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문제 정의
- 그러나 운동과 갈근 및 지황이 신체 전반에 미치는 긍정적인 생리적 효과에 관한 연구 결과들이 보고되고 있음에도 불구하고 작용 기전에 관한 연구가 미흡하고, 후성 유전적 연구는 더욱 전무한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 난소 제거 수술을 시행하여 폐경기가 유도된 쥐에게 고지방 식이를 섭취 시키면서, 갈근/지황 섭취와 운동이 신체 조성 변화에 영향을 미치는지 관찰하고, 이러한 변화가 과연 후성 유전적 기전을 통한 효과인지에 대해 알아보고자 하였다. 그 결과 첫째, 8주간의 운동을 한 그룹은 대조군에 비해 체중이 유의하게 감소하였다.
- 따라서 본 연구에서는 난소적출수술을 시행하여 폐경기가 유도 된 흰 쥐에게 나타나는 갈근/지황 추출물 섭취와 운동의 신체적 개선 효과를 골격근에서 나타나는 후성 유전적 변화를 관찰함으로써 알아보고자 한다.
제안 방법
- 8주간의 트레드밀 운동과 갈근/지황 복합물 섭취에 따른 근육량을 가자미근(soleus)과 족저근(plantaris)을 적출하여 각각의 체중에 대한 근질량의 비를 산출하였다(Table 2). 그 결과, 가자미근에서 갈근/지황, estradiol과 물 섭취 효과에 따른 유의한 차이가 있었고(p=0.
- HDAC4, HDAC5와 G9a의 mRNA 발현을 측정하기 위하여 2X SYBR Green qPCR master mix (Kapa Biosystems, USA)를이용하여 quantitative RT-PCR (ABI prism 7700 system) 분석을 실시하였다. 측정값의 신뢰를 위해 모든 샘플을 2회 반복 측정한 뒤, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 의 발현양으로 목표 유전자의 mRNA 발현양을 보정하였다.
- 원심분리된 상층액을 버리고 추출된 RNA pellet을 DEPC water에 녹인 뒤 65℃에서 15분간 heat-inactivation 하고, ice에 10분간 처리하였다. Nanophotometer를 이용하여 RNA 농도를 측정 하였고, 측정된 농도를 정량하여 1 μg/μl의 RNA를 cDNA master mix (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)와 혼합하여 25℃ 10분, 42℃ 60분, 99℃ 5분의 조건으로 polymerase chain reaction (PCR)을 실행하여 cDNA를 합성하였다.
- 가자미근에서 8주간의 운동과 갈근/지황 섭취에 의한 H3K9 아세틸화와 메틸화 변화를 관찰하기 위해 면역조직화학염색법을 실시하여 현미경으로 관찰하였다. 운동을 하지 않고, 물을 섭취한 HSV 그룹에서 타그룹과 비교하였을 때 H3K9 의 아세틸화(붉은색)가 억제 된 것으로 관찰 되었다.
- 이후 H3K9 acetylation polyclonal rabbit antibody, H3K9 di-meth- ylation polyclonal rabbit antibody (Cell Signaling Technol- ogy, USA)를 5% BSA에 1:500으로 희석 한 뒤 4℃에서 12시간 처리하였다. 그 후, alexa 488, 568-conjugated goat anti-rabbit IgG secondary antibody (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)를 5% BSA에 1:250으로 희석하여 상온에서 60 분간 반응시킨 후 4’, 6-diamidino-2phenylinodole (DAPI)로 20분간 핵 염색을 실행 하였다. 사진은 digital imaging system 이 갖춰진 Axiovert 200 fluorescence microscope (Carl Zeiss, Germany)로 촬영하였다.
- 난소 적출 수술을 실시한 뒤 일주일의 회복기간을 거친 후, 본 운동의 하루 전에 속도 8 m/min, 경사 0°의 조건으로 15분간 트레드밀 운동에 대한 적응 훈련을 실시하였다. 적응 훈련 후, 본 운동은 매일 오전 10시부터 경사 0°의 조건에서 하루 1회, 주 5일 빈도로 8주간 실시하였다.
- 고지방 식이를 하였다. 이 쥐들을 운동 그룹(exercise)과 비운동 그룹(sedentary)으로 나누고 각각 estradiol 섭취 그룹, 갈근과 지황의 3:1 복합물(HT051) 섭취 그룹, 물 섭취 그룹으로 나누어 개별 사육하였다. 사육 온도는 23.
