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문제 정의
- 따라서 본 연구는 한국재래계와 백색레그혼에 대하여 표준 및 고밀도 사양을 실시하고, 고밀도 사양스트레스가 닭의 품종 간 체내대사 연관 유전자들의 발현에 미치는 영향을 비교분석하고자 실시하였다.
- 본 연구는 밀사에 의한 환경스트레스가 닭의 품종에 따라 스트레스 및 대사 연관 유전자들의 발현에 어떤 영향을 미치는지 알아보고자 실시하였다. 공시계는 한국재래닭과 백색레그혼으로 두 품종 모두 40주령 때 대조구(540 cm2/수) 및 고밀도구(311 cm2/수)로 분리하고, 50주령까지 10주간 사육 하였다.
제안 방법
- PCR 반응물은 cDNA(10 ng) 5 µL, primer(5 pmole)는 각각 0.5 µL, SYBR Green(Bio-Rad) 10 µL, ddH2O 4 µL를 넣어 총 20 µL가 되도록 혼합하고, 95℃에서 3분간 최초 변성을 시킨 다음 95℃ 15초간 변성, 60℃에서 15초간 접합, 72℃ 40초간 확장과정을 40회 반복하였다.
- 본 연구는 밀사에 의한 환경스트레스가 닭의 품종에 따라 스트레스 및 대사 연관 유전자들의 발현에 어떤 영향을 미치는지 알아보고자 실시하였다. 공시계는 한국재래닭과 백색레그혼으로 두 품종 모두 40주령 때 대조구(540 cm2/수) 및 고밀도구(311 cm2/수)로 분리하고, 50주령까지 10주간 사육 하였다. 사양시험 종료 후, 각 개체의 간으로부터 total RNA 를 추출하고, 스트레스, 소포체(ER) 스트레스 및 대사 연관 유전자들의 발현을 real-time PCR을 이용하여 분석하였다.
- 공시동물은 경남과학기술대학교 종합농장에서 부화하여 사육 중인 백색레그혼종 순계(White Leghorn, WL) 82수 및 한국재래닭(Korean Native Chicken, KNC) 적갈색종 82수를 이용하였다. 공시계들은 두 품종 모두 40주령 때 대조구(540 cm2/수) 및 고밀도구(311 cm2/수)로 분리하고, 50주령까지 10주간 사육하였다. 공시계의 사양관리는 강제 환기 및 자동 온도 조절 시스템이 완비된 무창 계사 내 2단 4열 케이지 형태로, 칸당 90 cm(W) × 90 cm(L) × 66 cm(H)의 철망 배터리형 케이지에서 사육하였고, 사료 급이는 자유채식시켰으며, 점등 관리는 16시간 고정 점등하였다.
- 공시계의 사양관리는 강제 환기 및 자동 온도 조절 시스템이 완비된 무창 계사 내 2단 4열 케이지 형태로, 칸당 90 cm(W) × 90 cm(L) × 66 cm(H)의 철망 배터리형 케이지에서 사육하였고, 사료 급이는 자유채식시켰으며, 점등 관리는 16시간 고정 점등하였다.
- 공시계는 한국재래닭과 백색레그혼으로 두 품종 모두 40주령 때 대조구(540 cm2/수) 및 고밀도구(311 cm2/수)로 분리하고, 50주령까지 10주간 사육 하였다. 사양시험 종료 후, 각 개체의 간으로부터 total RNA 를 추출하고, 스트레스, 소포체(ER) 스트레스 및 대사 연관 유전자들의 발현을 real-time PCR을 이용하여 분석하였다. 한국재래계는 분석된 모든 스트레스 표지 유전자들의 발현이 밀사구와 대조구 사이에 유의적인 변화를 보이지 않았다.
- 시험종료(50주령) 후 시험구별 무작위로 10수씩 추출하여 각 개체로부터 간 조직을 취하여 액체질소에 급속냉동을 실시하였고, total RNA를 추출하기 전까지 —80℃에 보관하였다.
- 유전자 발현 분석을 위하여 간 조직은 Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 제조사의 이용안내에 따라 total RNA를 추출하였다. 분리한 RNA는 1 µg/µL의 농도로 정량하고, Improm-II Reverse transcription system(Promega, Fitchburg, USA)을 이용하여 cDNA를 합성하였다.
- 한국재래계와 백색레그혼 종을 대상으로 40주령부터 10주간 대조구와 밀사 스트레스구로 구분하여 사양시험을 실시하고, 이들 개체들이 받은 스트레스의 정도는 간 조직으로부터 hydroxyl-3-methyl-glutaryl coenzyme A reductase(HMGCR), heat shock protein(HSP)70, HSP90-α 및 HSP90-β 유전자의 mRNA 발현을 분석 비교하여 Table 2에 제시하였다.
