박윤정
(Natural Medicine Research Center, KRIBB)
,
구창섭
(Organic and Natural Product Research Center, Cotde Inc., Jeju Technopark)
,
김민진
(Organic and Natural Product Research Center, Cotde Inc., Jeju Technopark)
,
이미경
(College of Pharmacy, Chungbuk National University)
,
김기옥
(Natural Medicine Research Center, KRIBB)
,
류형원
(Natural Medicine Research Center, KRIBB)
,
송혁환
(Natural Medicine Research Center, KRIBB)
,
김두영
(Natural Medicine Research Center, KRIBB)
,
오세량
(Natural Medicine Research Center, KRIBB)
지모 뿌리를 100% EtOH로 추출, 농축하여 medium pressure liquid chromatography 기반의 NO 분획물 활성 검정법을 이용하여 활성을 검정하였다. preparative high performance liquid chromatography를 반복적인 칼럼크로마토그래피를 수행하여 1개의 단일성분을 분리하였다. NMR, MS 등을 포함한 이화학 및 분광학적 자료에 근거하여 분리된 물질을 구조 분석한 결과 (-)-nyasol로 구조동정 하였다. 분리된 활성물질 nyasol은 NO 생성 억제, melanin과 tyrosinase를 억제하는 미백효과, thymus and activation-regulated chemokine 생성을 억제하는 활성에서 $6.25-12.5{\mu}g/mL$의 $IC_{50}$ 값을 가지는 강한 저해 활성을 나타냈다. 특히 nyasol은 염증에 의한 항아토피 및 항미백활성에 있어 뛰어난 효능을 나타내었다. 이 결과로 보아 nyasol은 천연 기능성 화장품으로써 이용 가능성을 넓힐 수 있을 것으로 사료된다.
지모 뿌리를 100% EtOH로 추출, 농축하여 medium pressure liquid chromatography 기반의 NO 분획물 활성 검정법을 이용하여 활성을 검정하였다. preparative high performance liquid chromatography를 반복적인 칼럼크로마토그래피를 수행하여 1개의 단일성분을 분리하였다. NMR, MS 등을 포함한 이화학 및 분광학적 자료에 근거하여 분리된 물질을 구조 분석한 결과 (-)-nyasol로 구조동정 하였다. 분리된 활성물질 nyasol은 NO 생성 억제, melanin과 tyrosinase를 억제하는 미백효과, thymus and activation-regulated chemokine 생성을 억제하는 활성에서 $6.25-12.5{\mu}g/mL$의 $IC_{50}$ 값을 가지는 강한 저해 활성을 나타냈다. 특히 nyasol은 염증에 의한 항아토피 및 항미백활성에 있어 뛰어난 효능을 나타내었다. 이 결과로 보아 nyasol은 천연 기능성 화장품으로써 이용 가능성을 넓힐 수 있을 것으로 사료된다.
The rhizomes of Anemarrhena asphodeloide was extracted with 100% ethanol and concentrated subfractions were separated with medium pressure liquid chromatography-based activity profiling. One compound was isolated from the subfraction 10 through the repeated preparative high performance liquid chroma...
The rhizomes of Anemarrhena asphodeloide was extracted with 100% ethanol and concentrated subfractions were separated with medium pressure liquid chromatography-based activity profiling. One compound was isolated from the subfraction 10 through the repeated preparative high performance liquid chromatography (prep-HPLC). According to physico-chemical and spectroscopic data including NMR and MS, the chemical structures of the compound was determined as nyasol (1). Nyasol was exhibited potent inhibitory activity for NO ($IC_{50}:12.5{\mu}g/mL$), tyrosinase ($IC_{50}:12.5{\mu}g/mL$), melanin contents ($IC_{50}:12.5{\mu}g/mL$), thymus and activation-regulated chemokine (TARC) production ($IC_{50}:6.25{\mu}g/mL$). As a result, nyasol has an excellent inflammation-dependent anti-whitening and TARC production activity. It could be used to a large range of functional cosmetics.
