[논문]Fusarium oxysporum에 의한 콜라비 시들음병

최인영; 김주; 주호종; 박지현; 신현동

doi:10.5423/rpd.2015.21.1.027

Fusarium oxysporum에 의한 콜라비 시들음병
First Report of Fusarium Wilt Caused by Fusarium oxysporum on Kohlrabi in Korea 원문보기

Research in plant disease = 식물병연구, v.21 no.1, 2015년, pp.27 - 31

최인영 (전라북도농업기술원) , 김주 (전라북도농업기술원) , 주호종 (전북대학교 농생물학과) , 박지현 (고려대학교 환경생태공학과) , 신현동 (고려대학교 환경생태공학과)

초록
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2014년 봄 전라북도농업기술원 시험포장에서 콜라비 시들음병이 관찰되었다. 병징은 생육초기 건전주에 비해 생육이 더디고 신초부터 시들음 증상이 나타나기 시작하였으며, 오래된 잎은 마르고 뒤틀리다가 더 이상 생육을 하지 않고 고사하였다. 감자한천배지에서 윤문형 핑크빛-흰색으로 양모상으로 생육하였다. 대형분생포자는 길이가 짧고 낫모양-일자형으로 세포벽이 얇고 주로 3개의 격벽이 있었다. 소형분생포자는 균사로부터 짧은 monophialides 위에 많이 형성되었으며, 투명하고, 난형 내지 타원형, 격벽이 없거나 1개이며, 드물게 2개이며, 크기는 $4-11{\times}2.5-5{\mu}m$이었다. 균학적 특징, 병원성 검정, ITS rDNA, TEF 염기서열 비교분석 등의 결과를 바탕으로 이 병은 우리나라에서 지금까지 보고되지 않은 Fusarium oxysporum에 의한 콜라비 시들음병으로 명명하고자 한다.

Abstract ▼ AI-Helper

In April 2014, Fusarium wilt was found on kohlrabi seedlings in Iksan, Korea. Symptoms included wilting of foliage, drying and withering of older leaves, and stunting of the plants. The infected plants eventually died during growth. Colonies on potato dextrose agar were pinkish white, and felted with cottony and aerial mycelium. Macroconidia were falcate to almost straight, thin walled and usually 3-septate. Microconidia were usually formed abundantly in false-heads on short monophialides on the hyphae and were hyaline, smooth, oval to ellipsoidal, aseptate or medianly 1-septate, very occasionally 2-septate, slightly constricted at the septa, $4-11{\times}2.5-5{\mu}m$. On the basis of the morphological characteristics and phylogenetic analyses of molecular markers (internal transcribed spacer rDNA and translation elongation factor $1{\alpha}$), the fungus was identified as Fusarium oxysporum. Pathogenicity of a representative isolate was proved by artificial inoculation, fulfilling Koch's postulates. To our knowledge, this is the first report on the occurrence of Fusarium oxysporum on kohlrabi in Korea.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

5-5 μm이었다. 균학적 특징, 병원성 검정, ITS rDNA, TEF 염기서열 비교분석 등의 결과를 바탕으로 이 병은 우리나라에서 지금까지 보고되지 않은 Fusarium oxysporum에 의한 콜라비 시들음병으로 명명하고자 한다.
균학적 특성 및 DNA 염기서열을 분석한 결과 Fusarium oxysporum으로 동정되었으며, 콜라비 유묘에 인공접종하여 병원성을 확인하였다. 따라서 본 연구는 콜라비 시들음병의 병징, 균학적 특징, 병원성 검정 및 염기서열 분석결과를 보고하고자 한다.

가설 설정

A: Occurrence of Fusarium wilt (arrows) in a farm in April 2014. B: The stems and leaves were infected, devastating the whole plant. C: Macroconidia and microconidia.

