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문제 정의
- coagulans의 산업적 활용에 앞서 기능연구를 통한 우수 균주의 선발이 필요하지만, 국내에서는 연구대상 균주가 충분히 확보되지 않은 상태에 있다. 본 연구자들은 국내 B. coagulans 균주 자원의 확보를 위한 균주 분리 과정에서 개발한 빠른 분리법을 보고한다.
제안 방법
- 50°C 집적배양의 결과, B. coagulans와 함께 Bacillus 및 Enterococcus 속 균주가 검출됨에 따라, 유산 생성 유무에 따른 Bacillus 속의 제거와 E. faecalis 검출배지 Streptococcus faecalis(SF) agar(MBcell, Korea)를 사용한 Enterococcus 속 균주의 제거를 시도하였다[7].
- Bacillus 속 bacteria에는 16S rRNA 유전자 염기서열 상동성이 99% 이상인 계통발생학적 근연종이 존재하는 경우가 있어, 동정의 신뢰성 확보를 위하여 근연종과의 16S rRNA 유전자 상동성을 분석하였다. B.
- 본 연구에서는 55°C 집적배양을 통하여 104 CFU/ml 정도의 균수 확보가 가능한 것으로 나타났지만, 가능한 충분한 균수의 확보를 위하여 50°C에서 3일간 집적배양한 배양액을 십진희석하여 PCA에 도말하고, 50°C에서 72시간 배양하였다. PCA에서 생장한 콜로니의 다양성을 고려하여 각 시료당 30 균주를 순수분리하여 보존하였고, 각 시료로부터 순수분리한 균주들 중, 3 균주씩을 16S rRNA 유전자 염기서열 분석에 의해 계통발생학적으로 동정하였다. 분리된 균주의 16S rRNA 유전자 증폭은 colony PCR을 이용하여 수행하였고 primer는 eubacterial universal primer 27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 1492R(5'-GGT TAC CTT GTT AGG ACT T-3')을 사용하였다[8].
- PCR은 T professional TRIO thermocycler(Biometra, Germany)를 사용하였고, 50 µl 반응계에는 소량의 colony, 100 mM dNTP, 1 U Taq polymerase(Inclone biotech, Korea), 20 pmol의 primer를 첨가하였다.
- 증폭된 PCR 산물은 PCR product purification kit(RBC Biosciece, Taiwan)을 사용하여 정제한 후, 수탁업체(Genotech, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 결정하였고, 염기서열 결정을 위한 primer는 16S rRNA 유전자 증폭에 사용하였던 27F와 1492R을 사용하였다. 결정된 염기서열은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 염기서열 정보를 대상으로 nucleotide BLAST를 통해 상동성을 분석하였고, 결정된 16S rRNA 유전자 염기서열과 가장 높은 상동성을 나타내는 표준균주(type strain)를 포함하는 분류학적 단위를 해당 균주의 종(species)으로 결정하였다. 4개 시료로부터 순수분리한 총 12 균주의 동정 결과, B.
- 생균수 측정에는 plate count agar(PCA; Difco)를 사용하였고, 37°C에서 배양하였다. 다양한 환경에서 높은 생장을 보이는 Bacillus 속 bacteria의 생장을 최소화 하기 위하여 집적배양 단계에서는 유산균의 배양에 주로 사용하는 MRS broth를 사용하였고, 가능한 많은 종류의 bacteria의 검출을 위하여 생균수 측정 단계에서는 일반세균 검출에 사용하는 PCA를 사용하였다. 50°C 배양에서는 24시간 후에 평균 106 CFU/ml 수준의 생균수가 검출되었고, 3일 후에는 모든 시료의 생균수가 평균 104 CFU/ml 수준으로 감소하였다.
- 본 연구에서는 55°C 집적배양을 통하여 104 CFU/ml 정도의 균수 확보가 가능한 것으로 나타났지만, 가능한 충분한 균수의 확보를 위하여 50°C에서 3일간 집적배양한 배양액을 십진희석하여 PCA에 도말하고, 50°C에서 72시간 배양하였다.
- 분리된 균주의 16S rRNA 유전자 증폭은 colony PCR을 이용하여 수행하였고 primer는 eubacterial universal primer 27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 1492R(5'-GGT TAC CTT GTT AGG ACT T-3')을 사용하였다[8].
- 약 2 cm 크기로 자른 볏짚 10 g을 항진균제 cycloheximide(Sigma, USA)를 100 mg/l의 농도로 첨가한 멸균 MRS broth (Difco, USA) 100 ml에 접종한 다음, B. coagulans의 최적 및 한계 생육온도로 알려진 50°C 및 55°C에서 3일간 배양하면서 24시간 단위로 생균수를 측정하였다(Fig. 1)[9].
- 유산 생성 균주들 중, SF agar를 이용한 37°C, 24시간 배양에서 생장하는 균주를 Enterococcus 속으로 간주하였다.
- PCR은 95°C에서 5분간 예비가열 후, 94°C에서 1분간 변성, 52°C에서 45초간 annealing, 72°C에서 1분간 중합반응의 과정을 30회 반복하였다. 증폭된 PCR 산물은 PCR product purification kit(RBC Biosciece, Taiwan)을 사용하여 정제한 후, 수탁업체(Genotech, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 결정하였고, 염기서열 결정을 위한 primer는 16S rRNA 유전자 증폭에 사용하였던 27F와 1492R을 사용하였다. 결정된 염기서열은 NCBI(http://www.