The rhizomes of Anemarrhena asphodeloide was extracted with 100% ethanol and concentrated subfractions were separated with medium pressure liquid chromatography-based activity profiling. One compound was isolated from the subfraction 10 through the repeated preparative high performance liquid chromatography (prep-HPLC). According to physico-chemical and spectroscopic data including NMR and MS, the chemical structures of the compound was determined as nyasol (1). Nyasol was exhibited potent inhibitory activity for NO ($IC_{50}:12.5{\mu}g/mL$), tyrosinase ($IC_{50}:12.5{\mu}g/mL$), melanin contents ($IC_{50}:12.5{\mu}g/mL$), thymus and activation-regulated chemokine (TARC) production ($IC_{50}:6.25{\mu}g/mL$). As a result, nyasol has an excellent inflammation-dependent anti-whitening and TARC production activity. It could be used to a large range of functional cosmetics.
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문제 정의
B16F10 cells을 α-MSH로 활성화 시킨 후 melanocyte에 nyasol을 처리함으로써 melanin 생성에 어떤 영향을 미치는지 알아보고자 하였다.
본 연구에서는 지모 추출물에서 medium pressure liquid chromatography (MPLC)와 연계한 활성유도 분획법(bioactivityguided fractionation)을 이용하여 항염 효과를 가지는 물질이 있음을 확인하였고 해당 활성 단일화합물을 분리하고 항염증, 피부 미백, 항아토피 효과 등의 약리적 미용 활성을 탐색하여 천연 기능성화장품 소재로서의 가능성을 검토하였다.
가설 설정
asphodeloides. (B) Effect of nyasol on cell viability and NO production in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages. RAW264.
제안 방법
10번 분획물을 농축하여 Forte로 C18 column (YMC ODS AQ)에 로딩 후 증류수와 MeOH의혼합 용매를 이동상으로 하여 MeOH 농도를 점차적으로 증가시키면서(50→100%, 40 min) column chromatography를 실시하였다.
TARC, MDC의 양은 human ELISA kit와 recombinant human IFN-γ, TNF-α (R&D Systems, USA)를 사용하여 SpectraMax M5 (Molecular Devises, USA)로 측정하였다. MPLC Puriflash 450(Interchim, France)과 high performance liquid chromatography (HPLC)급 methanol (MeOH) 용매(Honeywell, USA)를 사용하여 활성물질을 분리하였고, 분리한 활성물질의 분석과 구조분석은 Ultraperformance liquid chromatography-quadrupole time of flight-mass spectrometry (UPLC-QTOF-MS, Waters, USA), Bruker AM400 (1H-NMR at 400 MHz, 13C-NMR at 100MHz, Billerica, USA), acetonitrile (ACN) 용매(Honeywell, USA), methanol-d4(Cambridge Isotope Laboratories, USA)를 사용하였다.
MPLC 기반 NO 분획물 활성 검정. 지모 100% 에탄올 추출물의 세포 독성 측정 결과 세포독성이 나타나지 않아 이를 바탕으로 이전에 HPLC를 기반으로 하는 분획물의 활성이 검증 되었던 프로토콜을 참고(Rueda 등, 2014) 하여.
Nyasol이 LPS로 유도된 NO의 생성을 감소시킨 것이 nyasol의 세포독성으로 인한 것인지를 관찰하기 위하여, nyasol 을 3.125, 6.25, 12.5, 25 µg/mL의 농도로 처리하고 LDH assay 를 실시하여 cell viability를 측정하였다(Fig. 4B).
RAW264.7 cell을 LPS로 활성화시킨 후 nyasol이 NO의 생성에 미치는 효과를 관찰하기 위해 nyasol 을 3.125, 6.25, 12.5, 25 µg/mL의 농도로 처리한 다음 24시간 배양 후 NO 생성량을 측정하였다.