- 포매 후 박절기(cutting machine)에서 5 μm 두께로 박절한 조직 절편을 슬라이드에 올려 37℃의 열판에서 건조시켰다. 이후 탈 파라핀(deparaffinization), 함수(hydration)를 거친 후 0.02 %의 tritonX-100을 함유한 PBST로 15분간 permiabilization 과정을 거친 뒤, 5% BSA로 30분 동안 blocking 하였다. 이후 H3K9 acetylation polyclonal rabbit antibody, H3K9 di-meth- ylation polyclonal rabbit antibody (Cell Signaling Technol- ogy, USA)를 5% BSA에 1:500으로 희석 한 뒤 4℃에서 12시간 처리하였다.
- 트레드밀 운동에 대한 적응 훈련을 실시하였다. 적응 훈련 후, 본 운동은 매일 오전 10시부터 경사 0°의 조건에서 하루 1회, 주 5일 빈도로 8주간 실시하였다. 처음 1-4주는 15 m/min 30분, 5-8주는 18 m/min 속도로 40분간 실시하였다.
- 실시하였다. 측정값의 신뢰를 위해 모든 샘플을 2회 반복 측정한 뒤, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 의 발현양으로 목표 유전자의 mRNA 발현양을 보정하였다. 사용된 primer들은 모두 Macrogen (Macrogen, KOREA) 에서제작하였으며, 각 유전자의 primer sequence는 Table 1에 제시하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 쥐(rat)는 8주령(8-week old, 몸무게 200-210 g)의 SD 암컷 쥐로(n=60), 난소 제거 수술을 실시한 뒤 고지방 식이를 하였다. 이 쥐들을 운동 그룹(exercise)과 비운동 그룹(sedentary)으로 나누고 각각 estradiol 섭취 그룹, 갈근과 지황의 3:1 복합물(HT051) 섭취 그룹, 물 섭취 그룹으로 나누어 개별 사육하였다.
- 그 후, alexa 488, 568-conjugated goat anti-rabbit IgG secondary antibody (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)를 5% BSA에 1:250으로 희석하여 상온에서 60 분간 반응시킨 후 4’, 6-diamidino-2phenylinodole (DAPI)로 20분간 핵 염색을 실행 하였다. 사진은 digital imaging system 이 갖춰진 Axiovert 200 fluorescence microscope (Carl Zeiss, Germany)로 촬영하였다.
데이터처리
- 가자미근에서 HDAC4의 mRNA 발현양을 관찰하기 위하여 Real-time PCR을 통한 그룹별 데이터 값에 대해 이원분산분석(Two-way ANOVA)을 실시하였다. 그 결과 8주 동안의 갈근/지황, estradiol과 물의 섭취와 운동 모두 유의한 효과가 나타나지 않았고(p>0.
- 본 연구에서는 8주의 처치 후 각 집단의 체중에 대한 근질량의 비와 Real-time PCR을 통한 HDAC4, HDAC5, G9a의 집단별 mRNA 데이터 값에 대해 각각의 이원분산분석(Two-Way ANOVA)을 실시하여, 갈근/지황 복합물의 섭취와 운동이 미치는 효과의 통계적 유의성과 상호작용 효과를 유의 수준 0.05 를 기준으로 검증하였다. 집단 간 사후 검증은 Tukey 방법을 사용하였다.
이론/모형
- 05 를 기준으로 검증하였다. 집단 간 사후 검증은 Tukey 방법을 사용하였다.
성능/효과
- 가자미근에서 8주간의 갈근/지황, estradiol과 물의 섭취와 운동 모두 HDAC5 mRNA 발현양에 유의한 효과를 미치지않았고(p>0.05), 운동과 갈근/지황 섭취의 상호작용 효과도 나타나지 않았다(p=0.623) (Fig. 5B).
- 증가하였다. 갈근/지황을 섭취한 그룹도 대조군에 비해 가자미근과 족저근의 질량이 모두 유의하게 증가 하였고, estradiol 섭취 그룹과 유사한 효과를 나타내었다. 운동과 갈근/지황 섭취의 상호작용 효과는 나타나지 않았지만, 두 요인 모두 가자미근과 족저근 질량의 증가 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.
- 그 결과 첫째, 8주간의 운동을 한 그룹은 대조군에 비해 체중이 유의하게 감소하였다. 갈근/지황을 섭취한 그룹도 체중이 유의하게 감소하였고, estradiol 섭취 그룹과 유사한 효과를 나타내었다. 운동과 갈근/지황 섭취의 상호작용 효과는 나타나지 않았지만, 두 요인 모두 체중 감소 효과를 나타내었다.
- ANOVA)을 실시하였다. 그 결과 8주 동안의 갈근/지황, estradiol과 물의 섭취와 운동 모두 유의한 효과가 나타나지 않았고(p>0.05), 운동과 갈근/지황 섭취의 상호작용 효과도 나타나지 않았다(p=0.984) (Fig. 5A).
