 형태의 질소원을 더 선호하였다. 가송이는 우리나라보다 일본에 더 많이 분포하는 것으로 알려져 있는데, Terashima [28]는 이미 실험실 내 배양을 통해 일본에서 수집한 가송이 균주의 질소원 이용 능력을 조사하였으며, 질산염 형태의 질소원(예: KNO3, NaNO3)보다는 암모늄 형태의 질소원(예: NH4Cl, (NH4)2C4H4O6)이 함유된 배지에서 더 잘 생장한다고 보고하였다.
- rubescens KFRI 1660, 2374), 일본연지그물버섯(Heimioporus japonicus), 다색벚꽃버섯, 접시껄껄이그물버섯, 노란젖버섯(Lactarius chrysorrheus), 젖버섯아재비(Lactarius hatsudake), Lactarius laeticolorus, 제주쓴맛그물버섯(Tylopilus neofelleus), 당귀젖버섯(Lactarius subzonarius KFRI 1633) 등이다. 연기싸리버섯(Ramaria fumigata KFRI 2367, 2368)은 MMN 배지에서만 생장하는 특성이 있어 총 151개의 시험 균주들 중 균사 생장이 가능한 배지의 범위가 가장 좁았다. 이와 달리 광대버섯과에 속하는 Amanita ibotengutake KFRI 1170, 1189와 파리버섯(Amanita melliceps KFRI 581, 1180), 그물버섯과(Boletaceae)에 속하는 Boletus griseus var.
- 외생균근균의 균사가 생장할 수 있는 배지 중 최적의 생장배지를 조사한 결과 송이, 가송이, 할미송이, 땅송이 등 송이과에 속하는 균주들과 가지외대버섯(E. cyanonigrum), 젖버섯아재비, L. laeticolorus, 모래밭버섯, 밤색망그물버섯, 향버섯 등은 PDA 배지에서 균 생장력이 가장 높았다. 광대버섯속(Amanita sp.
- 외생균근균이 생장할 수 있는 배지의 종류를 알기 위해 균 생장력을 조사한 결과 대부분의 외생균근균들은 MEA나 SDA 배지에서보다 PDA나 MMN 배지에서 생장이 우수하였다. MEA 배지에서는 많은 균주들이 아예 생장하지 못하거나 생장력이 미약했다(Table 1, Table 2).
- 조사 결과 대부분의 외생균근균들은 20~25°C 범위에서 균 생장력이 우수하였으며, 10°C 저온 또는 30°C 고온에서는 균이 전혀 생장하지 못하거나 생장력이 미약한 특성을 보였다(Table 1, Table 3).
- 총 117개 균주를 대상으로 배양 특성을 조사한 결과 대부분의 외생균근균들은 pH 7~8보다 pH 4~6에서 균 생장력이 더 컸다. 균체량이 최대가 되는 최적 PDB pH가 4~5 범위인 외생균근균은 B.
- 총 134개 균주를 대상으로 조사한 결과 송이, 독송이(Tricholoma muscarium), 황금비단그물버섯, 젖비단그물버섯, 붉은비단그물버섯(Suillus pictus), 접시껄껄이그물버섯, 제주쓴맛그물버섯, 붉은점박이광대버섯 그리고 싸리버섯(R. botrytis KFRI 1018), 싸리버섯속(Ramaria sp. KFRI 1670, 1679, 1680, 1825) 등은 질산염보다 암모늄 형태의 질소원을 더 선호하였다. 특히 아홉 개 균주는 M1/M2 ratio가 2.
- KFRI 1670, 1679, 1680, 1825) 등은 질산염보다 암모늄 형태의 질소원을 더 선호하였다. 특히 아홉 개 균주는 M1/M2 ratio가 2.0 이상으로 나타나 질산염보다 암모늄 형태의 질소원을 선호하는 경향이 더 뚜렷했다. M1/M2 ratio 분석 결과 비단그물버섯과(Suillaceae)에 속하는 균주들 중 황금비단그물버섯(S.
- 한편 송이(T. matsutake KFRI 1266), 까치버섯(P. multiplex KFRI 1678), 젖버섯아재비(L. hatsudake KFRI 1164) 등은 pH 4~7의 넓은 범위에서도 균체량이 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않아 PDB를 기본 배지로 액체배양하는 경우, 그들의 균사 생장에 배지의 pH가 끼치는 영향력이 적음을 알 수 있었다. 곰보버섯(M.
후속연구
- 본 총설에서는 국립산림과학원에 보존되어 있는 다양한 외생균근균 자원의 2010~2015년 최근까지 수행한 기초적인 배양특성을 조사한 결과를 소개하고자 한다. 아울러 여기에 소개된 내용들은 다른 연구자들이 균근성 버섯을 연구하고자 할 때 기본 정보로 활용하기를 기대한다.
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