RAW264.7 cell을 LPS로 활성화시킨 후 지모 분획물이 NO의 생성에 미치는 효과를 관찰하기 위해 1–12번 분획물(100 µg/mL)에 LPS (1 µg/mL)를 처리한 다음 24시간 배양 후 NO 생성량을 측정하였다.
TARC, MDC의 양은 human ELISA kit와 recombinant human IFN-γ, TNF-α (R&D Systems, USA)를 사용하여 SpectraMax M5 (Molecular Devises, USA)로 측정하였다.
Tyrosinase 저해 활성 측정. Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등(1986)의 방법에 따라 측정하였다.
0 µg/mL)를 사용하였다. Tyrosinase 저해 활성도는 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 계산하였다.
UPLC 이동상의 용매조성은 0–1 min 10% B, 1–12 min 98% B, 12–13.4 min 98% B, 13.4–13.5 min 10% B, 13.5–15 min 10% B 조건을 이용하였다.
Xanthine oxidase 저해 활성 측정. Xanthine oxide 저해활성은 Stirpe와 Corte (1969)의 방법을 변형하여 측정하였다. 각 샘플용액 0.
1-12)을 얻었다. 각 분획물에 대하여 MPLC와 연계하여 활성유도 분획법(bioactivity-guided fractionation)을 통하여 생리활성물질을 분리하고자 하였다. 활성 분획물을 농축하여 Forte (YMC, Japan)에 C18 column (YMC ODS AQ, 250×20 mm, 10 µm, Japan)를 사용하여 증류수(A), MeOH (B)의 혼합 용매를 이동상으로 하는 0–5 min 50% (B), 5–35 min 100% (B), 35–40 min 100% (B) 조건으로 column chromatography를 실시하여 유효화합물 1종을 분리하였다.
배양배지를 완전히 제거하고 DMSO 200 µL를 가하여 침전물을 완전히 용해시킨 후, microplate reader를 사용하여 540 nm 흡광도를 측정하였다. 각 샘플 군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군에 흡광도 값과 비교하여 세포생장률을 평가하였다.
세포 독성을 평가하고자, lactate dehydrogenase (LDH) cytotoxicity assay kit를 이용하여 microplate reader 장비를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다 (Jeong 등, 2010). 각 샘플군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 측정하였다.
배양배지를 완전히 제거하고 DMSO 200 µL를가하여 침전물을 완전히 용해시킨 후, microplate reader를 사용하여 540 nm 흡광도를 측정하였다. 각 샘플군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포생장률을 측정하였다.
특히 10번 분획물은 가장 강한 활성을 나타냈지만 cell viability 측정 결과 세포독성이 나타났다. 그러나 MPLC 크로마토그램 결과 10번 분획물에 포함된 메인 화합물 농도가 매우 높아 독성이 나타난 것으로 생각되어 메인 화합물을 순수 분리한 후 독성이 없는 농도를 확인 후 NO 생성량을 측정하여 활성 화합물에 대한 활성실험을 하였다.
세포 독성 측정. 샘플이 세포의 성장에 미치는 영향을 측정하기 위하여 MTT 분석을 수행하였다. 대사가 왕성한 살아있는 세포는, 세포 내 mitochondria의 탈 수소 효소작용에 의하여 수용성의 노란색인 MTT tetrazoliumdm을 환원시켜 자주색을 띠는 비수용성 formazan을 형성한다.
이후 배양 배지를 3,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 세포 독성을 평가하고자, lactate dehydrogenase (LDH) cytotoxicity assay kit를 이용하여 microplate reader 장비를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다 (Jeong 등, 2010). 각 샘플군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 측정하였다.
얻은 추출물 6.8 g을 MPLC 기기에 5×25 cm에 Zeoprep C18, 45–60 mm를 충진한 칼럼관과 UV 검출기(254, 275 nm)를 사용하여 총 12개의 분획물(Fr. 1-12)을 얻었다.