- 따라서 본 연구에서는 난소 제거 수술을 시행하여 폐경기가 유도된 쥐에게 고지방 식이를 섭취 시키면서, 갈근/지황 섭취와 운동이 신체 조성 변화에 영향을 미치는지 관찰하고, 이러한 변화가 과연 후성 유전적 기전을 통한 효과인지에 대해 알아보고자 하였다. 그 결과 첫째, 8주간의 운동을 한 그룹은 대조군에 비해 체중이 유의하게 감소하였다. 갈근/지황을 섭취한 그룹도 체중이 유의하게 감소하였고, estradiol 섭취 그룹과 유사한 효과를 나타내었다.
- 그 결과, 가자미근에서 갈근/지황, estradiol과 물 섭취 효과에 따른 유의한 차이가 있었고(p=0.000), 운동의 효과 또한 유의하게 나타났다(p=0.005). 하지만 이 두 요인의 상호작용 효과는 나타나지 않았다(p=0.
- 넷째, 근육에서 히스톤 H3K9 탈아세틸화 조절 효소인 HDAC4와 HDAC5, 메틸화 조절 효소인 G9a mRNA의 발현양을 비교한 결과 가자미근에서 HDAC4, HDAC5, G9a 모두 유의한 차이가 나타나지 않았고, 족저근에서는 운동 그룹의 HDAC5와 G9a mRNA 발현양이 운동하지 않은 그룹보다 유의하게 감소하였다. 이는 신체활동 부족으로 인한 근육에서의 HDAC family 활성과 HDAC5의 증가로 인해 GLUT4 유전자의 히스톤에서 탈아세틸화가 일어난다는 선행연구와 유사한 결과로[20], 본 연구에서 제시한 운동에 의한 HDAC5 mRNA 발현의 감소는 폐경기 대사 기능을 개선시키는 기전에 있어 운동이 중요한 요소임을 뒷받침해주는 결과라 할 수 있겠다.
- 둘째, 대표적인 지근(slow-twitch muscle)과 속근(fast- twitch muscle)인 가자미근과 족저근의 상대적 질량을 각각 비교한 결과, 8 주간 운동 실시 그룹의 가자미근과 족저근 질량 모두 운동을 하지 않은 그룹에 비해 유의하게 증가하였다. 갈근/지황을 섭취한 그룹도 대조군에 비해 가자미근과 족저근의 질량이 모두 유의하게 증가 하였고, estradiol 섭취 그룹과 유사한 효과를 나타내었다.
- 나아가 HDAC4와 HDAC5는 골격근 분화 및 형성에 중요한 역할을 하는 MEF2 (myocyte enhancer factor2)의 활동을 억제함으로써 근육 분화 유전자를 차단하며, 골격근에서 증가된 HDAC5는 운동 후 나타나는 지근 섬유의 증가를 약화시킨다는 보고가 있었는데[21, 24], 본 연구에서도 운동이 HDAC mRNA 발현을 감소시킴으로써 근질량을 증가시켰을 것이라생각된다. 또한, H3K9 메틸 전이효소인 G9a mRNA 역시 운동그룹의 족저근에서 유의하게 감소 하였음을 알 수 있었다. 이는 G9a가 분화되지 않은 C2C12 근원세포에서 높게 발현되고, 분화하는 동안 감소하였음을 제시하며 G9a가 골격근 분화과정을 조절한다고 보고한 Ling (2012)의 연구결과를 뒷받침하는 결과로, 운동에 의한 G9a mRNA의 발현 감소가 근질량증가에 영향을 미쳤을 것이라 생각된다.
- 향후 대사 및 근육 특이적으로 조절되는 유전자들의 발현 기전을 후성 유전적 관점으로 규명해야 할 것이다. 마지막으로, 본 연구에서 운동에 의한 후성 유전적 변화를 관찰할 수 있었던 반면, 갈근과 지황 섭취가 체중 증가를 억제하고, 근질량은 증가시켰지만 후성 유전적 접근으로는 변화를 관찰할 수 없었다. 이것은 히스톤의 변형이 아닌 다른 후성 유전적 기전의 경로를 통하여 변화가 유도 된 것으로 생각되며, 이에 대해 차후의 연구가 더 필요할 것으로 사료된다.
- 000). 사후 검증 결과 갈근/지황 섭취 그룹과 estradiol 섭취 그룹은 유의한 차이가 없었지만 (p=0.894), 이 두 그룹과 물 섭취 그룹 간에는 각각 유의한 차이가 있었다(p=0.000). 8주간 운동을 한 그룹과 하지 않은 그룹 간에도 유의한 차이를 보였다(p=0.