대상 데이터
- (2014)이 제시한 내용과 같으며, 간단히 기술하면 다음과 같다. 공시동물은 경남과학기술대학교 종합농장에서 부화하여 사육 중인 백색레그혼종 순계(White Leghorn, WL) 82수 및 한국재래닭(Korean Native Chicken, KNC) 적갈색종 82수를 이용하였다. 공시계들은 두 품종 모두 40주령 때 대조구(540 cm2/수) 및 고밀도구(311 cm2/수)로 분리하고, 50주령까지 10주간 사육하였다.
데이터처리
- 시험구의 유전자 발현에 대한 통계 분석은 2 × 2 요인시험 설계에 따라 SAS 통계패키지(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)의 GLM procedure를 이용하여 품종 간, 사육밀도 간 및 품종 × 사육밀도에 대한 유의성을 검정하고, 요인별 차이를 분석하였다.
이론/모형
- 유전자 발현의 상대적 발현은 2—△△Ct 방법을 이용하여 분석하였다(Livak and Schmittgen, 2001).
성능/효과
- GLUT의 발현은 품종 간에는 영향을 받지 않지만, 밀사에 의한 영향을 받고 있음을 보여주었다. 고밀도사양 체계는 닭의 품종과 관계없이 스트레스 요인이 될 수 있으며, 닭의 품종이나 개량의 정도에 따라 스트레스 반응에 대한 유전적 차이가 있음을 시사하고, 또한 밀사와 같은 환경적 스트레스는 간의 지방 및 포도당 대사에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었다.
- , 2006)가 닭과 같은 조류에서는 고밀도 사양스트레스에서는 큰 영향을 미치지 않음을 알 수 있다. 다만 본 연구에서는 분석된 모든 지표 유전자들에서 밀사와 품종 간에 유의적 상관관계는 존재함을 보여 주었다.
- 밀사에 의한 ER 스트레스의 연관 유전자들의 발현에 큰 차이가 없었으나, 고밀도 사양에 의해 SREBP2은 높은 발현을 보였다(P<0.05).
- 본 실험에서는 한국재래계 또한 고밀도 사양에 대한 스트레스로 HMGCR을 제외한 HSP 유전자들의 발현이 높아진 경향을 나타냈지만, 통계적 유의성을 보이지 못하였다. 밀사의 형태가 아닌 열 스트레스에 대한 HSP 유전자의 발현을 적색야계, 토종계 및 실용육계에서 관찰한 결과를 보면, 적색야계는 열 스트레스를 받기 전 즉 기초수준(basal level)의 HSP 유전자의 발현 정도가 토종계와 실용육계에 비하여 높은 수준을 유지하였으며, 또한 열처리에 대하여 적색야계는 HSP의 발현에 큰 변화를 보이지 않았다고 한다. 그러나 실용육계의 경우, 열 스트레스 처리 전에는 낮은 HSP의 발현을 보였으나, 열처리 후 스트레스에 민감하게 반응하여 높은 HSP의 발현을 나타냈다고 한다(Soleimani et al.
- , 2012). 본 연구에서는 이들 유전자들 중 XBP1만 백색레그혼 고밀도 사양체계에서 유전자의 발현이 2배 증가함을 볼 수 있었고, 품종과 관계없이 대조구와 밀사구를 비교하였을 경우에는 SREBP2를 제외하고, ER-stress유전자들의 발현 증가를 관찰할 수 없었다. 일반적으로 포유동물에서 식이성 포화지방산이나 콜레스테롤 등에 의해 유도되는 ER stress(Borradaile et al.
- 이는 야생 혹은 개량이 적게 된 닭이 개량이 많이 진행된 닭(실용육계)에 비하여 열에 대한 스트레스 저항성이 높음을 의미하고, 포식자들로부터 도망을 하거나, 먹이사냥을 위해 일정수준 스트레스 상태를 유지하고 있는 것으로 유추하였다. 본 연구에서도 한국재래계가 백색레그혼에 비하여 표준밀도 사양에서는 HSP 유전자들의 발현이 높은 현상을 나타내었다. 야계와 토종닭 그리고 실용육계에 대한 열 스트레스에 대한 많은 연구들에서도 야계 및 토종닭의 높은 열 적응력을 보고하였다(Deeb and Cahaner, 1999; Zulkifli et al.
- , 2008). 본 연구에서의 결과를 종합하여 보면 고밀도사양 체계는 닭에게 스트레스 요인이 될 수 있으며, 닭의 품종이나 개량의 정도에 따라 스트레스 반응에 대한 유전적 차이가 있음을 시사한다.
- 분석된 ATF6, GRP78, SREBP2 등의 발현은 품종 간 차이를 볼 수 없었지만, XBP1의 경우 백색레그혼이 한국재래계에 비하여 높은 발현을 보였다(P<0.05).