음건한 지모 뿌리줄기 15 g을 잘게 분쇄하여 100% ethanol (EtOH, 1 L×3)을 가하여 실온에서 24시간 3회 반복 추출한 후 여과하였다.
0×105cells/mL로 24 well plate에 분주하고 18시간 배양 후, IFN-γ (10 ng/mL), TNF-α (10 ng/mL)과 분리된 화합물을 농도별로 넣은 후 24시간 배양하였다. 이후 세포 배양 배지를 원심 분리하여 얻어진 상층액의 chemonkines 합성량을 측정하였다. 모든 샘플은 정량 전까지 냉동보관 하였다.
지모 100% 에탄올 추출물의 활성 지표물질의 정성분석을 위해 UPLCQTOF-MS 분석은 BEH C18(2.1×100 mm, 1.7 µm) 칼럼관과 PDA 검출기를 장착한 UPLC에 유속 0.4 mL/min, 용매는 0.1% formic acid가 포함된 증류수(A)와 ACN (B)을 사용하여 수행 하였다.
지모 에탄올 추출물의 UPLC-QTOF MS 분석. 지모 100% 에탄올 추출물의 활성 지표물질의 정성분석을 위해 UPLCQTOF-MS 분석은 BEH C18(2.
DPPH radical 소거능 측정. 지모 추출물의 항산화 활성은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)을 사용하여 radical 소거능을 측정하였다(Blois, 1958). DPPH radical에 대한 각 샘플의 환원력을 측정하기 위해 MeOH에 각 샘플을 녹여 농도별로 희석한 희석액 800 µL와 MeOH에 녹인 0.
항 아토피 효능 평가를 위해 HaCaT cell을 각각 3.0×105, 2.0×105 cells/mL로 96 well plate에 분주하고 18시간 배양 후 샘플을 처리하고 24시간 배양하였다.
활성 분획물을 농축하여 Forte (YMC, Japan)에 C18 column (YMC ODS AQ, 250×20 mm, 10 µm, Japan)를 사용하여 증류수(A), MeOH (B)의 혼합 용매를 이동상으로 하는 0–5 min 50% (B), 5–35 min 100% (B), 35–40 min 100% (B) 조건으로 column chromatography를 실시하여 유효화합물 1종을 분리하였다.
대상 데이터
세포 배양. 마우스 대식세포인 RAW264.7 cell, 마우스 멜라노마 세포인 B16F10 cell, 사람 각질형 세포인 HaCaT cell을 각각 1% antibiotic과 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
실험 재료. 본 실험에 사용한 지모(A. asphodeloide)의 뿌리줄기는 2013년 제주도에서 구매한 것으로, (주) 콧데(http://www.cotde.co.kr/)에서 제공받아 사용하였다.
7 cell, B16F10 cell, HaCaT cell은 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank)으로부터 구입하였으며 세포배양을 위해 1% antibiotic, 10% fetal bovine serum (FBS), phosphate buffered saline (PBS), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)은 Gibco (USA)에서 구입하였다. 세포 독성과 활성 평가를 위해 non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega, USA)를 사용하였고, Lipopolysaccharide (LPS), 3-(4,5-dimethylthiaxo-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), ascorbic acid, dimethyl sulfoxide (DMSO), L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), tyrosinase, arbutin, kojic acid, xanthine, xanthine oxidase는 Sigma-Aldrich (USA)에서 구입하여 사용하였다. TARC, MDC의 양은 human ELISA kit와 recombinant human IFN-γ, TNF-α (R&D Systems, USA)를 사용하여 SpectraMax M5 (Molecular Devises, USA)로 측정하였다.
실험에 사용한 세포주인 RAW264.7 cell, B16F10 cell, HaCaT cell은 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank)으로부터 구입하였으며 세포배양을 위해 1% antibiotic, 10% fetal bovine serum (FBS), phosphate buffered saline (PBS), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)은 Gibco (USA)에서 구입하였다.
이론/모형
Tyrosinase 저해 활성 측정. Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등(1986)의 방법에 따라 측정하였다. B16F10 cells를 배양하여 24 well plate에 각 well 당 세포를 2.