- 860). 사후검정 결과, 갈근/지황 섭취 그룹과 estradiol 섭취 그룹 모두 물 섭취 그룹과의 유의한 차이가 있었고(p=0.000), 갈근/지황 섭취 그룹과 estradiol 섭취 그룹 간에는 유의한 차이가 없었다(p=0.851). 족저근에서도 갈근 /지황, estradiol과 물 섭취 효과에 따른 유의한 차이가 나타났고(p= .
- 001). 사후검증 결과 갈근/지황 섭취 그룹과 estradiol 섭취 그룹 모두 물 섭취 그룹과의 유의한 차이가 있었고(p<.05), 갈근/지황 섭취 그룹과 estradiol 섭취 그룹 간에는 유의한 차이가 없었다 (p=0.380).
- 셋째, 본 연구에서 제시한 갈근/지황의 섭취, 운동이 폐경기 쥐의 체중 감소와 근질량 증가에 기여한 기전에 있어 히스톤의 후성 유전적 변화가 영향을 미쳤음을 확인하였다. 운동이나 물질 섭취를 하지 않은 통제 그룹인 HSV의 가자미근에서 H3K9 아세틸화가 억제된 것이 관찰되었는데, 에스트로겐기능이 저하된 쥐에게 고지방 식이 섭취만을 시킨 HSV 그룹의 가자미근에서 H3K9의 탈아세틸화가 일어나 후성 적으로 유전자 발현이 억제된 것으로 보여진다.
- 변화는 Table 2와 같다. 실험 전 각 그룹의 체중에는 유의한 차이가 없었지만(p=0.709), 8주간의 트레드밀 운동과 갈근/지황 복합물 섭취 후 체중 변화는 그룹 간 유의한 차이를 나타내었다. 운동과 갈근/지황 복합물이 쥐의 체중에 미치는 효과를 검증하기 위하여 이원분산분석(Two-way ANOVA)을 실시한 결과 물 섭취와 estradiol 섭취, 갈근/지황 섭취 그룹 간에는 유의한 차이가 있었다(p=0.
- 709), 8주간의 트레드밀 운동과 갈근/지황 복합물 섭취 후 체중 변화는 그룹 간 유의한 차이를 나타내었다. 운동과 갈근/지황 복합물이 쥐의 체중에 미치는 효과를 검증하기 위하여 이원분산분석(Two-way ANOVA)을 실시한 결과 물 섭취와 estradiol 섭취, 갈근/지황 섭취 그룹 간에는 유의한 차이가 있었다(p=0.000). 사후 검증 결과 갈근/지황 섭취 그룹과 estradiol 섭취 그룹은 유의한 차이가 없었지만 (p=0.
- 갈근/지황을 섭취한 그룹도 대조군에 비해 가자미근과 족저근의 질량이 모두 유의하게 증가 하였고, estradiol 섭취 그룹과 유사한 효과를 나타내었다. 운동과 갈근/지황 섭취의 상호작용 효과는 나타나지 않았지만, 두 요인 모두 가자미근과 족저근 질량의 증가 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다. 운동을 수행하면서 일어나는 근수축 자극은 대표적인 근비대 신호전달 경로인 PI3K/AKT 경로를 통해 근단백질을 활성화하고, 반대로는 Atrogin-1/MURF-1 등과 같은 ubiquitin 합성 효소 활성의 억제를 통하여 근단백질의 손실을 막아줌으로써 근 부피 유지 및 증대에 중요한 역할을 한다고 잘 알려져 있다[3].
- 갈근/지황을 섭취한 그룹도 체중이 유의하게 감소하였고, estradiol 섭취 그룹과 유사한 효과를 나타내었다. 운동과 갈근/지황 섭취의 상호작용 효과는 나타나지 않았지만, 두 요인 모두 체중 감소 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 선행 연구들에서 제시된 운동의 효과로, 글루코스 대사 활성과 지방 산화 증가에 의한 결과로 볼 수 있다[4, 13, 14, 32].
- 실시하여 현미경으로 관찰하였다. 운동을 하지 않고, 물을 섭취한 HSV 그룹에서 타그룹과 비교하였을 때 H3K9 의 아세틸화(붉은색)가 억제 된 것으로 관찰 되었다. 그러나 H3K9 메틸화를 관찰한 결과 그룹 간 차이가 없었다(Fig.