제안 방법

병원균을 분리하기 위하여 발병포장에서 이병주를 채집하여 실험실에서 건전부와 이병부의 경계조직을 5×5 mm 크기로 잘라 1% NaOCl 용액에서 1분 동안 표면살균하고 멸균수로 2-3회 세척한 후 멸균된 여과지에서 물기를 제거한 다음 물한천배지에 치상하였다. 25℃ 항온기에서 3일간 암배양한 후에 균사체 선단부를 떼어내 감자한천배지(Difco, MD, USA)에 옮겼으며, 25℃ 항온기 내에서 7일간 배양하며 병원균의 균학적 특성을 조사하였다. 감염된 표본은 고려대학교 표본실(Korea University Herbarium, KUS)에 보존하였다.
형태적 특징을 기초로 한 병원균의 동정을 뒷받침하고자 염기서열 분석을 실시하였다. F. oxysporum 병원균(KACC47747)을 감자한천배지에서 1주일 동안 배양한 후 ribosomal DNA(rDNA)의 ITS 영역과 Fusarium 종의 동정에 널리 이용되는 translation elongation factor 1-alpha(TEF) 유전자의 염기서열을 분석하였다(Hsuan 등, 2011). Genomic DNA는 DNeasy Plant Mini kit(QIAGEN, Valencia, Canada)를 이용하여 분리하였고, ITS1/ITS4(White 등, 1990)와 EF-1/EF-2(Geiser 등, 2004) primer들을 가지고 PCR 반응을 이용하여 각각 증폭하였다.
oxysporum 병원균(KACC47747)을 감자한천배지에서 1주일 동안 배양한 후 ribosomal DNA(rDNA)의 ITS 영역과 Fusarium 종의 동정에 널리 이용되는 translation elongation factor 1-alpha(TEF) 유전자의 염기서열을 분석하였다(Hsuan 등, 2011). Genomic DNA는 DNeasy Plant Mini kit(QIAGEN, Valencia, Canada)를 이용하여 분리하였고, ITS1/ITS4(White 등, 1990)와 EF-1/EF-2(Geiser 등, 2004) primer들을 가지고 PCR 반응을 이용하여 각각 증폭하였다. 증폭시킨 PCR 산물은 1.
감염된 표본은 고려대학교 표본실(Korea University Herbarium, KUS)에 보존하였다. KUS-F27847로부터 대표 균주가 분리되었으며, 대표 균주는 농업유전자원정보센터(Korean Agricultural Culture Collection)에 기탁(기탁번호 KACC47747)하였으며, 병원성 검정 및 염기서열 분석에 사용하였다. 콜라비에 대한 병원성 검정은 아삭콜 품종으로 실시하였다.
php)의 데이터베이스를 이용하여 확인하였다. 계통수 분석은 GenBank 데이터베이스에 올라와 있는 ITS와 TEF의 염기서열들을 이용하였다.계통수는MEGA6.
병원균은 DIC(differential interference contrast) 광학현미경으로 200-1000배에서 형태적 특징을 관찰하였다. 배양적 특징은 KACC47747균주를 감자한천배지에 치상하여 25ºC에서 1주일 동안 배양하여 관찰하였다.
병원균을 분리하기 위하여 발병포장에서 이병주를 채집하여 실험실에서 건전부와 이병부의 경계조직을 5×5 mm 크기로 잘라 1% NaOCl 용액에서 1분 동안 표면살균하고 멸균수로 2-3회 세척한 후 멸균된 여과지에서 물기를 제거한 다음 물한천배지에 치상하였다.
병원균의 균학적 특징 및 염기서열 분석.
2014년 4월에 전라북도농업기술원의 노지 시험연구포장에 정식한 콜라비(품종 아삭콜)에서 처음으로 시들음병이 발생하였다. 이병주에서 병원균을 순수분리하여 균주를 확보하였다. 균학적 특성 및 DNA 염기서열을 분석한 결과 Fusarium oxysporum으로 동정되었으며, 콜라비 유묘에 인공접종하여 병원성을 확인하였다.
Genomic DNA는 DNeasy Plant Mini kit(QIAGEN, Valencia, Canada)를 이용하여 분리하였고, ITS1/ITS4(White 등, 1990)와 EF-1/EF-2(Geiser 등, 2004) primer들을 가지고 PCR 반응을 이용하여 각각 증폭하였다. 증폭시킨 PCR 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 band를 확인한 후, PCR purification kit(Core-oneTM, Core-bio, Korea)를 이용하여 정제하였다. 염기서열은 autosequencer(ABI 3030)로 분석하였으며, 최종 획득한 ITS와 TEF 의 염기서열들은 GenBank database(National Centre for Biotechnology Information [NCBI] US National Institute of Health Bethesda, http://blast.
KUS-F27847로부터 대표 균주가 분리되었으며, 대표 균주는 농업유전자원정보센터(Korean Agricultural Culture Collection)에 기탁(기탁번호 KACC47747)하였으며, 병원성 검정 및 염기서열 분석에 사용하였다. 콜라비에 대한 병원성 검정은 아삭콜 품종으로 실시하였다. 병원성 검정용 식물체는 종자를 파종하여 105공 트레이에 1달간 생육한 후 건전한 개체를 20주 선별하여 250 ml 삼각플라스크에 1주씩 넣고 스폰지로 고정하여 준비하였다.
형태적 특징을 기초로 한 병원균의 동정을 뒷받침하고자 염기서열 분석을 실시하였다. F.