- 분석된 activating transcription factor(ATF)6, glucose-regulated protein(GRP)78, sterol regulatory element-binding transcription factor(SREBP)2등의 발현은 품종 간 차이를 볼 수 없었지만, X-box binding protein(XBP)1의 경우 한국재래계가 백색레그혼에 비하여 낮은 발현을 보였다(P<0.05).
- 분석된 유전자들 중 FABP4, FATP1, ACSL1 등의 경우, 한국재래계에 비하여 백색레그혼에서 높은 유전자 발현을 보였다(P<0.05).
- 분석된 유전자들 중 fatty acid-binding protein 4(FABP4), fatty acid transport protein 1(FATP1), Acyl-CoA synthetase long-chain family member 1(ACSL1)의 경우, 백색레그혼에 비하여 한국재래계에서 낮은 유전자 발현을 보였으며(P<0.05), fatty acid synthase(FASN)은 한국재래계가 오히려 높은 발현을 나타내었다(P<0.05).
- 따라서 ACSL1 mRNA는 지방합성과 지방산화를 유도하는 조건에서 모두 증가하게 된다. 환경스트레스에 의한 외적 인자는 앞에서 언급한 바와같이 세포내 스트레스 지표 유전자들의 발현에 영향을 주게 되고, 이는 지방대사 관련 유전자들(FABP, FATP, ASCL1)의 발현에도 영향을 미치는 것으로 나타났다. 그러나 지방합성 효소인 FASN의 발현은 한국재래계에서 오히려 높게 나타난 것은 백색레그혼의 경우 산란계로 개량된 대표 품종인 반면, 한국재래계는 계란과 고기를 같이 생산하는 겸용종임을 감안해야 할 것으로 사료된다.
후속연구
- 환경스트레스에 의한 외적 인자는 앞에서 언급한 바와같이 세포내 스트레스 지표 유전자들의 발현에 영향을 주게 되고, 이는 지방대사 관련 유전자들(FABP, FATP, ASCL1)의 발현에도 영향을 미치는 것으로 나타났다. 그러나 지방합성 효소인 FASN의 발현은 한국재래계에서 오히려 높게 나타난 것은 백색레그혼의 경우 산란계로 개량된 대표 품종인 반면, 한국재래계는 계란과 고기를 같이 생산하는 겸용종임을 감안해야 할 것으로 사료된다. 사람과 쥐에서는 FATP1에 대한 연구가 비교적 많이 되었지만, 가금에서는 FATP1에 대한보고는 거의 없는 실정이다.
- , 1986). 그러나 환경적 스트레스와 포도당 대사 관련 유전자들의 발현에 대한 연구는 초보적인 수준이며, 이에 대한 체계적인 연구가 필요하다고 사료된다.
- 스트레스와 연관된 닭의 내인성 체지방의 대사연관 유전자 발현의 변화는 간 조직에서 정상적 지방대사에 매우 중요함을 시사한다. 따라서 조류에서 스트레스와 지방대사 연관 유전자들의 발현 및 조절에 대한 체계적인 연구가 있어야 할 것으로 사료된다.
- 반면, 혈중 인슐린 수준은 더 낮아 쥐와 비교하여 약 1/10 수준에 불과하며, 인슐린에 의한 혈중 포도당의 농도 조절이 미약한 것으로 알려져 있다(Dupont et al, 2004). 백색레그혼에 비하여 한국재래계에서 GLUT8의 높은 발현과 고밀도 사양에서 GLUT2의 발현 증가는 간세포에서 포도당 흡수의 증가 및 글라이코겐 합성과 연관이 있을 것으로 사료되어, 이에 대한 추가적인 연구가 필요한 것으로 보인다. 조류의 소화 장기에서 포도당의 흡수는 sodium-glucose co-transporters(SGLTs; apical side of cells)와 glucose transport proteins(GLUTs; basolateral side of cells)에 의해 이루어진다.
- , 2012). 본 실험에서는 한국재래계 또한 고밀도 사양에 대한 스트레스로 HMGCR을 제외한 HSP 유전자들의 발현이 높아진 경향을 나타냈지만, 통계적 유의성을 보이지 못하였다. 밀사의 형태가 아닌 열 스트레스에 대한 HSP 유전자의 발현을 적색야계, 토종계 및 실용육계에서 관찰한 결과를 보면, 적색야계는 열 스트레스를 받기 전 즉 기초수준(basal level)의 HSP 유전자의 발현 정도가 토종계와 실용육계에 비하여 높은 수준을 유지하였으며, 또한 열처리에 대하여 적색야계는 HSP의 발현에 큰 변화를 보이지 않았다고 한다.
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