- 운동이나 물질 섭취를 하지 않은 통제 그룹인 HSV의 가자미근에서 H3K9 아세틸화가 억제된 것이 관찰되었는데, 에스트로겐기능이 저하된 쥐에게 고지방 식이 섭취만을 시킨 HSV 그룹의 가자미근에서 H3K9의 탈아세틸화가 일어나 후성 적으로 유전자 발현이 억제된 것으로 보여진다. 그러나 H3K9 메틸화가 눈에 띄게 관찰되지 않았다는 점으로 미루어볼 때, HSV 그룹에서의 메틸화에 의한 유전자 발현 억제 효과는 없었음을 알 수 있었다.
- 족저근에서 8주간의 갈근/지황, estradiol과 물 섭취에 의한 HDAC4의 mRNA 발현양이 유의한 차이를 보였으며 (p=0.040), 사후검증 결과, estradiol 섭취 그룹과 물 섭취 그룹간의 유의한 차이만 나타났다(p=0.037). 운동의 효과는 유의하지 않았으며(p=0.
- 족저근에서 8주간의 갈근/지황, estradiol과 물의 섭취 그룹 간 HDAC5 mRNA 발현양에는 유의한 차이가 없었지만(p= 0.153), 운동에 따른 유의한 차이가 나타났다(p=0.007). 운동과 갈근/지황 섭취의 상호작용 효과는 나타나지 않았다(p=0.
후속연구
- 운동을 수행하면서 일어나는 근수축 자극은 대표적인 근비대 신호전달 경로인 PI3K/AKT 경로를 통해 근단백질을 활성화하고, 반대로는 Atrogin-1/MURF-1 등과 같은 ubiquitin 합성 효소 활성의 억제를 통하여 근단백질의 손실을 막아줌으로써 근 부피 유지 및 증대에 중요한 역할을 한다고 잘 알려져 있다[3]. 그러나 본 연구에서 투여한 갈근/지황의 근질량 증가 효과에 관한 연구는 전무했기 때문에, 에스트로겐의 결핍으로 인한 근감소증을 개선시키는데 있어 갈근/지황의 효과를 증명하였다고 할 수 있겠으나, 작용 기전에 대한 연구가 필요 할 것으로 생각된다.
- 따라서 근육 형태별 후성 유전변화의 보상 기전에 관한 연구가 필요할 것이라 생각된다. 또한 난소 제거와 고지방식이 쥐모델에 있어 운동과 갈근/지황 섭취가 대사 및 근질량 개선에 미치는 영향을 전체적(global) 인 후성 유전학적 측면에서 접근하였지만, 특정 유전자에 특이적으로 일어나는 후성 유전학적 변화 양상을 연구하지는 못하였다. 향후 대사 및 근육 특이적으로 조절되는 유전자들의 발현 기전을 후성 유전적 관점으로 규명해야 할 것이다.
- 마지막으로, 본 연구에서 운동에 의한 후성 유전적 변화를 관찰할 수 있었던 반면, 갈근과 지황 섭취가 체중 증가를 억제하고, 근질량은 증가시켰지만 후성 유전적 접근으로는 변화를 관찰할 수 없었다. 이것은 히스톤의 변형이 아닌 다른 후성 유전적 기전의 경로를 통하여 변화가 유도 된 것으로 생각되며, 이에 대해 차후의 연구가 더 필요할 것으로 사료된다.
- 종합해보면, 폐경기에 나타나는 신체적, 대사적 이상은 에스트로겐 유사 대체제와 운동으로 개선될 수 있으며, 그 기전을 후성 유전적 접근을 통해 규명 할 필요성이 있다. 따라서 본 연구에서는 난소적출수술을 시행하여 폐경기가 유도 된 흰 쥐에게 나타나는 갈근/지황 추출물 섭취와 운동의 신체적 개선 효과를 골격근에서 나타나는 후성 유전적 변화를 관찰함으로써 알아보고자 한다.
- 또한 난소 제거와 고지방식이 쥐모델에 있어 운동과 갈근/지황 섭취가 대사 및 근질량 개선에 미치는 영향을 전체적(global) 인 후성 유전학적 측면에서 접근하였지만, 특정 유전자에 특이적으로 일어나는 후성 유전학적 변화 양상을 연구하지는 못하였다. 향후 대사 및 근육 특이적으로 조절되는 유전자들의 발현 기전을 후성 유전적 관점으로 규명해야 할 것이다. 마지막으로, 본 연구에서 운동에 의한 후성 유전적 변화를 관찰할 수 있었던 반면, 갈근과 지황 섭취가 체중 증가를 억제하고, 근질량은 증가시켰지만 후성 유전적 접근으로는 변화를 관찰할 수 없었다.
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