대상 데이터
- coagulans는 육탄당뿐만 아니라 xylose와 같은 오탄당을 탄소원으로 이용하는 능력을 가지고 있어 lignocellulose를 함유하고 있는 식물성 소재로부터 L형-유산을 생산하기 위하여 많이 분리되었으며[14, 15], 쌀겨의 우점종으로 분리된 바 있다[10]. 본 연구에서는 우리나라 도처에서 쉽게 구할 수 있으며, 높은 확률의 B. coagulans 분리가 예상되는 볏짚을 분리원으로 선택하였고, 볏짚은 경기도 일대의 안성, 여주, 의정부, 포천의 농가에서 수집하였다. 약 2 cm 크기로 자른 볏짚 10 g을 항진균제 cycloheximide(Sigma, USA)를 100 mg/l의 농도로 첨가한 멸균 MRS broth (Difco, USA) 100 ml에 접종한 다음, B.
- 유산 생성의 확인에는 0.7% CaCO3(w/v)가 첨가된 MRS agar(Difco)를 이용하였고, 37°C에서 24시간 배양하여 불용성의 상태로 존재하던 배지 중의 CaCO3가 생성된 유산에 의해 투명환(clear zone)을 생성하는 콜로니를 선발하였다[8].
성능/효과
- 첨가배지에서 배양한 결과, 각 시료에서 분리된 균주들의 60%에서 83%가 투명환을 형성하여 유산을 생성하는 것으로 나타났다(Table 1). 2차 선발에서 확보된 균주들을 SF agar에서 배양한 결과, 1차 선발에서 분리된 균주들의 20%에서 50%가 선발되었다. 각 시료로부터 최종적으로 선발된 42 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통한 동정 결과, 모두 B.
- gov/)에 등록된 염기서열 정보를 대상으로 nucleotide BLAST를 통해 상동성을 분석하였고, 결정된 16S rRNA 유전자 염기서열과 가장 높은 상동성을 나타내는 표준균주(type strain)를 포함하는 분류학적 단위를 해당 균주의 종(species)으로 결정하였다. 4개 시료로부터 순수분리한 총 12 균주의 동정 결과, B. coagulans는 5 균주가 분리되었고, Enterococcus faecalis 2 균주, Enterococcus faecium 2 균주, B. licheniformis, Bacillus thuringiensis, B. subtilis가 각각 1 균주씩 분리되었다.
- 50°C 배양에서는 24시간 후에 평균 106 CFU/ml 수준의 생균수가 검출되었고, 3일 후에는 모든 시료의 생균수가 평균 104 CFU/ml 수준으로 감소하였다.
- 50°C에서 3일간의 집적배양을 통해 각 시료로부터 순수분리한 총 120 균주를 유산 생성을 확인할 수 있는 CaCO3 첨가배지에서 배양한 결과, 각 시료에서 분리된 균주들의 60%에서 83%가 투명환을 형성하여 유산을 생성하는 것으로 나타났다(Table 1).
- Bacillus 속 bacteria에는 16S rRNA 유전자 염기서열 상동성이 99% 이상인 계통발생학적 근연종이 존재하는 경우가 있어, 동정의 신뢰성 확보를 위하여 근연종과의 16S rRNA 유전자 상동성을 분석하였다. B. coagulans C4는 근연종 Bacillus smithii PR3와 95%, Bacillus jeotgali BVC61와 94% 수준의 상동성을 나타내었고, 발효식품에서 자주 검출되는 다른 Bacillus 속 bacteria와도 93% 수준의 상동성을 나타내었다. B.
- B. coagulans 균주 및 근연종의 16S rRNA 유전자를 ClustalW multiple sequence alignment program을 이용하여 나열한 결과, B. coagulans C4의 염기서열 기준으로 59−89 bp 구간 및 180−214 bp 구간에서 확연히 구분되는 두 곳의 변이영역(variable region)의 존재가 확인되었다(Fig. 2).
- 2차 선발에서 확보된 균주들을 SF agar에서 배양한 결과, 1차 선발에서 분리된 균주들의 20%에서 50%가 선발되었다. 각 시료로부터 최종적으로 선발된 42 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통한 동정 결과, 모두 B. coagulans로 확인되었다. 따라서 본 연구에서 수행한 50°C에서의 집적배양, CaCO3 첨가배지를 이용한 Bacillus 속 균주의 제거, SF agar를 이용한 Enterococcus 속 균주의 제거는 B.
- 2). 따라서 16S rRNA 염기서열 분석은 B. coagulans의 근연종과의 구분에 충분한 효용성이 있는 것으로 확인되었다.
- 따라서 본 연구에서 수행한 50°C에서의 집적배양, CaCO3 첨가배지를 이용한 Bacillus 속 균주의 제거, SF agar를 이용한 Enterococcus 속 균주의 제거는 B. coagulans 선발을 위한 빠르고 정확한 방법이 될 수 있는 것으로 확인되었다.
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