모든 샘플은 정량 전까지 냉동보관 하였다. 염증성 chemokines는 human ELISA kit를 이용하여 측정하였다(Kang 등, 2013).
성능/효과
B16F10 cells에 nyasol을 1.5625, 3.125, 6.25, 12.5 µg/mL의 농도로 처리후 세포 내 melanin 양을 측정한 결과 농도 의존적으로 유의하게 melanin 생합성 저해하는 효과를 나타내었다(Fig. 5B).
Nyasol을 3.125, 6.25, 12.5 µg/mL의 농도로 처리 했을 때 농도 의존 적으로 유의하게 세포내 주요 효소인 tyrosinase 활성을 저해하는 것을 확인 할 수 있었다.
Nyasol을 6.25, 12.5, 25 µg/mL의 농도로 각각 처리 한 후 TARC, MDC 를 측정한 결과, 비록 농도 의존적인 결과는 아니지만 대조군에 비해 TARC 생성은 50% 억제되었다.
각 추출물을 15.63, 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1000 µg/mL의 농도로 처리 했을 때 모두 농도 의존적으로 DPPH radical이 소거되었으며, 100% 에탄올 추출물이 가장 높은 소거능을 나타내며, IC50 150.0 µg/mL를 가졌다.
각 추출물을 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1,000 µg/mL의 농도로 처리하였을 때 DPPH radical 소거능에 비해 농도 의존적이지 않고 뚜렷한 활성 차이가 나타나진 않지만 최저 농도인 31.25 µg/mL에서도 40% 수준의 저해활성을 나타내었다.
분리된 물질은 황색 오일로 광학회전은 # = –130º(c 0.50, MeOH)을 가지고 HRESIMS에서 분자이온 [M-H]−의 피크가 m/z = 251.1088, 분자식은 C17H16O2, λmax (MeOH) 257 nm의 흡광도를 나타내어 각각의 분광학적인 자료를 종합하면 이 화합물은 norlignan계열 화합물로 예상할 수 있었다.
실험 결과 nyasol은 100 µg/mL 이상의 농도에서는 독성을 나타내지만 25 µg/mL 이하에 서는 독성이 낮게 관찰되었다.
1088, 분자식은 C17H16O2, λmax (MeOH) 257 nm의 흡광도를 나타내어 각각의 분광학적인 자료를 종합하면 이 화합물은 norlignan계열 화합물로 예상할 수 있었다. 정확한 구조 확인을 위하여 NMR를 이용하여 구조분석을 실시하여 13C-NMR 스펙트럼에서는 17개의 carbon peak가 관찰되었으며, 1H-NMR 스펙트럼에서 전형적인 AABB 시스템[7.10 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.00 (2H, d, J = 8.4 Hz), 6.74 (2H, d, J = 8.4 Hz), 6.70 (2H, d, J = 8.4 Hz)]을 가지는 para 위치에 두 개의 hydroxyl기가 치환된 benzene링을 나타내었다. 상기 데이터를 종합한 결과 분리된 화합물은 (-)-nyasol임을 확인하였다(Bae, 2008).
지모 분획물(1–12번)의 NO 활성 검정 결과 1–4번 분획 물은 NO의 양을 억제하지 못하는 반면, 5–12번 분획물은 NO 생성량을 유의성 있게 억제하였다(Fig. 3).
처리하지 않은 대조군에 비해, IFN-γ와 TNF-α를 처리한 처리 군에서 TARC와 MDC의 양이 유의적으로 증가한 것으로 보아 IFN-γ 및 TNF-α 처리가 HaCaT cell의 염증을 효과적으로 유도하였음을 알 수 있었다.
추출물의 chromatogram에서 각각의 피크들의 HRESIMS 값을 확인한 결과 피크 1과 2는 각각 421.0799 [M-H]− , 421.0757 [M-H]− 로 확인되었으며 피크 3, 4, 5, 6, 7의 [M-H] − 는 각각 597.1211, 259.0602, 255.0685, 257.1205, 251.1088로 확인하였다.