대상 데이터

25℃ 항온기에서 3일간 암배양한 후에 균사체 선단부를 떼어내 감자한천배지(Difco, MD, USA)에 옮겼으며, 25℃ 항온기 내에서 7일간 배양하며 병원균의 균학적 특성을 조사하였다. 감염된 표본은 고려대학교 표본실(Korea University Herbarium, KUS)에 보존하였다. KUS-F27847로부터 대표 균주가 분리되었으며, 대표 균주는 농업유전자원정보센터(Korean Agricultural Culture Collection)에 기탁(기탁번호 KACC47747)하였으며, 병원성 검정 및 염기서열 분석에 사용하였다.
병징은 생육초기 건전주에 비해 생육이 더디고 신초부터 시들음 증상이 나타나기 시작하였으며, 오래된 잎은 마르고 뒤틀리다가 더 이상 생육을 하지 않고 고사하였다. 감자한천배지에서 윤문형 핑크빛-흰색으로 양모상으로 생육하였다. 대형분생포자는 길이가 짧고 낫모양-일자형으로 세포벽이 얇고 주로 3개의 격벽이 있었다.
배양적 특징은 KACC47747균주를 감자한천배지에 치상하여 25ºC에서 1주일 동안 배양하여 관찰하였다.
5% agarose gel에서 전기영동하여 band를 확인한 후, PCR purification kit(Core-oneTM, Core-bio, Korea)를 이용하여 정제하였다. 염기서열은 autosequencer(ABI 3030)로 분석하였으며, 최종 획득한 ITS와 TEF 의 염기서열들은 GenBank database(National Centre for Biotechnology Information [NCBI] US National Institute of Health Bethesda, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)와 FUSARIUM ID(http:// isolate.fusariumdb.org/blast.php)의 데이터베이스를 이용하여 확인하였다. 계통수 분석은 GenBank 데이터베이스에 올라와 있는 ITS와 TEF의 염기서열들을 이용하였다.
접종원은 KACC47747 균주를 감자한처배지에서 1주간 배양한 후 멸균수를 넣고 메스(scalpel)로 포자를 수거하여 거즈로 거른 다음 포자현탁액을 2.6×106 conidia/ml로 준비하였다.

이론/모형

계통수 분석은 GenBank 데이터베이스에 올라와 있는 ITS와 TEF의 염기서열들을 이용하였다.계통수는MEGA6.0프로그램을 이용하여 neighbor-joining방법으로 작성하였으며, sequence distance는 Tajima-Nei parameter model로 계산하였다(Saitou와 Nei, 1987; Tamura 등, 2013).