5, 25 µg/mL의 농도로 처리한 다음 24시간 배양 후 NO 생성량을 측정하였다. 측정 결과 nyasol은 LPS로유도된 NO의 양을 유의성 있게 농도의존적으로 억제하였다(Fig. 4B). Nyasol이 LPS로 유도된 NO의 생성을 감소시킨 것이 nyasol의 세포독성으로 인한 것인지를 관찰하기 위하여, nyasol 을 3.
후속연구
하지만 MDC 생성은 억제되지 않았다. 이를 통해 nyasol이 염증 관련 chemokine인 TARC 생성을 억제시킴으로써 기능성식품 혹은 화장품으로서의 응용이 가능하리라 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
지모의 약리학적 작용은 무엇인가?
지모(Anemarrhena asphodeloide)는 백합과(Liliaceae)에 속하는 다년생 초본으로써 근경을 약재로 사용하며 한방에서는 해열, 당뇨, 소염, 진해, 거담 등의 목적으로 사용되고 있다. 보고된 약리학적 작용으로는 해열작용, 강심작용, 이뇨작용, 항균작용, 거담작용, 진정작용, 혈당강하작용, 항암작용이 있는 것으로 알려져 있다(Kim 등, 1999; Son 등, 1999). 지모의 주요 성분으로는 steroid saponin계열인 timosaponin A-I, A-III, B-II, anemarsaponin B, F-gitonin, smilageninoside, degalactotigonin 등(Kawasaki 등, 1963; Kawasaki와 Yamauchi, 1963; Niwa 등, 1988; Nahumo 등, 1991)과 xanthone 계열의 polyphenol 화합물들인 mangiferin, isomangiferin, neomangiferin 등이 보고 되어 있다(Morita 등, 1965; Sun 등, 1992).
timosaponin A-III는 어떤 효과가 있는가?
지모의 주요 성분으로는 steroid saponin계열인 timosaponin A-I, A-III, B-II, anemarsaponin B, F-gitonin, smilageninoside, degalactotigonin 등(Kawasaki 등, 1963; Kawasaki와 Yamauchi, 1963; Niwa 등, 1988; Nahumo 등, 1991)과 xanthone 계열의 polyphenol 화합물들인 mangiferin, isomangiferin, neomangiferin 등이 보고 되어 있다(Morita 등, 1965; Sun 등, 1992). 특히 timosaponin A-III는 혈당강하작용과 항암 활성(Nakashima 등, 1993; Kimura 등 1996), anemarsaponin B는 in vitro에서 PAF-induced rabbit platelet aggregation을 억제하는 효과가 있다고 보고 되어있다 (Dong과 Han, 1991).
지모의 주요 성분에는 무엇이 있는가?
보고된 약리학적 작용으로는 해열작용, 강심작용, 이뇨작용, 항균작용, 거담작용, 진정작용, 혈당강하작용, 항암작용이 있는 것으로 알려져 있다(Kim 등, 1999; Son 등, 1999). 지모의 주요 성분으로는 steroid saponin계열인 timosaponin A-I, A-III, B-II, anemarsaponin B, F-gitonin, smilageninoside, degalactotigonin 등(Kawasaki 등, 1963; Kawasaki와 Yamauchi, 1963; Niwa 등, 1988; Nahumo 등, 1991)과 xanthone 계열의 polyphenol 화합물들인 mangiferin, isomangiferin, neomangiferin 등이 보고 되어 있다(Morita 등, 1965; Sun 등, 1992). 특히 timosaponin A-III는 혈당강하작용과 항암 활성(Nakashima 등, 1993; Kimura 등 1996), anemarsaponin B는 in vitro에서 PAF-induced rabbit platelet aggregation을 억제하는 효과가 있다고 보고 되어있다 (Dong과 Han, 1991).
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