성능/효과

NCBI에서 BLAST search한 결과 Fusarium oxysporum 로 등록된 GenBank accession number GU445374, JX045827, KC196121와 >99% 일치하는 것으로 확인되었다.
oxysporum로 등록된 FD-00793, FD-00788 등과 100% 일치하였다. 계통수작성 결과 ITS(KM016924)와 TEF(KP692745)의 염기서열 모두 F. oxysporum과 같은 계통군에 속함을 확인할 수 있었다(Fig. 2, 3).
이병주에서 병원균을 순수분리하여 균주를 확보하였다. 균학적 특성 및 DNA 염기서열을 분석한 결과 Fusarium oxysporum으로 동정되었으며, 콜라비 유묘에 인공접종하여 병원성을 확인하였다. 따라서 본 연구는 콜라비 시들음병의 병징, 균학적 특징, 병원성 검정 및 염기서열 분석결과를 보고하고자 한다.
Fusarium oxysporum에 의한 콜라비 시들음병은 미국, 남아프리카, 포루투갈 등에서 보고되어 있으나(Farr와 Rossman, 2014) 우리나라에는 미기록종이다(The Korean Society of Plant Pathology, 2009). 따라서 이상의 연구결과인 균학적 특징, 병원성 검정, ITS rDNA, TEF 염기서열 비교분석 등의 결과를 바탕으로 이 병은 우리나라에서 지금까지 보고되지 않은 F. oxysporum E.F. Sm. & Swingle에 의한 ‘콜라비 시들음병’으로 명명하고자 한다.
접종 5-7일 후 포장에서와 같은 전형적인 시들음 증상이 나타나기 시작하여 9-10일 후에는 지제부가 갈변되기 시작하였으며, 발병포장에서와 동일한 병원균이 재분리되었다. 따라서 콜라비 시들음 증상에서 분리한 병원균은 병원성을 가진 균주로 판단되었으나 대조구에서는 병징이 나타나지 않았다.
oxysporum로 등록된 GenBank accession number JQ965444, JQ965439, JQ965438과 100% 일치하는 것으로 확인되었다. 또한 Fusarium ID 데이터베이스에서도 F. oxysporum로 등록된 FD-00793, FD-00788 등과 100% 일치하였다. 계통수작성 결과 ITS(KM016924)와 TEF(KP692745)의 염기서열 모두 F.
NCBI에서 BLAST search한 결과 Fusarium oxysporum 로 등록된 GenBank accession number GU445374, JX045827, KC196121와 >99% 일치하는 것으로 확인되었다. 또한 TEF sequence 크기는 710 bp로 GenBank 등록번호는 KP692745이었으며, NCBI에서 BLAST search 했을 때 F. oxysporum로 등록된 GenBank accession number JQ965444, JQ965439, JQ965438과 100% 일치하는 것으로 확인되었다. 또한 Fusarium ID 데이터베이스에서도 F.
1A, B). 지제부를 자르면 병원균에 감염된 도관부가 갈색으로 변색되어 있으며, 낮에는 시들고 밤에는 다소 회복되는 증상이 반복되었다. 그러나 박과작물에서처럼 지제부에서 끈적끈적한 진갈색 수액이 병든 조직으로부터 유출되지는 않았다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	콜라비에서 기록된 주요 병원균에는 무엇이 있는가?	전 세계적으로 콜라비에서 기록된 주요 병원균으로는 Plasmodiophora brassicae(clubroot, 혹병), Peronospora parasitica(downy mildew, 노균병), Erysiphe cruciferarum(powdery mildew, 흰가루병), Rhizoctonia solani(damping-off, 모잘록병), Alternaria brassicae(black spot, gray spot, 검은무늬병), Fusarium oxysporum(wilt, 시들음병) 등이 있다(Farr와 Rossma, 2015). 특히 시들음병은 수량 감소의 주요 원인인데, 유묘기에 지제부에서 모잘록병 또는 시들음 증상을 일으키므로 식물체는 전체적으로 황화되면서 말라 죽는다(Lee와 Park, 2001).
	콜라비란 무엇인가?	gongylodes L.)는 배추과 Brassica 속에 속하며, 양배추와 순무를 교배시킨 채소로서 순무양배추라고도 불린다. 수분과 비타민 C 함유량이 높아 비대한 줄기는 셀러드나 생색용으로, 잎은 쌈채소나 녹즙으로 이용된다(Lee 등, 2010).
	콜라비 시들음병의 원인균은 무엇인가?	이병주에서 병원균을 순수분리하여 균주를 확보하였다. 균학적 특성 및 DNA 염기서열을 분석한 결과 Fusarium oxysporum으로 동정되었으며, 콜라비 유묘에 인공접종하여 병원성을 확인하였다. 따라서 본 연구는 콜라비 시들음병의 병징, 균학적 특징, 병원성 검정 및 염기서열 분석결과를 보고하고자 한다.

참고문헌 (10)

Lee, J. W., Lee, D. Y., Cho, J. G., Back, N. I. and Lee, Y. H. 2010. Isolation and identification of sterol compounds from the red kohlrabi (Brassica oleracea var. gongylodes) sprouts. J. Appl. Biol. Chem. 53: 207-211. (In Korean)

원문보기 상세보기
Lee, Y. S. and Park, C. S. 2001. Fusarium species of Korea. National Institute of Agricultural Science and Technology Suwon, Korea. Plant Pathogens of Korea 5. pp. 91. (In Korean)
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Geiser, D. M., Jimenez-Gasco, M. D., Kang, S. C., Makalowska, I., Veeraraghavan, N., Ward, T. J., Zhang, N., Kuldau, G. A. and O'Donnell, K. 2004. FUSARIUM-ID v. 1.0: A DNA sequence database for identifying Fusarium. Eur. J. Plant Pathol. 110: 473-479.

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Hsuan, H. M., Salleh, B. and Zakaria, L. 2011. Molecular identification of Fusarium species in Gibberella fujikuroi species complex from rice, sugarcane and maize from peninsular Malaysia. Int. J. Mol. Sci. 12: 6722-6732.

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Nelson, P. E., Toussoun, T. A. and Marasas, W. F. O. 1983. Fusarium Species: An Illustrated Manual for Identification. Pennsylvania State Univ. Press, University Park.
Saitou, N. and Nei, M. 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4: 406-425.

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Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A. and Kumar, S. 2013. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Mol. Biol. Evol. 30: 2725-2729.

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The Korean Society of Plant Pathology. 2009. List of plant disease in Korea. 5th ed. Suwon, Korea. 853 pp. (In Korean)
White, T. J., Bruns, T., Lee. S. and Taylor, J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungi ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR protocols: A guide to Methods and Applications. eds. by M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninski, and T. J. White. Academic press, San Diego, California.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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